Nghiên cứu tách chiết và đánh giá hoạt tính sinh học quercetin từ một số loài thực vật ở việt nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --- Trần Thị Kiều Oanh NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA QUERCETIN TỪ MỘT SỐ LOÀI THỰC VẬT Ở VIỆT NAM

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Trần Thị Kiều Oanh

NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA QUERCETIN TỪ MỘT

SỐ LOÀI THỰC VẬT Ở VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2018

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Trần Thị Kiều Oanh

NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA QUERCETIN TỪ

MỘT SỐ LOÀI THỰC VẬT Ở VIỆT NAM

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Nguyễn Quang Huy

Hà Nội- 2018

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn trên, em đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu cả

về vật chất, tinh thần cũng như kiến thức chuyên môn, kinh nghiêm của các thầy cô,

gia đình, bạn bè Trước tiên, em xin gửi lời cảm ơn trân trọng nhất tới PGS TS

N u n Qu n Huy, người th y giúp đỡ em rất nhiều trong việc phát triển tư duy

khoa học, luôn tận tình chỉ bảo em về chuyên môn, kinh nghiệm làm việc cũng như động viên, giúp đỡ em rất nhiều trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu khoa học,thực hiện luận văn

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới c c thầy c gi o trong bộ môn Sinh lý thực vật v hóa sinh đã lu n quan tâm, động viên và tạo mọi điều kiện để em thực hiện tốt những thí nghiệm của mình

Trong suốt quá trình học em đã tiếp thu được các kiến thức chuyên sâu của các thầy cô thuộc khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã nhiệt tình giảng dạy

Tiếp đến, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới NCS Lê Huy Hoàng, người đã

lu n nhiệt tình, chỉ dẫn c c thao t c th nghiệm trong qu trình thực hiện đề tài

Em gửi lời cảm ơn tới ph ng Đ o tạo sau Đại học, trường Đại học Khoa học

Tự Nhiên đã tạo điều kiện v đ p ứng nhu cầu,nguyện vọng của em và hoàn thành chương trình học tập của khóa học

Cuối cùng xin gửi lời tới gia đình, bạn bè đã lu n động viên, cổ vũ v tạo môi trường tinh thần thuận lợi nhất trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu vừa qua

i th ng 5 năm 2018

Học viên cao học

Trần Thị Kiều Oanh

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

DANH MỤC BẢNG viii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ix

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan về flavonoid 3

1.1.1 Giới thiệu chung về flavonoid 3

1.1.2 Sinh tổng hợp flavonoids 3

1.1.3 Các dạng khác nhau của flavonoid 5

1.2 Quercetin và một số tính chất đặc trưng 7

1.2.1 Định danh v đặc tính của quercetin 7

1.2.2 Đặc tính chống oxi hóa của Quercetin 8

1.2.3 Một số tác dụng của Quercetin 10

1.3 C c phương ph p t ch chiết hợp chất 14

1.3.1 Khái quát về phương ph p t ch chiết 14

1.3.2 C c phương ph p t ch chiết 15

1.4 Giới thiệu một số thực vật nghiên cứu 17

1.4.1 Rau má 17

1.4.2 Cây đinh lăng 18

1.4.3 Hoa hòe 18

1.4.4 Rau đắng biển 19

1.5.5 Bụp giấm 19

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Nguyên liệu 20

2.2 Hóa chất 20

2.3 Thiết bị thí nghiệm 21

2.4 Phương ph p nghiên cứu 21

2.4.1 Phương ph p định tính các nhóm chất của loài thực vật bằng phản ứng màu 21

2.4.2 Phương ph p chiết xuất hỗ trợ siêu âm thu dịch chiết dùng cho phân tích HPLC, TLC và hoạt tính sinh học 25

2.4.3 Phương ph p thủy phân mẫu dịch chiết trong HCL 25

2.4.4 Phương ph p sắc ký bản mỏng trong phân t ch định tính dịch thủy phân 25

2.4.5 Xây dựng phương ph p phân t ch HPLC 26

2.4.6 Phương ph p thử hoạt tính thu dọn gốc tự do DPPH 27

2.4.7 Phương ph p x c định tổng năng lực khử 28

2.4.7 Phương ph p xử lý số liệu 28

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30

3.1 X c định các nhóm hợp chất thứ sinh có trong các mẫu 30

3.2 Kết quả phân tích TLC của các dịch chiết trước và sau khi thủy phân 33

3.3 Kết quả khảo s t DPPH v năng lực khử của các dịch chiết thực vật 34

3.3.1 Hoạt tính DPPH 34

3.3.2 Khảo sát khả năng lực khử của các mẫu thực vật 35

3.3.3 Khảo s t điều kiện phân tích HPLC trên mẫu dược liệu chuẩn hoa hòe 35

3.3.4 Đ nh gi độ ổn định của phương ph p HPLC được thiết lập 40

3.3.5 X c định quercetin trong dịch chiết mẫu thực vật trước và sau thủy phân 42

KẾT LUẬN 46

KIẾN NGHỊ 46

TÀI LIỆU THAM KHẢO 47

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Con đường sinh tổng hợp Flavonoids và Quercetin ở A thaliana 4

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của hợp chất nhóm flavonols (quercetin, kaempferol, myricetin và isorhamnetin) 5

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của nhóm flavones (luteolin, apigenin) 5

Hình 1.4 Cấu trúc hóa học nhóm flavanones (eridictyol, hesperetin, naringenin) 6

Hình 1.5 Cấu trúc nhóm flavan-3-ols (catechins và epicatechins 6

Hình 1.6 Cấu trúc hóa học nhóm theaflavins 6

Hình 1.7 Cấu trúc hóa học nhóm anthocyanidins (cyanidin, delphinidin, malvidin, pelargonidin, peonidin và petunidin) 7

Hình 1.8 Cấu trúc hóa học của quercetin 7

Hình 1.9 M tả qu trình loại gốc oxi hóa (R) bởi Flavonoids 9

Hình 1.10 Các vị trí thực hiện liên kết với gốc oxi hóa tự do tại vòng A, B 9

Hình 2.1 Quy trình thủy phân mẫu cho nghiên cứu TLC và HPLC 26

Hình 3.1 Kết quả đ p ứng tín hiệu khi rửa giải theo hệ 1 37

Hình 3.2 Khảo sát thời gian lưu v độ phân giải theo các hệ pha động khác nhau 38

Hình 3.3 Sắc ký đồ mẫu thử (hoa hòe) tại λ = 370nm rửa giải theo hệ pha động táchđược lựa chọn (3a-hệ 4) v kh ng t ch được (3b-hệ 5) 39

Hình 3.4 Kết quả khảo sát thể tích tiêm mẫu mẫu chuẩn quercetin (4a) và mẫu thử dịch chiết hoa hòe (4b) 39

Hình 3.5 Ảnh 3D quét phổ ở 4 bước sóng trong điều kiện có chuẩn quercetin 41

Hình 3.6 Thông số sắc ký qua 5 lần thí nghiệm 42

Hình 3.7 Thời gian lưu của đỉnh quercetin chuẩn khi thay đổi áp suất đầu cột từ mức 35 bar lên mức khoảng 59-60 bar 43

