Nghiên cứu tách chiết chlorophyll tạo nguyên liệu bán thành phẩm phục vụ sản xuất mỹ phẩm từ tảo xoắn spirulina platensis

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT CHLOROPHYLL TẠO NGUYÊN LIỆU BÁN THÀNH PHẨM PHỤC VỤ SẢN XUẤT MỸ PHẨM TỪ TẢO XOẮN SPIRULINA PLATENSIS Sinh viên thực : HOÀNG THỊ NGỌC MAI MSV : 642953 Lớp : K64CNSHB Khoa : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS PHÍ THỊ CẨM MIỆN HÀ NỘI - 2023 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết quả, hình ảnh, số liệu nghiên cứu sử dụng luận văn trung thực, chưa sử dụng báo cáo Tất thơng tin khóa luận trích dẫn Tơi xin chịu trách nhiệm lời cam đoan trước Học viện Hội đồng Hà Nội, ngày 12 tháng 02 năm 2023 Sinh viên Hoàng Thị Ngọc Mai i LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, xin chân thành cảm ơn quý thầy cô công tác Học viện Nông nghiệp Việt Nam, thầy cô khoa Công Nghệ Sinh Học tạo điều kiện giúp tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến TS Phí Thị Cẩm Miện ln quan tâm tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức thực tế, phương pháp luận góp ý suốt q trình thực tập làm luận văn Tôi xin trân trọng cảm ơn anh, chị, bạn bè làm việc mơn sinh học tận tình giúp đỡ, đóng góp ý kiến bổ ích tạo điều kiện cho tơi hồn thành tốt khóa luận tốt nghiệp Mặc dù có nhiều cố gắng, trình độ chun mơn kinh nghiệm thực tế cịn nhiều mặt hạn chế thiếu sót Vì tơi mong nhận đóng góp, tiếp thu đóng góp để luận văn nghiên cứu hồn thiện Tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 12 tháng 02 năm 2023 Sinh viên Hoàng Thị Ngọc Mai ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục bảng .vi Danh mục hình vii Danh mục từ viết tắt viii Tóm tắt ix PHẦN I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích yêu cầu đề tài 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Yêu cầu PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan tảo Spirulina platensis 2.1.1 Lịch sử phát triển 2.1.2 Đặc điểm phân loại 2.1.3 Đặc điểm cấu tạo, hình thái 2.1.4 Đặc điểm sinh trưởng tảo S.platensis 2.1.5 Thành phần hóa học tảo S.platensis 2.1.6 Ứng dụng vai trò tảo xoắn S.platensis 11 2.2 Chlorophyll 15 2.2.1 Giới thiệu Chlorophyll 15 2.2.2 Cấu trúc Chlorophyll 16 2.2.3 Tính chất vật lí Chlorophyll 17 2.2.4 Hoạt tính chống oxy hóa chlorophyll 18 2.2.5 Phân loại 19 2.2.6 Các nguồn nguyên liệu chứa Chlorophyll 20 2.2.7 Ứng dụng Chlorophyll 20 iii 2.3 Một số phương pháp tách chiết chlorophyll 23 2.3.1 Phương pháp siêu âm 23 2.3.2 Sử dụng bình Soxhlet 23 2.3.3 Chiết xuất khí hóa lỏng siêu tới hạn 24 2.4 Một số loại dung môi chiết chlorophyll 25 2.4.1 Acetone 25 2.4.2 Methanol 25 2.4.3 DMSO 25 2.5 Tình hình nghiên cứu chlorophyll nước giới 26 2.5.1 Trong nước 26 2.5.2 Trên giới 27 PHẦN III ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 3.1 Đối tượng, vật liệu, địa điểm thời gian nghiên cứu 29 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 29 3.1.2 Vật liệu, hóa chất 29 3.1.3 Thiết bị 29 3.1.4 Địa điểm thời gian nghiên cứu 29 3.2 Nội dung nghiên cứu 30 3.3 Phương pháp nghiên cứu 30 3.3.1 Nghiên cứu tách chiết