Hình 3.8 Kết quả chạy mẫu bụp giấm trước thủy phân 43

Hình 3.9 Kết quả chạy mẫu đinh lăng trước thủy phân 43

Hình 3.10 Kết quả chạy mẫu hoa hòe trước thủy phân 44

Hình 3.11 Kết quả chạy mẫu rau đắng biển trước thủy phân 44

Hình 3.12 Kết quả chạy mẫu rau má trước thủy phân 44

Hình 3.13 Kết quả chạy HPLC mẫu quercetin chuẩn 44

Hình 3.14 Kết quả chạy HPLC mẫu quercetin chuẩn 45 Hình 3.15 Kết quả chạy HPLC mẫu hoa hòe thủy phân 45 Hình 3.16 Sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện t ch đỉnh quercetin 45

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Định danh v đặc tính của Quercetin 8

Bảng 1.2 So s nh c c phương ph p tiền tách chiết 16

Bảng 1.3 So s nh c c phương ph p t ch chiết truyền thống 17

Bảng 1.4 So s nh c c phương ph p t ch chiết hiện đại 18

Bảng 3.1 Kết quả định tính các nhóm chất trong hoa hòe 31

Bảng 3.2 Kết quả định tính các nhóm chất trong lo i rau đắng 32

Bảng 3.3 Kết quả định tính các nhóm chất trong loài bụp giấm 32

Bảng 3.4 Kết quả định tính các nhóm chất trong loài rau má 33

Bảng 3.5 Kết quả định tính các nhóm chất trong lo i đinh lăng 33

Bảng 3.6 Định tính quercetin ở dịch chiết MeOH trước và sau thủy phân bằng HCL .34

Bảng 3.7 Đ nh gi khả năng DPPH của dịch chiết các mẫu 35

Bảng 3.8 Khả năng lực khử của các mẫu thí nghiệm 36

Bảng 3.9 Độ ổn định của hệ thống sắc ký đối với dịch chiết hoa hòe 42

UAE Kỹ thuật chiết bằng sóng siêu âm

MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây, việc nghiên cứu những hợp chất tự nhiên (bao gồm tìm kiếm, tách chiết, đ nh gi hoạt t nh) đang ph t triển mạnh mẽ, đặc biệt ở Việt Nam nơi có hệ động thực vật đa dạng, phong phú và có nhiều loại cây cỏ tác dụng sinh dược mạnh

Hiện nay trên thế giới cũng như ở Việt Nam, đối tượng trong các hợp chất tự nhiên thực vật được quan tâm nhiều tập trung ở nhóm hợp chất flavonoid vì số lượng các chất nhiều, tác dụng của các hợp chất không chỉ là chữa bệnh mà còn phòng bệnh Quercetin là một flavonoid thực vật có mặt trong nhiều loài, có hoạt tính chống oxy hóa mạnh, ngay cả ở nồng độ thấp Trong tự nhiên, quercetin tồn tại ở dạng tự do (dạng aglycon) hoặc dẫn xuất cho một số flavonoid kh c, thường gặp là rutin Hiện nay, quercetin được sử dụng trong nhiều lĩnh vực kh c nhau như thực phẩm chức năng, thuốc điều trị

Quercetin tồn tại với h m lượng lớn trong thực vật do cơ chế th ch nghi, được hình thành trong quá trình chuyển hóa thứ sinh trong cơ thể thực vật Quercetin tồn tại với h m lượng cao trong các loại chè, táo, hành tây Quercetin có mặt trong nhiều loại thực vật khác nhau, nhưng trong c ng nghiệp dược phẩm chủ yếu được thu nhận nhờ quá trình thủy phân từ rutin (quercetin-3-O-rutinosid) Tại Việt Nam và một số nước châu Á như Nhật Bản, Trung Quốc, Ấn độ quercetin được thu nhận chủ yếu từ

rutin của hoa cây hòe (Sophora japonica L)

Tuy nhiên,các loại thực vật kh c cũng được biết đến có nhiều flavonoid nói chung và quercetin nói riêng tồn tại ở nhiều dạng liên hợp, có mặt trong một số bài thuốc dân gian lại chưa được đề cập nghiên cứu Khi thu nhận quercetin aglycol (quercetin tự do) ở nhóm thực vật này, nếu tiến hành theo cách tinh chế từng dạng quercetin liên hợp v sau đó thủy phân các dạng liên hợp đã tinh chế đó, theo cách như thu nhận quercetin tự do từ rutin thì sẽ gặp nhiều khó khăn

Vì vậy, vấn đề đặt ra hiện nay là cần nghiên cứu điều kiện chiết xuất, thủy phân

để thu nhận quercetinanglycol trực tiếp từ thực vật, kh ng qua giai đoạn trung gian nhờ vào dạng quercetin liênhợp Để giải quyết được vấn đề này thì cần phải nghiên

cứu c c phương ph p đ nh giá nhằm x c định quercetin ở dạng tự do và liên hợp, cũng như độ ổn định của quercetin về hóa lý và sinh học trong quá trình thu nhận

Để góp phần đ p ứng nhu cầu thực tế đó, chúng t i thực hiện đề t i “Nghiên cứu tách chiết v đ nh gi hoạt tính sinh học của quercetin từ một số loài thực vật ở Việt Nam”với mục tiêu:

- X c địnhmột số đặc tính hóa lý và sinh học của dịch chiết methanol chứa quercetin từ một số loài thực vật tại Việt Nam

- Xác định các thông số sắc ký phù hợp cho phân tách quercetin trong dịch methanol từ hoa hòe trên cột sắc ký và hệ thống HPLC

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về flavonoid

1.1.1 Giới thiệu chung về flavonoid

Hợp chất flavonoid là nhóm các sắc tố m u đỏ, xanh da trời và tím ở thực vật

Từ mô tả đầu tiên về các hiệu ứng axit v bazơ trên c c sắc tố thực vật của Robert Boyle năm 1664 đến sự hình thành các gen cấu trúc v điều tiết hình thành các hợp chất flavonoid vào cuối thế kỷ 20, hiện nay đã thu thập được rất nhiều thông tin về cấu trúc, hoạt động hóa học và sinh tổng hợp những hợp chất này

Flavonoid là nhóm các phân tử có cấu trúc hợp chất v ng thơm, đa dạng và

có nguồn gốc từ axit amin Phenilalanin và malonyl-coenzyme A (CoA; thông qua con đường chuyển hóa axit béo) Các hợp chất flavomoid bao gồm 6 phân nhóm chính được tìm thấy trong hầu hết các thực vật bậc cao Các nhóm này gồm các chalcones, flavon, flavonol, flavandiols, anthocyanin, và tannin (hoặc pro anthocyanidins); nhóm thứ bảy là aurones khá hiếm gặp trong tự nhiên [7,19]

Hơn 6000 loại flavonoid kh c nhau đã được x c định và số lượng phát hiện mới hiện vẫn đang tăng lên C c flavonoid kh c nhau có chức năng sinh học đa dạng, bao gồm bảo vệ chống lại tia cực tím (UV) và tác nhân gây bệnh thực vật, tín hiệu trong quá trình sần, vận chuyển auxin, cũng như m u sắc của hoa như một tín hiệu thu hút côn trùng thụ phấn [43,60,65 ]

Hợp chất Flavonoidgiúp cho việc hiển thị màu sắc mùa thu (chuyển màu lá) ở nhiều loài thực vật, có thể bảo vệ tế bào lá khỏi tổn thương, nâng cao hiệu quả thu hồi chất dinh dưỡng trong quá trình lão hóa Flavonol có lẽ là chất flavonoid quan trọng nhất tham gia vào phản ứng stress; chúng là những flavonoid có hoạt t nh được biết đến từ trước, phổ biến và có tác dụng tới hoạt động sinh lý mạnh [59,65,66]

4

trúc v điều tiết [60,65] Gần đây, cây Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) được

nghiên cứu và phân tích sự điều chỉnh và việc chuyển hóa của con đường flavonoid ở thực vật Việc sử dụng Arabidopsis để nghiên cứu sinh tổng hợp flavonoid có ưu điểm

l c c gen sao chép đơn mã hóa tất cả các enzyme chuyển hóa flavonoid trung tâm, ngoại trừ flavonol synthase (FLS), được mã hóa bởi 6 gen, nhưng chỉ có 2 gen (FLS1

và FLS3) có hoạt động đã được chứng minh locus di truyền cho cả hai gen cấu trúc và điều hòa được x c định chủ yếu dựa trên đột biến xóa bỏ hoặc giảm sắc tố hạt; do đó loci được đặt tên là testa trong suốt hoặc đột biến Hầu hết các gen cấu trúc, cũng như

một số gen điều h a có tương quan với locus đột biến cụ thể trong cây Arabidopsis

Loài này dường như kh ng sử dụng flavonoid theo c ch tương tự như một số loài khác tuy nhiên, những đột biến này có ích trong việc x c định vai trò của các hợp chất

n y trong c c qu trình như bảo vệ tia cực tím và vận chuyển auxin [14,63,65]

Hình 1.1 Con đường sinh tổng hợp Flavonoids và Quercetin ở A thaliana [65]

Chú thích: Enzymes và các chất trung gian được biểu diễn bằng chữ m u đen, c c

chất điều hoà có màu Sàn phẩm cuối cùng là chữ in hoa CHS, Chalcone synthase; CHI, chalcone isomerase; F3H Flavanone 3 hydroxylase; F3'H, flavonoid-3'-hydroxylase; DFR, dihydroflavonol 4-reductase; FNR, flavanone-4-reductase; ANS, anthocyanidin synthase, UFGT, UDP-glucose flavonoid 3-O glycosyltransferase, FLS, flavonol synthase

C c flavonoid được tổng hợp qua đường phenylpropanoid, biến phenylalanine thành 4-coumaroyl-CoA, cuối cùng đi v o con đường sinh tổng hợp flavonoid (Hình 1.1) Enzyme đầu tiên đặc hiệu cho con đường flavonoid là chalcone

Falcone Ferreyra et al Flavonoids in plants

P1

dihydrokaempferol DFR leucopelargonin ANS pelargonin

PELARGONIN 3-GLUCOSIDE

UFGT C1/PL R/B

C1/PL R/B

P1 C1/PL R/B

C1/PL R/B

dihydroquercetin DFR leucocyanidin ANS cyanidin UFGT

CYANIDIN 3-GLUCOSIDE

FLS QUERCETIN

P1 C1/PL R/B

P1 C1/PL R/B

C1/PL R/B

P1 C1/PL R/B

P1 C1/PL R/B

P1 C1/PL R/B

F3H

4-coumaroyl CoA + 3 malonyl CoA

CHS naringenin chalcone

CHI naringenin

FLAVONOL PHLOBAPHENES

ANTHOCYANINS

C1/PL R/B

eriodictyol F3’H

P1 C1/PL R/B

C1/PL R/B

F3H

R/B

P1 C1/PL R/B

dihydrokaempferol DFR leucopelargonin ANS pelargonin

PELARGONIN 3-GLUCOSIDE

UFGT

LAR polym

erization

polym erization

flavan-3-ol

flavan-3-ol

KAEMPFEROL

F3’H dihydroquercetin

ANR

DFR leucocyanidin ANS cyanidin UFGT

CYANIDIN 3-GLUCOSIDE

PAP1/PAP2 TT8/GL3/EGL3 TTG1

TT2/TT8/TTG1 TT2/TT8/TTG1

F3H

4-coumaroyl CoA + 3 malonyl CoA

CHS naringenin chalcone

CHI naringenin

FLAVONOLS

PROANTHOCYANIDINS

ANTHOCYANINS

PAP1/PAP2 TT8/GL3/EGL3 TTG1 PAP1/PAP2 TT8/GL3/EGL3 TTG1

FIGURE 2 | Regulation of theflavonoid pathway in Arabidopsisthaliana (A)

and maize (B) Enzymes and intermediates are indicated in black and different

regulators are indicated in color End products are identified in capital letters.

Dotted arrow s indicate multiple steps CHS, Chalcone synthase; CHI, chalcone

isomerase; F3H, flavanone 3-hydroxylase; F3 ′ H, flavonoid-3 ′ -hydroxylase; DFR, dihydroflavonol 4-reductase; FNR, flavanone 4-reductase; ANS, anthocyanidin synthase; UFGT, UDP-glucose flavonoid 3-O glucosyltransferase; FLS, flavonol synthase; LAR, leucoanthocyanidin reductase; ANR, anthocyanidin reductase.

cytoplasm and the tonoplast, can bind to glycosylated

antho-cyanins and aglycones but does not conjugate these compounds

trans-port model proposed is based on observations that anthocyanins

et al., 2010 ) Nevertheless, grape vesicle-mediated transport of anthocyanins involves a GST and two multidrug and toxic com- pound extrusion-type transporters (anthoMATEs) Thus, these observations point out to the coexistence of both mechanisms of transports, in which the participation of GSTs and transporters

synthase xúc tác cho phản ứng tạo ra các chalcone mà từ đó tất cả c c flavonoid được tổng hợp [65]

Con đường trung tâm cho sinh tổng hợp flavonoid được bảo tồn trong thực vật, tùy thuộc vào loài một nhóm c c enzym như isomerases, reductases, hydroxy-lases, và một số dioxygenases phụ thuộc Fe2+ Hợp chất 2-oxyglutarate phụ thuộc vào bộ xương flavonoid cơ bản, dẫn đến các phân lớp flavonoid khác nhau Cuối cùng, tranferases thay đổi xương sống flavonoid với đường, nhóm methyl hoặc acyl moieties, điều chỉnh hoạt động sinh lý của flavonoid kết quả bằng c ch thay đổi độ hòa tan, phản ứng v tương t c với các mục tiêu tế bào [67]

1.1.3 Các dạng khác nhau của flavonoid

Quercetin là một flavonoid phân bố rộng rãi trong tự nhiên Tên n y đã được

sử dụng từ năm 1857 v có nguồn gốc từ quercetum (rừng sồi), sau là Quercus Quercetin là chất ức chế vận chuyển auxin có tự nhiên[49] Quercetin là một trong những chất flavonoid được sử dụng nhiều[16,17] với mức tiêu thụ trung bình hàng ngày khoảng 25-50 miligam/người

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của hợp chất nhóm flavonols (quercetin, kaempferol,

myricetin và isorhamnetin) [40]