chlorophyll từ tảo xoắn Spirulina 30 3.3.2 Nghiên cứu định tính định lượng chlorophyll 32 3.3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng yếu tố vật lý, hóa học đến hiệu suất tách chiết chlorophyll từ tảo xoắn Spirulina 33 PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37 4.1 Kết khảo sát tách chiết chlorophyll 37 4.2 Kết định tính định lượng chlorophyll 38 4.2.1 Kết định tính chlorophyll 38 4.2.2 Kết định lượng chlorophyll 39 iv 4.3 Ảnh hưởng yếu tố hóa học tới hiệu suất tách chiết chlorophyll từ tảo xoắn Spirulina 39 4.3.1 Kết ảnh hưởng loại dung môi đến hiệu tách chiết chlorophyll 39 4.3.2 Ảnh hưởng nồng độ dung môi đến hiệu tách chiết chlorophyll 40 4.3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ tách chiết đến hiệu tách chiết chlorophyll 41 4.3.4 Ảnh hưởng yếu tố thời gian đến hiệu tách chiết chlorophyll 43 4.4 Kết tinh chlorophyll 44 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 5.1 Kết luận 45 5.2 Kiến nghị 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 v DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Thành phần dinh dưỡng tổng hợp Spirulina Bảng 2.2 Thành phần vitamin tảo Spirulina Bảng 2.3 Thành phần khoáng chất tảo Spirulina Bảng 3.1 Thể tích pha lỗng ethanol 34 Bảng 4.1 Kết tách chiết chlorophyll phương pháp 37 Bảng 4.2 Bảng kết khảo sát ảnh hưởng loại dung môi sử dụng đến hiệu suất chiết chlorophyll 39 Bảng 4.3 Bảng kết khảo sát ảnh hưởng yếu tố nồng độ tới hiệu suất tách chiết chlorophyll 40 Bảng 4.4 Bảng kết khảo sát ảnh hưởng yếu tố nhiệt độ tới hiệu suất tách chiết chlorophyll 42 Bảng 4.5 Bảng kết khảo sát ảnh hưởng yếu tố thời gian tới hiệu suất tách chiết chlorophyll 43 vi DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Tảo xoắn Spirulina kính hiển vi Hình 2.2 Vịng đời tảo (Lukavský Jaromír., 2000) Hình 2.4 Bột tảo Spirulina Chlorophyll Hình 2.5 Bột tảo Spirulina Phycocyanin 10 Hình 2.6 Chlorophyll (Diệp lục) kính hiển vi 15 Hình 2.7 Cấu trúc hóa học chlorophyll (Scheer H, 2006) 17 Hình 2.8 Biểu đồ quang phổ hấp thu chlorophyll (Cater JS,1996) 17 Hình 2.9 Cấu trúc phân tử chlorophyll (Scheer H, 2006) 20 Hình 3.1 Bột tảo Spirulina 29 Hình 3.2 Cấu tạo chiết Soxhlet 31 Hình 3.3 Cấu tạo máy HPLC 32 Hình 3.4 Hệ thống HPLC viện nghiên cứu ứng dụng dịch vụ phân tích thí nghiệm NATION - LAB 33 Hình 3.4 Mơ hình sắc kí cột 36 Hình 4.1 Biểu đồ so sánh hiệu suất phương pháp tách chiết chlorophyll 37 Hình 4.2 Chlorophyll sau tách chiết 38 Hình 4.3 Phản ứng màu chlorophyll với HCl 38 Hình 4.4 Khảo sát ảnh hưởng yếu tố dung môi sử dụng đến hiệu suất tách chiết chlorophyll 40 Hình 4.5 Khảo sát ảnh hưởng yếu tố nồng độ dung môi sử dụng đến hiệu suất tách chiết chlorophyll 41 Hình 4.6 Khảo sát ảnh hưởng yếu tố nhiệt độ đến hiệu suất tách chiết chlorophyll 42 Hình 4.7 Khảo sát ảnh hưởng yếu tố thời gian đến hiệu suất tách chiết chlorophyll 43 Hình 4.8 Kết tinh chlorophyll qua giai đoạn 44 Hình 4.9 Chlorophyll sau tinh 44 vii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Ý nghĩa A.platensis Athrospira Platensis C-PC C - Phycocyanin DMSO Dimethyl sunfoxide