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của nhóm flavones (luteolin, apigenin) [40]

Hình 1.4 Cấu trúc hóa học nhóm flavanones (eridictyol, hesperetin, naringenin) [40]

Hình 1.5 Cấu trúc nhóm flavan-3-ols (catechins và epicatechins) [40]

Hình 1.6 Cấu trúc hóa học nhóm theaflavins [40]

Hình 1.7 Cấu trúc hóa học nhóm anthocyanidins [40]

Các nguồn khác của quercetin có thể l nho, dâu đen, v dầu liu Đồ uống như tr xanh v rượu vang đỏ (4-16mg/l) cũng chứa một lượng đ ng kể các quercetin Lợi ích chính của quercetin là loại flavonoid này có chất chống oxy hóa mạnh, hỗ trợ chống lại các tế bào gốc tự do [21,35]

1.2 Quercetin và một số tính chất đặc trưn

Quercetin, một đại diện lớn của lớp flavonol, chất đã trở th nh đối tượng nghiên cứu nhận được sự chú ý đ ng kể Quercetin và dẫn xuất của nó trong thực phẩm chứa liên kết đường, đại diện cho 60-75% lượng flavonoid trong rau củ, quả [10,31]

Quercetin là một trong những chất có màu vàng tự nhiên Nó được phát hiện

đầu tiên ở dạng aglycon của quercetrin có trong vỏ cây Querceus tinctorial khi thuỷ

phân trong m i trường axit thu được quercetin và một phân tử đường rhamonose:

C21H20O11 + H2O (thuỷ phân trong HCl)  C15H10O7 + CH3(CHOH)4CHO

1.2.1 Định d nh và đặc tính của quercetin

Hình 1.8 Cấu trúc hóa học của quercetin[47]

Một phân tử quercetin (hình 1.8) có cấu trúc của năm nhóm hydroxyl, số lượng

c c nhóm n y đóng vai tr quan trọng trong việc x c định hoạt động sinh học của các dẫn xuất quercetin

1 2 2 Đặc tính chống oxi hóa của Quercetin

Các chất chống oxi hóa đƣợc nghiên cứu, sử dụng đƣợc hiểu theo nhiều nghĩa khác nhau tùy theo hoạt động oxy hóa của nó Halliwell v Gutteridge định nghĩa của chất oxi hóa là bất kỳ chất nào giảm thiểu, ngăn chặn hoặc loại bỏ gốc oxi hóa tự do gây hại cho phân tử mục tiêu Với định nghĩa n y t c dụng sinh lý của các hợp chất chống oxi hóa l để ngăn chặn những thiệt hại cho thành phần tế bào do những hệ quả của phản ứng hóa học liên quan đến gốc tự do Quá trình nhặt c c “r c” gốc oxi hóa

tự do của các chất thuộc nhóm Flavonoids đƣợc trình bày hình 1.9

Hình 1.9 Mô tả quá trình nhặt gốc oxi hóa (R) bởi Flavonoids [46]

Các chất chống oxi hóa invintro hoạt động phụ thuộc vào cách bố trí các nhóm chức năng trên cấu trúc lõi của nó Cả hai cấu hình và tổng số lượng của nhóm hydroxyl (-OH) ảnh hưởng đ ng kể tới cơ chế hoạt động chống oxy hóa

Các cấu hình vòng B hydroxyl là yếu tố quyết định tới hoạt động chống gốc oxy hóa Trong hình 1.9 mô tả hoạt động tách H+ (nhóm –OH) của chất chống oxi hóa và gốc oxi hóa R. làm chúng mất khả năng t c động xấu tới tế b o đ ch, c c gốc

tự do dạng Fl-O có thể phản ứng tương tự Kết quả của quá trình là tạo ra cấu trúc Quinine ổn định [46] Hoạt động chống oxi hóa invitro có thể được tăng lên bằng phản ứng trùng hợp c c flavonoid l m tăng số lượng nhóm hydroxyl trong phân tử qua đó hoạt động chống gốc oxi hóa được tăng lên

Hình 1.10.Các vị trí thực hiện liên kết với gốc oxi hóa tự do tại vòng A, B [46]

Quercetin là chất chống oxi hóa mạnh dựa vào khả năng t ch c c gốc tự do và liên kết với các ion kim loại chuyển tiếp Khả năng chống oxi hóa đó trước hết liên quan đến sự tồn tại của 2 loại nhóm liên kết chống oxi hóa bên trong phân tử có hình dạng thích hợp cho việc tách các gốc tự do: nhóm catechol trong vòng B và nhóm OH trong vòng A (hình 1.10) [46]

Theo tính toán của các nhóm nghiên cứu trong lớp flavonoid, quercetin là chất tách ROS hữu hiệu nhất, kể cả với việc tách O2 và gốc ONOO- Với khả năng n y,

quercetin là chất ức chế sự peoxi hóa lipid Quercetin gây trở ngại sự peoxi hóa lipid bằng cách phản ứng với các gốc tự do tạo ra do sự peoxi hóa lipid Thêm v o đó, ngoài khả năng ngăn chặn sự phát triển của sự peoxi hóa lipid, quercetin còn làm gia tăng lượng glutathione góp phần giảm thiểu sự hình thành các gốc tự do Sự oxi hóa lipid này có thể gây ra những t c động có hại cho cơ thể như gây ra bệnh tim mạch, thoái hóa thần kinh và ứng dụng trị liệu[46]

Chính do khả năng phản ứng với các gốc tự do, quercetin làm giảm các bệnh mãn tính [56] Đặc biệt, bằng việc ngăn ngừa ion Ca+ (trong các tế bào chết) quercetin

có khả năng bảo vệ tế bào khỏi sự oxi hóa, các gốc tự do dẫn đến lão hóa tế bào Begum và Terao nghiên cứu cho thấy quercetin aglycone và phức hợp các chất chuyển hóa của nó (quercetin-3-O D-glucuronide và quercetin-3-O D-glucoside) có thể bảo

vệ hồng cầu khỏi sự phá hủy ở những người hút thuốc.Nghiên cứu của McAnulty và cộng sự trên 40 vận động viên chạy điền kinh [35] cho thấy quercetin có khả năng giảm thiểu căng thẳng cho các vận động viên

Nghiên cứu về đặc tính chống oxi hóa của Quercetin đã có những nghiên cứu

so sánh với các chất chống oxi hóa đã được biết tới như vitamin C, vitamin E, c c chất cùng thuộc nhóm flavonoid kh c,…Đặc biệt khả năng oxi hóa của quercetin được tăng lên mạnh mẽ khi cùng tác dụng với vitamin C và axit uric [19]

1.2.3 Một số tác dụng khác của Quercetin đối với cơ thể

Quercetin là thành phần flavonoid có tác dụng tăng cường sức chịu đựng, tăng sức bền, chống mệt mỏi; tăng qu trình h hấp tế b o, tăng chức năng của thần kinh

và trí nhớ, có tác dụng chống oxi hóa, tăng hấp thu…

Tác dụng chống lão hóa

Quá trình sinh học liên quan đến lão hóa có thể được khắc phục chủ động bởi một số yêu tố m i trường, ví dụ như chất chống oxi hóa tự nhiên (như vitamin E, tỏi…) Th ng qua c c thuộc tính chống oxi hóa của quercetin và mối liên hệ giữa tuổi tác và sự stress oxi hóa Vai trò của quercetin là hình thành ảnh hưởng tích cực lên khả năng tồn tại, phát triển độc lập, v v ng đời của các nguyên bào sợi nguyên thủy của người (HFL-1); hơn nữa, khi các tế b o lão hóa được nuôi trong sự có mặt của quercetin, quan s t được sự trẻ hóa [19]