GLA Axit linolenic-gamma HPLC High-performance liquid chromatography NASA National Aeronautics and Space Administration S.platensis Spirulina Platensis viii TÓM TẮT Tảo Spirulina loài tảo nghiên cứu nhiều đem lại nhiều lợi ích cho sức khỏe người Tuy nhiên, chlorophyll a ổn định khó chiết xuất dạng nguyên vẹn khỏi tế bào Spirulina, dẫn đến hiệu suất chiết xuất thấp.Trên giới Việt Nam có số cơng trình nghiên cứu ứng dụng chlorophyll dược mỹ phẩm Tuy nhiên, Việt Nam kỹ thuật tách chiết chlorophyll từ tảo xoắn chưa nghiên cứu thực tiễn Việc thí nghiệm tách chiết Chlorophyll tạo nguyên liệu bán thành phẩm phục vụ sản xuất mỹ phẩm từ tảo xoắn Spirulina Dựa vào kết cho thấy tách chiết chlorophyll phương pháp soxhlet cho hàm lượng chlorophyll cao (1,69 ± 0.05 0,85 ± 0.05) Do đó, tách chiết chlorophyll từ phương pháp soxhlet thích hợp chiết điều kiện giống sử dụng dung mơi khác cho khối lượng chlorophyll thu khác hiệu suất hoàn tồn khác Với dung mơi ethanol lượng chlorophyll thu 1,329g khi sử dụng dung mơi acetone để chiết cho kết thấp hơn, lượng chlorophyll thu sau tách chiết 0,164g; hiệu suất tách chiết chlorophyll ethanol cao tách chiết acetone Từ thí nghiệm cho thấy tách chiết chlorophyll từ tảo xoắn Spirulina dung môi ethanol 96% cho hiệu tốt Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất tách chiết chlorophyll từ tảo Spirulina, kết cho thấy sử dụng cồn thích hợp cholorophyll tan tốt cồn hiệu suất cao Khảo sát yếu tố nồng độ cho thấy, nồng độ cồn ethanol 96% cho hiệu suất tách chiết chlorophyll cao Khảo sát yếu tố nhiệt độ cho thấy rằngchlorophyll thu tốt nhiệt độ trung bình nhiệt độ thích hợp để chiết chlorophyll 50oC ix Hình 3.5 Mơ hình sắc kí cột 36 PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết khảo sát tách chiết chlorophyll Khảo sát phương pháp tách chiết chlorophyll tiến hành phương pháp gồm: chiết soxhlet, chiết ngấm kiệt chiết vi sóng; dung mơi sử dụng bốn phương pháp ethanol 96o, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi 1:30, nhiệt độ 50oC Bảng 4.1 Kết tách chiết chlorophyll phương pháp Tên phương pháp Khối lượng kết tủa (g) Hiệu suất (%) Soxhlet 1,507 ± 0.05 15,07 Ngấm kiệt 0,952 ± 0.05 9,52 Vi sóng 1,186 ± 0.05 11,86 Dựa vào bảng 4.1 cho thấy tách chiết chlorophyll phương pháp soxhlet cho hiệu suất cao với giá trị tương ứng 15,07% thấp phương pháp ngấm kiệt với giá trị 0,95% Phương pháp vi sóng thu 1,186g chlorophyll với hiệu suất 11,86% Hình 4.1 Biểu đồ so sánh hiệu suất phương pháp tách chiết chlorophyll 37 4.2 Kết định tính định lượng chlorophyll 4.2.1 Kết định tính chlorophyll Sau tách chiết chlorophyll từ taoe xoắn Spirulina định tính phản ứng màu với HCl Hình 4.2 Chlorophyll sau tách chiết Lấy 2ml dịch chiết thêm giọt HCl 3N lắc nhẹ ta thấy màu nâu xuất Hình 4.3 Phản ứng màu chlorophyll với HCl 38 Kết hình 4.2 cho thấy chlorophyll tách chiết có phản ứng với dung dịch HCl tạo màu nâu 4.2.2 Kết định lượng chlorophyll Bảng 4.2 Hàm hượng chlorophyll thu dịch chiết Soxhlet Ngấm kiệt MAE Chlorophyll a (g) 1,69 ± 0.05 1,31 ± 0.05 1,54 ± 0.05 Chlorophyll b (g) 0,85 ± 0.05 0,7 ± 0.05 0,68 ± 0.05 Dựa vào bảng 4.2 cho thấy tách chiết chlorophyll phương pháp soxhlet cho hàm lượng chlorophyll cao (1,69 ± 0.05 0,85 ± 0.05), thấp phương pháp ngấm kiệt (1,31 ± 0.05 0,7 ± 0.05) Phương pháp vi sóng thu hàm lượng chlorophyll 1,54 ± 0.05 0,68 ± 0.05 Do đó, tách chiết chlorophyll từ phương pháp soxhlet thích hợp 4.3 Ảnh hưởng yếu tố hóa học tới hiệu suất tách chiết chlorophyll từ tảo xoắn Spirulina 4.3.1 Kết ảnh hưởng loại dung môi đến hiệu tách chiết chlorophyll Ảnh hưởng dung môi đến trình chiết xuất chlorophyll từ tảo xoắn Spirulin tiến hành phương pháp soxhlet với hai loại dung môi cồn nước thời gian tiếng nhiệt độ 50oC với tỉ lệ nguyên liệu/dung môi 1:30 Bảng 4.2 Bảng kết khảo sát ảnh hưởng loại dung môi sử dụng đến hiệu suất chiết chlorophyll Dung môi Khối lượng chlorophyll (g) Hiệu suất (%) Ethanol 96% 1,329 ± 0,05 13,29 Acetone 100% 0,164 ± 0,05 1,64 Từ kết bảng 4.2 cho thấy chiết điều kiện giống sử dụng dung mơi khác cho khối lượng chlorophyll thu khác hiệu suất hồn tồn khác Với dung mơi ethanol lượng chlorophyll thu 1,329g khi sử dụng dung mơi acetone để chiết cho kết thấp hơn, 39 lượng chlorophyll thu sau tách chiết 0,164g; hiệu suất tách chiết chlorophyll ethanol cao tách chiết acetone Hình 4.4 Khảo sát ảnh hưởng yếu tố dung môi sử dụng đến hiệu suất tách chiết chlorophyll 4.3.2 Ảnh hưởng nồng độ dung môi đến hiệu tách chiết chlorophyll Để đánh giá ảnh hưởng yếu tố nồng độ dung môi tới hiệu tách chiết chlorophyll ta tiến hành thực với dung mơi ethanol có nồng độ tương ứng 60%, 70%, 80%, 96% với tỉ lệ nguyên liệu/ dung môi 1:30 Kết khảo sát thể bảng 4.3 Bảng 4.3 Bảng kết khảo sát ảnh hưởng yếu tố nồng độ tới hiệu suất tách chiết chlorophyll Nồng độ (%) Khối lượng chlorophyll(g) Hiệu suất (%) 60 1,96± 0,05 19,6 70 1,854 ± 0,05 18,54 80 2,136 ± 0,05 21,36 96 2,428 ± 0,05 24,28 40 Kết thu thể bảng 4.3 áp dụng công thức: H (%) = (m cao khơ)/(m mẫu)×100 Ta thấy với mẫu chlorophyll sau chiết với dung môi ethanol với nồng độ 60%,70%, 80%, 96% khối lượng chlorophyll thu cao dung môi ethanol 96% tương đương với 24,28% Trong đó, dung mơi ethanol 80% khối lượng chlorophyll cao với khối lượng 2,136g với hiệu suất tương đương 21,36% Ethanol 70% có hàm lượng nước cao (chiếm 42% thể tích) nên mẫu bị oxi hóa oxi nước phản ứng với chlorophyll tiếp xúc thời gian dài làm mẫu chiết ngả sang màu vàng, nên không chọn ethanol 70% Như vậy, tách chiết chlorophyll từ tảo xoắn Spirulina dung môi ethanol 96% cho hiệu tốt Hình 4.5 Khảo sát ảnh hưởng yếu tố nồng độ dung môi sử dụng đến hiệu suất tách chiết chlorophyll 4.3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ tách chiết đến hiệu tách chiết chlorophyll Để đánh giá ảnh hưởng yếu tố nhiệt độ tách chiết tới hiệu suất chiết chlorophyll ta tiến hành thực với dung môi ethanol 96%, nhiệt độ tương đương 30℃, 40℃, 50℃, 60℃ tỉ lệ tảo khô Spirulina /dung môi 1:30 Khảo sát thu trình bày bảng 4.4 41 Bảng 4.4 Bảng kết khảo sát ảnh hưởng yếu tố nhiệt độ tới hiệu suất tách chiết chlorophyll Nhiệt độ (oC) Khối lượng chlorophyll thô (g) Hiệu suất (%) 30 1,291 ± 0,05 12,91 40 1,342 ± 0,05 13,42 50 1,540 ± 0,05 15,40 60 1,562 ± 0,05 15,62 Dựa vào kết bảng 4.4 cho thấy hàm lượng chlorophyll thay đổi theo nhiệt độ tăng dần Hàm lượng chlorophyll cao 60℃, nhiệt độ chlorophyll dần chuyển sang màu vàng cholorophyll chuyển thành pheophytin, nên ta kết ghi nhận nhiệt độ 50℃ để đảm bảo chlorophyll không bị biến đổi Tại nhiệt độ 50℃ chlorophyll thu 1,540g tương đương với 15,40% Nhiệt độ tăng trình thẩm thấu dung mơi vào thành tế bào hịa tan chlorophyll vào dung môi diễn nhanh hơn, đồng thời trình khuyếch tán chlorophyll khỏi vách tế bào diễn nhanh làm cho lượng chlorophyll thu nhiều 18 16 Hiệu suất (%) 14 12.91 15.4 15.62 50 60 13.42 12 10 30 40 Nhiệt độ (˚C) Hình 4.6 Khảo sát ảnh hưởng yếu tố nhiệt độ đến hiệu suất tách chiết chlorophyll 42 4.3.4 Ảnh hưởng yếu tố thời gian đến hiệu tách chiết chlorophyll Để đánh giá ảnh hưởng yếu tố thời gian tới hiệu tách chiết chlorophyll ta tiến hành thực với dung môi ethanol 96%, nhiệt độ 50℃ với tỉ lệ nguyên liệu/ dung môi 1:30 Kết khảo sát thể bảng 4.5 Bảng 4.5 Bảng kết khảo sát ảnh hưởng yếu tố thời gian tới hiệu suất tách chiết chlorophyll Thời gian (giờ) Khối lượng chlorophyll(g) Hiệu suất (%) 1,145 ± 0,05 11,45 1,339 ± 0,05 13,39 12 1,698 ± 0,05 16,89 16 1,552 ± 0,05 15,52 Kết thu bảng 4.5 cho thấy khối lượng chlorophyll thu ca 12 Thời gian chiết lâu lượng Chlorophyll tăng, song thời gian chiết lâu không mang lại hiệu Thời gian từ đến 12 khối lượng chlorophyll thu tăng dần từ 1,145g đến 1,698g tương đương với hiệu suất 11,45% 16,89% Đến 16 trở khối lượng chlorophyll giảm dần 16.89 18 15.52 16 13.39 Hiệu suất (%) 14 12 11.45 10 4 12 16 Thời gian (giờ) Hình 4.7 Khảo sát ảnh hưởng yếu tố thời gian đến hiệu suất tách chiết chlorophyll 43 4.4 Kết tinh chlorophyll Dịch chiết chlorophyll sau chiết xuất phương pháp soxhlet với dung môi ethanol 96% vàđược tinh phương pháp sắc kí cột Hình 4.8 Kết tinh chlorophyll qua giai đoạn Hình 4.9 Chlorophyll sau tinh Dựa vào hình 4.9 thể thấy rõ màu sắc chlorophyll xanh hồn tồn, khơng bị lẫn màu chất khác Có thể thấy phương pháp tinh cột sắc kí cho hiệu suất tinh tốt 44 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Đã thực nghiên cứu chiết xuất chlorophyll từ tảo Spirulina phương pháp: soxhlet, ngấm kiệt, vi sóng Trong đó, phương pháp chiết soxhlet cho hiệu suất cao nhất, phương pháp chiết ngấm kiệt cho hiệu suất thấp Tuy nhiên, phương pháp ngấm kiệt lại phù hợp với việc sản xuất quy mơ lớn, thực quy mơ cơng nghiệp cịn chiết vi sóng chiết soxhlet thực quy mơ phịng thí nghiệm, phục vụ nghiên cứu chi phí lắp đặt đắt Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất tách chiết chlorophyll từ tảo Spirulina, kết cho thấy sử dụng cồn thích hợp cholorophyll tan tốt cồn hiệu suất cao Khảo sát yếu tố nồng độ cho thấy, nồng độ cồn ethanol 96% cho hiệu suất tách chiết chlorophyll cao Khảo sát yếu tố nhiệt độ cho thấy chlorophyll thu tốt nhiệt độ trung bình nhiệt độ thích hợp để chiết chlorophyll 50oC 5.2 Kiến nghị Do thời gian nghiên cứu có hạn nên số phương pháp tinh chlorophyll khác chưa thể thực Bên cạnh đó, nghiên cứu dừng mức