Chống dị ứng

Quercetin là hợp chất tự nhiên có khả năng t c động các chất liên quan đến các loại dị ứng và hoạt động như một chất ức chế tiết dưỡng bào, dẫn đến sự giảm tiết ra tryptase, các protein tín hiệu do đại thực bào gây ra: MCP-1 và IL-6 và sự điều chỉnh giảm histidine decarboxylase (HDC) mRNA từ một số ít dòng tế b o dưỡng bào [55]

Cũng như c c hợp chất polyphenol, flavonoids khác có tác dụng chống viêm và kháng khuẩn và thể hiện hoạt động chống dị ứng, quercetin cũng thể hiện như một loại thuốc chống dị ứng tiềm năng Hiện tại, tổ chức nghiên cứu dị ứng thực phẩm (Food Allergy Herbal Formula -FAHF) đ nh gi quercetin có tiềm năng tương tựchất chống

dị ứng an toàn nhưng cần có nhiều những nghiên cứu tác dụng phụ hơn để trở thành thuốc chống dị ứng thực sự [13]

Khả năn bảo vệ hệ tuần hoàn

Quercetin cũng được đặc biệt chú ý như một hợp chất có tác dụng giúp điều trị cũng như ph ng ngừa các bệnh về tim Trong thực tế, việc sử dụng quercetin có liên quan sự giảm tỉ lệ chết do bệnh tim và giảm tỉ lệ đột quỵ Pashevin [41] báo cáo số liệu mới về đặc tính bảo vệ tim mạch của quercetin trong nghiên cứu chỉ ra, thử nghiệm trên thỏ sau một thực đơn gi u cholesterol, sau đó cho thỏ uống trong vòng 1 tháng Corvitn (dạng h a tan trong nước dẫn xuất Quercetin) thấy giảm đ ng kể mọi loại hoạt động thủy phân protein của phức hệ proteasome trong các mô và bạch cầu lưu th ng trong hệ mạch Hoạt động của quercetin cũng được biết với vai trò giảm xơ vữa động mạch [41] Những nghiên cứu gần đây trên động vật v người huyết áp cao cho thấy có sự giảm huyết áp sau khi bổ sung quercetin trong thực phẩm chức năng

Chống viêm, un thư

Các nghiên cứu về khả năng chống ung thư của quercetin đã khẳng định quercetin ức chếcác tế b o tăng sinh đó ch nh l khả năng oxi hóa cũng như ức chế kinase trong chu trình tế bào và gây ra apoptosis [19].Trước đến nay, quercetin luôn được biết đến với khả năng ức chế in vitro sự sản xuất c c enzymes đ p ứng phản ứng viêm (ví dụ như: cyclooxygenase COX hay lipoxygenasse [27]), khả năng n y cũng được thực hiện bằng các phản ứng in vivo Trong các nghiên cứu gần đây [69]đã chứng tỏ quercetin có khả năng ức chế mạnh các yếu tố tăng sinh nguyên b o [19]

N ăn n ừa béo phì

Quercetin là loại flavonoid phong phú nhất, chúng có khả năng chống lại nhiều loại bệnh liên quan đến stress oxi hóa stress

Để x c định c c cơ chế phân tử ảnh hưởng bởi quercetin v o t c động sinh lý tăng lipid m u, một số nghiên cứu nhận thấy rằng quercetin quy định về biểu hiện gen

ở gan liên quan đến quá trình chuyển hóa lipid [24] Cụ thể, bổ sung quercetin ở chuột giảm đ ng kể bệnh béo phì cảm ứng bởi chế độ ăn uống nhiều chất béo, giảm trọng lượng cơ thể, gan và mô mỡ trắng hơn so với những con chuột được cho ăn chỉ với thực đơn gi u chất béo Các chuột thí nghiệm cũng giảm đ ng kể sự tăng cholesterol, triglyceride và thiobarbituric acid trong máu

Bổ sung quercetin trong khẩu phần ăn cũng giúp l giảm trọng lượng gan, các

mô mỡ trắng, các giọt lipit tích tụ trong gan Để tìm ra bằng c ch n o để quercetin giúp giảm béo phì, các nghiên cứu tập trung v o c c gen liên quan đến quá trình chuyển hóa lipid trong gan So với nhóm chuột đối chứng (bị béo phì) thì nhóm chuột

có thực đơn bổ sung quercetin sửa đổi biểu hiện của một số gen chuyển hóa liên quan đến lipid bao gồm Fnta, Pon1, Pparg, Aldh1b1, Apoa4, Abcg5, Gpam, Acaca, Cd36, Fdfft1 và Fasn Các mô hình biểu hiện của c c gen n y được quan sát bằng phản ứng chuỗi polymerase-transriptase v được x c định bằng hệ thống lai miễn dịch Các kết quả chỉ ra rằng quercetin ngăn chặn béo phì gây ra bởi chế độ ăn nhiều chất béo trong chuột C57b1/6, và tác dụng chống béo phì của nó có liên quan đến c c quy định của lipogenesis ở mức độ phiên mã [19]

Điều trị viêm khớp

Trong sự kết hợp với các chất dinh dưỡng khác, quercetin có thể làm giảm các triệu chứng của viêm xương khớp (viêm khớp): trong nghiên cứu với 20 bệnh nhân viêm khớp dạng thấp có bổ sung hàng ngày cùng lúc 3 loại thuốc: quercetin (16 6mg/viên); với vitamin C (33 mg/viên), lipoic acid (300 mg/viên) trong vòng 4 tuần liên tiếp thì thấy rằng nồng độ cytokine gây viêm hoặc protein C-reactive (CRP) trong huyết thanh không có sự khác biệt đ ng kể v cũng chưa có t c dụng điều trị Nhưng khi nghiên cứu lên tới 46 người và thời gian kéo dài lên tới 3 tháng có kết hợp với hoạt động hàng ngày thì đã thấy dịch lỏng được tiết ra trong các mô viêm khớp [30]

Giảm nguy cơ mắc hen suyễn

Nghiên cứu về mối quan hệ giữa quercetin hay các dẫn xuất của nó đối với các triệu chứng của bệnh hen suyễn do c c t c nhân m i trường (phấn hoa, côn trùng) gây nên cũng chưa được rõ nét Tuy nhiên, các tài liệu cho thấy t c động của một loại quercetin glycoside là isoquercitrin enzyme đã t c động lên những triệu chứng của dị ứng dạng trên Điều trị với 100-200mg/ngày với dạng quercetin glycoside trong vòng

8 tuần có hỗ trợ những hiện tượng dị ứng dạng trên tại mắt nhưng tại mũi thì chưa có kết quả đ ng tin cậy [21]

Điều trị tiểu đường

Nghiên cứu những con chuột mắc bệnh tiểu đường cho thấy sự gia tăng đ ng

kể về cácchỉ số tỉ trọng giữa thận/trọng lượng cơ thể, lượng đường trong m u, lượng albumin bài tiết trong nước tiểu (UAE), creatinine trong huyết thanh (SCR), lượng urê trong m u (BUN), v độ thanh thải creatinin (CCR) Các biểu hiện của TGF-β1 v CTGF trong thận l x c định bằng cách sử dụng real-time PCR và phương ph p Western blot [26]

Các biểu hiện của TGF-β1 v CTGF l trong nhóm bệnh tiểu đường cao hơn so với nhóm quercetin Tuy nhiên, những biểu hiện quá mức của cả hai TGF-β1 v CTGF trong các mô thận của chuột bị tiểu đường đã giảm sau khi tiêm quercetin Những kết quả này cho thấy rõ ràng rằng quercetin cải thiện chức năng thận ở chuột tiểu đường bằng cách ức chế các biểu hiện quá mức của yếu tố TGF-β1 v CTGF trong thận [26]

Tăng cường thể lực

Một nghiên cứu trên 254 đối tượng đã tham gia thấy rằng lượng O2 tiêu thụ max dao động 41-64 ml/kg/phút (trung bình 46 mL/kg/phút), trong khi thời gian điều trị trung bình là 11 ngày với một liều lượng trung bình 1000 mg quercetin/ ng y Độ lớn hiệu quả (ES) được tính là sự khác biệt trung bình chuẩn hóa, và phân tích meta được thực hiện bằng cách sử dụng một m hình t c động ngẫu nhiên [21]

Tính trung bình, quercetin cung cấp một lợi ch đ ng kể về mặt thống kê trong khả năng luyện tập thể dục thể thao của con người l m gia tăng thể tích O2 max và hiệu suất luyện tập với chỉ số tin cậy ES = 0,15 tương đương chỉ có khoảng 3% số người được sử dụng với quercetin trong có hiệu quả [21]

1 3 Các phươn pháp tách chiết hợp chất

Phương ph p tổng hợp quercetin cũng từ nguồn nguyên liệu thiên nhiên đó l phương ph p thủy phân Rutin có trong hoa hòe

1.3.1 Khái quát về phươn pháp tách chiết

Việc chiết xuất là cần thiết để cô lập và chiết xuất các thành phần của thực vật

để áp dụng trong ngành công nghiệp y tế dựa trên tầm quan trọng của cây trồng đối với sức khoẻ Có nhiều phương ph p t ch chiết và mỗi loài cây, thảo dược có thể phù hợp với một hoặc nhiều phương ph p kh c nhau (bảng 1.2) C c bước chuẩn bị cho tách chiết mẫu thực vật:

Lựa chọn mẫu thực vật phù hợp trước khi tách chiết rất quan trọng Ta cần lựa chọn mẫu phù hợp nhất để đem lại các kết quả tốt nhất sau khi tách chiết

Mẫu tươi v mẫu khô: Các mẫu kh được ưu tiên hơn vì chúng chứa hàm

lượng flavonoid cao hơn so với mẫu tươi v thời gian bảo quản mẫu kh lâu hơn [9]

Mẫu nghiền và mẫu b t: Sử dụng các mẫu này có thể l m tăng bề mặt tiếp xúc

giữa mẫu thực vật và các dung môi chiết xuất Các mẫu bột chứa các hạt nhỏ hơn c c mẫu nghiền, dẫn đến sự tiếp xúc bề mặt tốt hơn.Trong khi đó việc nghiền mẫu chỉ làm mẫu nhỏ hơn, do đó mẫu bột phổ biến hơn

Phương pháp tiền tách chiết: Có 4 phương ph p tiền tách chiết: Sấy khô bằng

khí, sấy bằng lò vi sóng, sấy khô và sấy đ ng kh (Bảng 1.2) [7]

Bảng 1.2 So s nh c c phương ph p tiền tách chiết [7]

Sử dụng năng lượng nhiệt

Dựa vào hiện tượng thăng hoa

Thời gian 3 - 7 ngày, vài tháng

cho đến một năm

Ngắn hơn sấy bằng khí

Ngắn hơn sấy bằng khí

Qua đêm (12h)

Đặc điểm Không sử dụng nhiệt

độ cao

Có hiện tượng

l m nóng đồng thời

Làm khô nước bằng nhiệt độ

Làm khô bằng nhiệt

độ thấp

Ưu điểm C c hợp chất chịu

nhiệt kh ng bị thay đổi

hoạt t nh

Nhanh Không làm

biến t nh

H m lượng phenolic cao hơn

Hạn chế

Thời gian tiến hành lâu; Mẫu có thể bị nhiễm bẩn ở điều kiện nhiệt độ không ổn định

Đ i khi gây ra

sự giảm thiểu lượng phytochemicals

Ảnh hưởng đến chất chống oxi hoá

Mẫu có thể

bị mất.Tốn kém

1 3 2 Các phươn pháp tách chiết

Có nhiều phương ph p t ch chiết gồm phương ph p truyền thống và hiện đại với mục đ ch l t ch được các hợp chất mong muốn C c phương ph p t ch chiết truyền thống: Ngâm, chiết, thấm và sắc; chiết bằng máy chiết Soxhlet (Bảng 1.3)

C c phương ph p t ch chiết hiện đại: Chiết bằng lò vi sóng (MAE), chiết bằng sóng siêu âm (UAE), chiết nhanh với dung môi (ASE) và chiết siêu tới hạn (SFE) (Bảng 1.4) C c phương ph p ASE v SFE được sử dụng ít vì tốn kém và hiệu quả thấp Mỗi phương ph p t ch chiết được sử dụng cần phù hợp với mẫu chiết và dung môi chiết khác nhau Dung môi chiết có thể phân cực hoặc không phân cực Các dung

m i thường sử dụng như ethanol, methanol, n-hexane, ethyl acetate [7]

Bảng 1.3 So s nh c c phương ph p t ch chiết truyền thống [7]

Phươn

điểm

Nhược điểm Ứng dụng

- Ngâm l phương ph p lấy bột thực

vật ngâm với dung môi nhiệt độ

phòng ít nhất 3 ng y để giải phóng

các chất phytochemical hòa tan Sau

đó, hỗn hợp n y được lọc qua màng

lọc, nhiệt được các dung môi chiết sẽ

x c định loại hợp chất chiết xuất

- Truyền và sắc có quy trình tương tự

như qu trình ngâm nhưng thời gian

nhanh hơn

- Thẩm thấu có nguyên tắc tương tự 3

phương ph p trên Ở phương ph p

này mẫu được ngâm trong thời gian

trên 2 giờ

Dễ dàng

v đơn giản

Chất thải vẫn chứa dung môi

Dùng để tách chiết các chất trong các

lo i như

P guajava

L, G

atriviridis, P oleracea, C.caudatus, M.oliefera

- Mẫu mịn được đặt trong một túi xốp

hoặc "bao" được làm từ giấy lọc hoặc

xenlulô nằm trong buồng của thiết bị

Soxhlet

- Dung môi chiết xuất được đun nóng

trong bình đ y, v bay hơi v o buồng

Dễ cháy, tốn kém, gây

ô nhiễm

Dùng để tách chiết các chất trong các loài

như A indica

(Neem), M oliefera, C asiatica

Bảng 1.4 So s nh c c phương ph p t ch chiết hiện đại [7]