quy mơ phịng thí nghiệm đề xuất thêm nghiên cứu cải thiện hiệu suất tách chiết, tinh sạch; sản xuất sinh khối chlorophyll quy mô lớn, phục vụ cho ngành sản xuất dược liệu, sản xuất dược mỹ phẩm 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Lê Văn Lăng (1999) Spirulina - nuôi trồng sử dụng y dược dinh dưỡng, NXB Y học Nguyễn Thị Bông (2012) Nghiên cứu tách chiết Chlorophyll Carotenoid từ tảo Chlorella, Khóa luận tốt nghiệp cơng nghệ hóa học, Trường Đại học Nơng lâm thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Văn Tuyên (2003) Đa dạng sinh học tảo thủy vực nội địa Việt Nam Triển vọng Thách thức NXB Nông nghiệp 499 Trần Thị Oanh (2015) Tài liệu chiết xuất dược liệu Vũ Thành Lâm (2006) Nuôi trồng tảo Spirulina, Trung tâm Công nghệ Sinh học, Đại Học Quốc Gia Hà Nội TIẾNG ANH A Gitelson, Y Grits, D Etzion, (2000) Optimal properties of Nannochloropsis sp and application to remote estimation of cell mass, Biotechnology Bioengineering 69, 516 Abdulqader, G.; Barsanti, L.; Tredici, M (2000) "Harvest of Arthrospira platensis from Lake Kossorom (Chad) and its household usage among the Kanembu" Journal of Applied Phycology Arad, S (Malis); Yaron, A (1992) Natural pigments from red microalgae for use in foods and cosmetics Trends in Food Science & Technology, 3(), 92–97 Arad, S (Malis); Yaron, A (1992) Natural pigments from red microalgae for use in foods and cosmetics Trends in Food Science & Technology, 3(), 92–97 10 Barrón, L B., Torres-Valencia, M J., Chamorro-Cevallos, G., & ZúñigaEstrada, A (2008) Spirulina in human nutrition and health Spirulina as an Antiviral Agent New York: CRC Press, Taylor & Francis, 227-40 11 Carter JS (1996) "Photosynthesis" University of Cincinnati Archived from the original on 2013-06-29 12 Chisti Y, Moo-Young M., (1986) Disruption of microbial cells for intracellular products, Enzyme Microb Technol, 8, 194 – 204 46 13 Choi, Woon & Lee, Hyeon (2018) Enhancement of Neuroprotective Effects of Spirulina platensis Extract from a High-Pressure Homogenization Process Applied Sciences 14 Cohen Z (1997) The chemicals of spirulina, In: Spirulina Platensis Arthrospira Physiology, Cell-Biology and Biotechnology (A.E Vonshak Ed.) CRC Press pp 175-204, ISBN: 9780748406746, eBook ISBN: 9780429079948 15 Cornet, J.F., Dussap, C.G., Cluzel, P and Dubertret, G (1992) A structured model for simulation of cultures of the cyanobacterium Spirulina platensis in photobioreactors: II Identification of kinetic parameters under light and mineral limitations Biotechnol Bioeng., 40: 826-834 16 David Simon; Stuart Helliwell (1998) Extraction and quantification of chlorophyll a from freshwater green algae , 32(7), 0–2223 17 Dere S, Gunes T and Sivaci R., (1998) Spectrophotometric determination of chlorophyll –A, B and total carotenoid contents of some algae species using different solvents, Tr J Botany, 22, 13-17 18 Díaz del Castillo, B (2003) The discovery and conquest of Mexico, 15171521 2nd Da Capo Press ed Cambridge, MA, Da Capo Press 19 F Soxhlet, (1879) Die gewichtsanalytische Bestimmung des Milchfettes, Dingler’s