- Cải thiện

sự phục hồi của chất phân tích

- Hạn chế các hợp chất phenolic nhỏ

- Để chiết xuấttriterpene

từ các loài

C.asiatica, D.hispida, A.paniculata

tăng bề mặt tiếp xúc giữa

dung môi và mẫu v độ

thấm của thành tế bào

- Tính chất của tế bào thay

đổi tế b o để giải phóng các

hợp chất v tăng cường sự

vận chuyển khối lượng của

dung môi vào tế bào thực vật

- Thời gian tách chiết nhanh

- Sử dụng ít dung môi Chi phí thấp

- Sóng siêu

âm trên 20 kHz có thể ảnh hưởng đến các chất thông qua sự hình thành của các gốc

tự do

- Để tách chiết các chất

omnifera, C formosum

1.4 Giới thiệu một số thực vật nghiên cứu

1.4.1 Rau má

Rau má có tên khoa học Centella asiatica là loài cây một năm thân thảo, thuộc

phân họ Mackinlayoideae của họ Hoa tán (Apiaceae), nguồn gốc từ Australia, c c đảo

Th i Bình Dương, Melanesia, New Guinea, Malesia và châu Á Tại Việt Nam, rau má mọc ở khắp nơi những khu vực ẩm ướt loại cây n y đều phát triển tốt Mùa phát triển nhất là tháng 4-6 hằng năm

Rau má có chứa các thành phần như: Triterpen, hợp chất polyacetylen, tinh dầu, flavonoid (kaempferol, quercetin), steroid (β-sitosterol, stigmasterol, campestrol) Rau

má có vị đắng, có t nh h n, v o được ba kinh: Can, Tỳ và Thận Rau má có công dụng thanh nhiệt lợi thấp, tiêu viêm, giải độc Cao rau m điều trị các vết thương nhiễm trùng, điều trị bỏng [6]

1 4 2 Câ đinh lăn

Cây đinh lăng c n được gọi l cây nam dương lâm, cây gỏi cá Tên khoa học

Polyscias fuiticosa (L) Harms, thuộc dòng họ ngũ gia bì Araliaceae Chúng tay dùng

rễ hay vỏ rễ sấy khô hoặc phơi kh Cây Đinh Lăng được trông phổ biến ở nước ta đặc biệt là các tỉnh miền núi Cây c n được mọc nhiều cả ở Lào và các tỉnh biên giới với Trung Quốc [6]

Cây đinh lăng có rất nhiều các thành phần hóa học bên trong bao gồm các alcaloit, vitamin B1, saponin, flavonoit, glucozit, tanit v c c axit amin trong đó có methionin, lyzin và xystei là những loại axit amin cực kỳ quan trọng rong quá trình nghiên cứu của viện y học quân sự cho thử nghiệm trực tiếp trên người với 0,23g đến 0,5 g bột đinh lăng trên ng y dưới dạng thuốc ngâm rượu nhẹ hoặc sắc lên để uống Kết quả nhận được là sức khỏe tăng hẳn lên, tăng sức dẻo dai như th nghiệm đã nghiên cứu [6]

Trên thực tế chúng ta ngoài công dụng ăn l m rau thơm ăn với gỏi cá, mọi người c n dùng Đinh lăng để chữa ho ra máu, thông tiểu, kiết lỵ nặng, ho, thông sữa

Ở Ấn độ loại cây n y c n được chữa sốt v l m đẹp cho da (l m săn da)

1.4.3 Hoa hòe

Hoa h e c n được gọi với c c tên kh c như h e hoa, h e hoa mễ hay h e mễ

Với tên khoa học l Sophora japonica L v thuộc họ nh C nh bướm Fabaceae Hoa

h e chứa từ 6-30% rutin, khi thủy phân sẽ thu được quexetola hay quexitin C15H10O7, ramnoza v glucoza [4,6]

Quả h e cũng chứa rutin Đây l một hợp chất có tinh thể hình trâm nhỏ m u trắng v ng hoặc v ng, tan trong rượu, tan nhiều trong dung dịch kiềm v rượu metylic,

kh ng tan trong benzen v ete clorofoc Theo đ ng y, hoa h e có vị đắng t nh bình (c n quả vị đắng t nh h n) dùng để chữa trĩ ra m u, x ch bạch lỵ, phụ nữ băng huyết,

m u cam, thổ huyết

Trong dân gian, hoa h e cũng được dùng l m thuốc cầm m u cho c c bệnh đổ

m u cam, ho ra m u, ruột chảy m u, tiểu tiện ra m u với liều lượng từ 5-20g mỗi ng y

ở dạng thuốc sắc [4]

Rutin được điều chế th nh thuốc viên, mỗi viên 0,02g dùng cho bệnh nhân cao

p huyết m có mao mạch dễ đứt, vỡ, ph ng chống xuất huyết cấp t nh do viêm thận, đứt mạch m u não, xuất huyết phổi kh ng r nguyên nhân [4]

1 4 4 R u đắng biển

Còn gọi l rau đắng có tên khoa học là Bacopa monniera Cây được sử dụng

trong các bài thuốc cổ truyền Ấn Độ từ c ch đây 3000 năm Rau đắng có chứa hoạt chất saponin gồm bacoside A và bacoside B, có tác dụng gia tăng tuần hoàn não, tăng cường dẫn truyền xung động ở hệ thần kinh, chống oxy hóa tế bào não, giúp cho sự tỉnh táo và nhận thức Theo các tài liệu Y học cổ truyền, rau đắng có tính mát, vị đắng,

có khả năng thanh nhiệt tiêu độc, thường dùng trong c c trường hợp kiết lỵ, sưng mắt

đỏ, viêm gan, suyễn, trợ thần kinh, trợ tim, động kinh, sử dụng làm thuốc xổ, ho, dùng ngoài trị ghẻ… C c nh khoa học còn phát hiện rau đắng biển có tác dụng giảm đau, kháng viêm, ức chế tế b o ung thư, dùng tốt cho hội chứng ruột kích thích, cho bệnh nhân Alzheimer, những bệnh nhân sau khi bị đột quỵ [6]

1.5.5 Bụp giấm

Bụp giấm có tên khoa học là Hibiscus sabdariffa L Cây bụp giấm có xuất xứ ở

Châu Phi, được du nhập vào Việt Nam v i năm gần đây Hiện nay lo i cây n y được khá nhiều nơi trồng để lấy hoa l m dược liệu Một số tỉnh trồng nhiều cây n y như Hà Nội, Hải Dương, Hưng Yên… Theo một số tài liệu hoa bụp giấm có chứa các hoạt chất: Vitamin A, C, các axit béo không no như axit citric, axit tartric, axit malic, các hợp chất hibiscus, polysaccharides, cyanidin [7]

Theo y học cổ truyền, bụp giấm có vị hơi chua, mùi thơm nhẹ, tính mát Công dụng của bụp giấm có thể kể đến gồm giảm cân, ph ng v điều trị bệnh béo phì; Tăng cường hệ miễn dịch, ngăn ngừa bệnh; Tăng cường chức năng gan, bảo vệ gan, hạ huyết áp, giảm cholesterol; Điều trị ho, viêm họng và tốt cho chức năng tiêu hóa [6,7]