Polytechnisches Journal, 232, 461-465 20 Fischer, H., Mittenzwei, H and Hevér, D.B (1940) Überführung von Dehydro-bacterio-phäophorbid a in Chlorophyll a Justus Liebigs Ann Chem., 545: 154-178 21 Fleming I (1967) "Absolute Configuration and the Structure of Chlorophyll" Nature 216 (5111): 151–152 22 Habib, M Ahsan B & Huntington, Tim & Hasan, Mohammad R & Food and Agriculture Organization of the United Nations (2008) A review on culture, production and use of Spirulina as food for humans and feeds for domestic animals and fish Rome, Italy : Food and Agriculture Organization of the United Nations 23 47 24 Hannay, J B., & Hogarth, J (1879) On the Solubility of Solids in Gases Proceedings of the Royal Society of London, 30, 178–188 25 Hendry, G.A.F., (1996) Chlorophylls and Chlorophyll derivates In: Hendry, G.A.F., Houghton, J.D.(Eds.), Natural Food Colorants Blackil Academic Professional, London 26 Hosikian, A., Lim, S., Halim, R., & Danquah, M K (2010) Chlorophyll extraction from microalgae: A review on the process engineering aspects International journal of chemical engineering, 2010 27 Hosikian, Aris; Lim, Su; Halim, Ronald; Danquah, Michael K (2010) Chlorophyll Extraction from Microalgae: A Review on the Process Engineering Aspects International Journal of Chemical Engineering, 2010(), 1–11 doi:10.1155/2010/391632 28 Lichtenthaler H, Wellburn A, (1983), Determinations of total carotenoids and chlorophylls a and b of leaf extracts in different solvents, Biochemical Society Transactions, 11, 591–592 29 Lichtenthaler, H and Wellburn, A (1983) Determinations of Total Carotenoids and Chlorophylls a and b of Leaf Extracts in Different Solvents Biochemical Society Transactions, 603, 591-592 30 Lukavský, Jaromír (2000) Vonshak, A (Ed.): Spirulina platensis (Arthrospira) Physiology, Cell Biology and Biotechnology Photosynthetica 38 552-552 10.1023/A:1012498515734 31 M Pepe, C Giardino, G Borsani, (2001) Relationship between apparent optical properties and photosynthetic pigments in the sub-alpine Lake Iseo, The Science of the Total Environment, 268(1-3), 31 32 M.G Ferruzzi, V Böhm, P.D Courtney, S.J Schwartz, (2002), Antioxidant and Antimutagenic Activity of Dietary Chlorophyll Derivatives Det ermined by Radical Scavenging and Bacterial Reverse Mutagenesis Assays, Volume 67, Issue 7, 2589–2595 33 Mackinney, G (1941) Absorption of light by chlorophyll solutions Journal of Biological Chemistry, 140(2), 315–322 48 34 Munawaroh, Heli & Fathur, R & Gumilar, G & Aisyah, Siti & Yuliani, Galuh & Mudzakir, Ahmad & Wulandari, Asri (2019) Characterization and physicochemical properties of chlorophyll extract from Spirulina sp Journal of Physics: Conference Series 1280 022013 10.1088/1742-6596/1280/2/022013 35 Niels T (2008) Eriksen Production of phycocyanin—a pigment with applications in biology, biotechnology, foods and medicine Appl Microbiol Biotechnol, 80, -14 36 Oo, Y Y N., Su, M C., & Kyaw, K T (2017) Extraction and determination of chlorophyll content from microalgae International Journal of Advanced Research and Publications, 