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu

Mẫu thực vật được lựa chọn gồm 5 loài cây hoạt tính sinh họcgồm Bụp giấm, đinh lăng, hoa h e, rau đắng biển, rau má Các mẫu được thu mua tại các chợ trên địa bàn Hà Nội và một số tỉnh miền Bắc Các mẫu thực vật được x c định tên loài tại bộ môn thực vật, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên

Các mẫu thu mua được rửa sạch làm khô và tách chiết theo qui trình ở hình 2.1 Mẫu chuẩn quercetin (C5H10O7.2H2O): Chuẩn Dược điển Việt Nam, số kiểm soát 0216322.02, được dùng cho các phép thử định t nh v định lượng bằng phương

ph p phân t ch hóa lý (độ ẩm 8,75%, h m lượng tính theo nguyên trạng chất khan là 90,87%)

Mẫu dược liệu chuẩn H e hoa đã phơi, sấy nhẹ đến khô của cây Hòe

Styphnolobium japonicum (L) Schott, Syn Sophora japonica L., họ Đậu (Fabaceae),

số kiểm soát CV 0116 042.01, được dùng trong các phép thử soi bột v định t nh (độ

Mẫu chất chuẩn quercetin v dược liệu chuẩn H e hoa được Viện kiểm nghiệm thuốc Trung Ương/Bộ Y tế cung cấp theo các số kiểm so t tương ứng

Bản silicagel tráng sẵn F254 (Merk, Đức) Sephadex LH-20 (Amersham Biosciences, Thụy Điển), Silica gel 60 cho sắc ký cột k ch thước 230-400 mesh

Các hóa chất sử dụng thử hoạt tính chống gốc oxi hóa DPPH (2,2 - picrylhydrazyl) của hãng Sigma, Mỹ

Diphenyl-1-Các hóa chất dùng định tính polyphenol, flavonoid, glycoside trong mẫu chất: Thuốc thử Folin – Ciocalteu (Merck, Đức) Các hóa chất th ng thường kh c, đảm bảo độ sạch cho các phản ứng định tính gồm AlCl3, FeCl3, CH3COOK, NaOH, HCl, H2SO4,

Hóa chất được sử dụng dựng đường chuẩn gồm: axit galic (Canada), Quercetin (Viện dược liệu)

2.3 Thiết bị thí nghiệm

- Máy cô quay chân không Stuart RE300DB (Anh)

- Tủ hút LabTech LFH 2150 (LabTech – Hàn Quốc)

- Máy ly tâm Sigma 3K30 (Sartorius - Đức)

- pH/ion meter của (Horiba - Nhật Bản)

- Tủ sấy (Memmert - Đức)

- Cân Kern (Satorius–Đức)

- Cân phân tích (Presica- Ý)

- M y khuấy từ (IKA RET–Đức)

- Đèn tử ngoại hai bước sóng 245nm và 368nm (Việt Nam)

- Hệ thống sắc ký lỏng dùng cho phân tích phân tử sinh học (Agilent 1260 Infinity Bio-Inert Quaternary LC System hãng Agilent Technologies, Đức) Phần mềm OpenLAB CDS Chemstation, OpenLAB CDS Data Analysis

- Việc xử lý mẫu được tiến hành trên các thiết bị: máy siêu âm Elmasonic 100; máy lọc chân kh ng, cân phân t ch, m y đo pH, cối nghiền mẫu Các dụng cụ thủy tinh (bình định mức, pipet, cối nghiền ), đồ tiêu hao (giấy lọc, màng lọc, đầu hút, ) đạt chất lượng dùng cho phân t ch được mua công ty TNHH TEKCO Việt Nam

S-2 4 Phươn pháp n hiên cứu

2.4.1 Phươn pháp định tính các nhóm chất của thực vật bằng phản ứng màu

Áp dụng c c phương ph p định t nh x c định sự có mặt của các nhóm chất theo các tài liệu [1,2]

lần, mỗi lần 8 ml Gạn thu dịch chiết Gộp các dịch chiết cloroform và loại nước bằng natri sulfat khan Đem c c ch thủy đến khô Cắn thu được đem tiến hành làm các phản ứng định tính

Phản ứng Liebermann – Burchard: Cho vào ống nghiệm có chứa cắn ở trên

1ml anhydrid acetic, lắc đều cho tan hết cắn Nghiêng ống 45o Thêm từ từ theo thành ống 0,5ml H2SO4đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống Kết quả: Ở mặt tiếp xúc giữa

hai lớp chất lỏng xuất hiện một v ng m u t m đỏ (phản ứng dương t nh)

Phản ứng Baljet: Cho vào ống nghiệm có chứa cắn ở trên 0,5ml ethanol 90%

Lắc đều cho tan hết cắn Nhỏ từng giọt thuốc thử Baljet mới pha (1 phần dung dịch axit picric 1% và 9 phần dung dịch NaOH 10%) So sánh màu sắc với ống chứng là ống không có cắn glycosid tim Kết quả: Ống thử có m u đỏ cam kh ng đậm hơn ống chứng (phản ứng âm tính)

Phản ứng Legal: Cho vào ống nghiệm có chứa cắn ở trên 0,5ml ethanol 90%

Lắc đều cho tan hết cắn Nhỏ 1 giọt thuốc thử natri nitroprussiat 0,5% và 2 giọt dung dịch NaOH 10% Lắc đều sẽ xuất hiện m u đỏ cam So sánh màu sắc với ống chứng là ống không có cắn glycoside tim Kết quả: Ống thử có m u đỏ cam kh ng đậm hơn ống chứng là phản ứng âm tính [2]

Phản ứng Keller – Kiliani: Cho vào ống nghiệm chứa cắn ở trên 0,5ml ethanol

90% Lắc đều cho tan hết cắn Thêm vài giọt dung dịch sắt (III) clorid 5% pha trong axit acetic Lắc đều và cho từ từ theo thành ống 0,5ml axit sulfuric đặc, tránh trộn chất lỏng trong ống Kết quả: Ở mặt tiếp xúc giữa 2 lớp chất lỏng xuất hiện v ng m u đỏ

tím – phản ứng dương t nh

Định tính saponin: Cho 1g bột dược liệu vào ống nghiệm Thêm 10ml nước

Lắc mạnh theo chiều dọc ống nghiệm trong 5 phút Để yên và quan sát hiện tượng tạo bọt Kết quả: Xuất hiện cột bọt không bền sau khi ngừng lắc 45 phút – phản ứng âm

tính

Định tính tanin: Tiến hành: Cho 2g bột mẫu vào ống nghiệm, thêm 10ml nước

cất Đun s i trực tiếp 5 phút Lọc qua giấy lọc gấp nếp Lấy dịch lọc chia làm 3 ống nghiệm, mỗi ống 1ml, đem l m c c phản ứng định tính

Phản ứng với protein: Ống nghiệm 1: Thêm vào 1 giọt dung dịch gelatin 1%

mới pha Kết quả: Ống nghiệm không xuất hiện kết tủa bông trắng – phản ứng âm tính