1(5), 298 37 Osborne, Ken; Kahn, Charles N (2005) World History: Societies of the Past Winnipeg: Portage & Main Press 38 Park, W S., Kim, H J., Li, M., Lim, D H., Kim, J., Kwak, S S., Kang, C M., Ferruzzi, M G., & Ahn, M J (2018) Two Classes of Pigments, Carotenoids and C-Phycocyanin, in Spirulina Powder and Their Antioxidant Activities Molecules (Basel, Switzerland), 23(8), 2065 39 Pelletier J & Caventou Joseph-Bienaimé (1817) Notice sur la matière verte des feuilles : par mm pelletier et caventou L Colas 40 Prescott, G.W (1969) The algae : a review Oikos, 20, 569 41 Rahim A., Çakir C., Ozturk M., Şahin B., Soulaimani A., Sibaoueih M., Nasser B., Eddoha R., Essamadi A., El Amiri B (2021) Chemical characterization and nutritional value of Spirulina platensis cultivated in natural conditions of Chichaoua region (Morocco) South African Journal of Botany, 141(9): 235-242 42 Romay C.H., Gonzalez R., Ledon N., Remirez D., and Rimbau V (2003) CPC: a biliprotein with antioxidation, anti-inflammatory and neuroprotective effects Current protein and Peptide Science; (3): 207-216 43 Rosa G.M., Moraes L., Cardias B.B, de Souza M.R.A.Z., Costa J.A.V (2015) Chemical absorption and CO2 biofixation via the cultivation of Spirulina in semicontinuous mode with nutrient recycle Bioresource Technology, 192(9): 321-327 49 44 S.T Silveria, J.F.M Burkert, J.A.V Costa,C.A.V Burkert, S.J.Kalil, (2007) Optimization of phycocyanin extraction from Spirulina platensis using factorial design Bioresource Technology, 98, 1629 -1634 45 Sánchez M., Bernal-Castillo J., Rozo C., Rodríguez I (2003) Spirulina (arthrospira): An edible microorganism: A review Universitas Scientiarum.Revista de la Facultad de Sciencias 8(1): 7-24 46 Scheer H (2006) "An Overview of Chlorophylls and Bacteriochlorophylls: Biochemistry, Biophysics, Functions and Applications" Chlorophylls and Bacteriochlorophylls Advances in Photosynthesis and Respiration Vol 25 pp 1–26 47 Simon, D., & Helliwell, S (1998) Extraction and quantification of chlorophyll a from freshwater green algae Water research, 32(7), 2220-2223 48 Siva Kiran, R R & Madhu, G.M & SV, Satyanarayana (2016) Spirulina in combating Protein Energy Malnutrition (PEM) and Protein Energy Wasting (PEW) - A review 10.13140/RG.2.1.3149.0325 49 Stefan Hörtensteiner (2009) Stay-green regulates chlorophyll and chlorophyllbinding protein degradation during senescence , 14(3), 0–162 50 UNESCO, (1966), Rep SCOR/UNESCO WG 17, UNESCO, Paris, Monogr Oceanogr Methodol, 1, 11 51 Willstätter R (1906) "Zur Kenntniss der Zusammensetzung des Chlorophylls" [Contribution to the knowledge of the composition of chlorophyll] Annalen der Chemie (in German) 350 (1–2): 48–82 52 Wollina, U., Voicu, C., Gianfaldoni, S., Lotti, T., Franca, K., & Tchernev, G (2018) Arthrospira Platensis-Potential in Dermatology and Beyond Open Access Macedonian Journal of Medical Sciences, 6(1), 176-180 53 Woodward RB, Ayer WA, Beaton JM, Bickelhaupt F, Bonnett R, Buchschacher P, et al (1990) "The total synthesis of chlorophyll a" Tetrahedron 46 (22): 7599–7659 50