Tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men vang phối hợp từ táo mèo và nho

... Phân lập chủng nấm men có khả lên men vang phối hợp từ táo mèo nho Cabernet sauvignon 24 3.2 Tuyển chọn xác định tên khoa học chủng nấm men có khả lên men vang phối hợp táo mèo nho Cabernet... học 3.2 Tuyển chọn xác định tên khoa học chủng nấm men có khả lên men vang phối hợp táo mèo nho Cabernet sauvignon 3.2.1 Xác định tên khoa học chủng nấm men có khả lên men vang táo mèo nho Cabernet... Xác định tên khoa học chủng nấm men có khả lên men vang táo mèo nho Cabernet sauvignon 26 3.2.2 Tiêu chuẩn chọn chủng nấm men có khả lên men vang phối hợp táo mèo nho Cabernet sauvignon

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN ---------- NGUYỄN THỊ HUYỀN TUYỂN CHỌN CHỦNG NẤM MEN CÓ KHẢ NĂNG LÊN MEN VANG PHỐI HỢP TỪ TÁO MÈO VÀ NHO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Vi sinh vật học Ngƣời hƣớng dẫn khoa học TS. NGUYỄN QUANG THẢO HÀ NỘI, 2015 LỜI CẢM ƠN Trong quá trình hoàn thành khóa luận tốt nghiệp, ngoài sự nỗ lực và cố gắng của bản thân, tôi còn nhận đƣợc sự giúp đỡ vô cùng quý báu từ phía nhà trƣờng, khoa và đặc biệt là các thầy, cô giáo. Nhân dịp này tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: Ban lãnh đạo, các thầy cô trong tổ vi sinh vật Khoa Sinh-KTNN trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2, cùng sự phối hợp giúp đỡ nhiệt tình của các anh, chị, bạn trong nhóm luận văn vi sinh. Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS.Đinh Thị Kim Nhung và thầy giáo TS.Nguyễn Quang Thảo, giúp đỡ em trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 12 tháng 05 năm 2015 Sinh viên Nguyễn Thị Huyền LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan những gì viết trong khóa luận này đều là sự thật. Đây là kết quả của riêng tôi. Tất cả các số liệu trong bảng biểu và hình ảnh đều đƣợc thu thập từ thực nghiệm, qua xử lý thống kê, không có số liệu sao chép hay bịa đặt, không trùng với kết quả của bất kỳ tác giả nào đã công bố dƣới sự hƣớng dẫn của TS. Nguyễn Quang Thảo và PGS.TS. Đinh Thị Kim Nhung. Trong đề tài, tôi có sử dụng một số dẫn liệu của một số tác giả khác, tôi xin phép các tác giả đƣợc trích dẫn để bổ sung cho luận văn của mình. Nếu sai tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm. Xin trân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 12 tháng 05 năm 2015 Sinh viên Nguyễn Thị Huyền BẢNG CHỮ CÁI VIẾT TẮT TRONG KHÓA LUẬN CHỮ VIẾT TẮT ĐƢỢC ĐỌC LÀ 1. S Saccharomyces 2. STT Số thứ tự 3. HL Hàm lƣợng 4. TG Thời gian 5. Vsv Vi sinh vật 6. ĐHSP Đại học sƣ phạm 7. TB/ml Tế bào/ml 8. SLTB Số lƣợng tế bào 9. PTTQ Phƣơng trình tổng quát 10. L.buchneri Lactobacillus plantanrum 11. L.casie Lactobacillus casie 12. L.brevis Lactobacillus brevis MỤC LỤC MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1 1. Lí do chọn đề tài ..................................................................................... 1 2. Mục đích nghiên cứu............................................................................... 2 3. Nội dung nghiên cứu ............................................................................... 3 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn ................................................................. 3 5. Điểm mới của đề tài ................................................................................ 3 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................... 4 1.1. Tổng quan về đối tƣợng ....................................................................... 4 1.1.1. Táo mèo và nho Cabernet sauvignon ............................................. 4 1.2. Khái quát chung về lên men rƣợu vang ................................................ 5 1.2.1. Khái niệm rƣợu vang ..................................................................... 5 1.2.2. Thành phần và giá trị dinh dƣỡng của rƣợu vang ........................... 5 1.2.3. Nguyên liệu sản xuất rƣợu vang ..................................................... 5 1.2.4. Phân loại vang ............................................................................... 6 1.3. Hệ vi sinh vật tham gia vào quá trình lên men ...................................... 7 1.3.1. Nấm men ....................................................................................... 7 1.3.2. Vi khuẩn lactic ............................................................................. 10 1.3.3. Nấm mốc ..................................................................................... 10 1.3.4. Vi sinh vật làm hỏng vang ........................................................... 10 1.3.5. Bệnh vang .................................................................................... 10 1.4. Các yếu tố ảnh hƣởng tới quá trình sinh trƣởng và phát triển của nấm men ................................................................................................... 11 1.4.1. Nguồn cacbon .............................................................................. 11 1.4.2. Nguồn photpho vô cơ ................................................................... 12 1.4.3. Nguồn nitơ vô cơ ......................................................................... 12 1.4.4. Nguồn oxi .................................................................................... 12 1.4.5. Các nguyên tố khoáng .................................................................. 12 1.4.6. Nƣớc ............................................................................................ 12 1.4.7. Các vitamin .................................................................................. 12 1.5. Yêu cầu của việc lựa chọn chủng nấm men lên men vang .................. 13 1.6. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình lên men ...................................... 13 1.6.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ ............................................................... 13 1.6.2. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng đƣờng và men giống .......................... 13 1.6.3. Ảnh hƣởng của độ pH .................................................................. 14 1.6.4. Ảnh hƣởng của nồng độ cồn ........................................................ 14 1.6.5. Ảnh hƣởng của thời gian lên men ................................................ 14 1.6.6. Những biến đổi sinh lí, sinh hóa, vi sinh trong quá trình lên men rƣợu vang .............................................................................................. 15 1.7. Tình hình sản xuất rƣợu vang ............................................................. 16 1.7.1. Tình hình sản xuất rƣợu vang trên thế giới ................................... 16 1.7.2. Tình hình sản xuất rƣợu vang trong nƣớc ..................................... 17 CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 19 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu ..................................................................... 19 2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu .................................................................. 19 2.2. Hóa chất, dụng cụ thiết bị ................................................................... 19 2.2.1. Hóa chất ....................................................................................... 19 2.2.2. Dụng cụ thiết bị ........................................................................... 19 2.3. Môi trƣờng ......................................................................................... 19 2.3.1. Môi trƣờng Hansen (môi trƣờng phân lập, MT1)(g/ml) ............... 19 2.3.2. Môi trƣờng nhân giống (môi trƣờng 2, MT2) (g/ml) .................... 20 2.3.3. Môi trƣờng lên men (Môi trƣờng 3, MT3) (g/ml)......................... 20 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu .................................................................... 20 2.4.1. Các phƣơng pháp vi sinh .............................................................. 20 2.4.2. Phƣơng pháp hóa học ................................................................... 22 2.5. Phạm vi nghiên cứu ............................................................................ 23 2.6. Địa điểm nghiên cứu .......................................................................... 23 2.7. Thời gian nghiên cứu ......................................................................... 23 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ....................... 24 3.1. Phân lập chủng nấm men có khả năng lên men vang phối hợp từ táo mèo và nho Cabernet sauvignon ............................................................... 24 3.1.1. Các tỷ lệ phối hợp hai nguyên liệu táo mèo và nho Cabernet sauvignon dùng trong thí nghiệm ........................................................... 24 3.1.2. Phân lập chủng nấm men có khả năng lên men vang phối hợp từ táo mèo và nho Cabernet sauvignon .................................................. 24 3.2. Tuyển chọn và xác định tên khoa học của chủng nấm men có khả năng lên men vang phối hợp táo mèo và nho Cabernet sauvignon .................. 26 3.2.1. Xác định tên khoa học của chủng nấm men có khả năng lên men vang táo mèo và nho Cabernet sauvignon ............................................ 26 3.2.2. Tiêu chuẩn chọn chủng nấm men có khả năng lên men vang phối hợp táo mèo và nho Cabernet sauvignon ....................................... 26 3.3. Nghiên cứu động thái phát triển của chủng nấm men H1 trong môi trƣờng nhân giống ..................................................................................... 31 3.4. Ảnh hƣởng của một số nhân tố ảnh hƣởng tới quá trình lên men vang phối hợp táo mèo và nho Cabernet sauvignon........................................... 33 3.4.1. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng đƣờng tới quá trình lên men vang phối hợp táo mèo và nho Cabernet sauvignon ....................................... 33 3.4.2. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng men giống tới quá trình lên men vang phối hợp táo mèo và nho Cabernet sauvignon ....................................... 36 3.5. Lên men với quy mô phòng thí nghiệm và xây dựng quy trình sản xuất vang táo mèo và nho Cabernet sauvignon ................................... 40 3.5.1. Lên men với quy mô phòng thí nghiệm ........................................ 40 3.5.2. Quy trình công nghệ sản xuất rƣợu vang táo mèo và nho Cabernet sauvignon .............................................................................................. 41 3.5.3. Thuyết minh công nghệ................................................................ 42 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .......................................................................... 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 44 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Thành phần hóa học của một số loại quả ....................................... 6 Bảng 3.1. Các tỷ lệ phối hợp dịch siro táo mèo và nho Cabernet sauvignon . 24 Bảng 3.2. Hoạt lực lên men của 3 chủng nấm men H1, H2, H3 ...................... 27 Bảng 3.3. Khả năng kết lắng của 3 chủng nấm men H1, H2, H3 .................... 28 Bảng 3.4. Khả năng lên men đƣờng của 3 chủng nấm men H1, H2, H3 ......... 29 Bảng 3.5. Khả năng lên men ở các độ pH khác nhau của 3 chủng nấm men H1, H2, H3 ................................................................................... 29 Bảng 3.6. Khả năng tạo hƣơng thơm và độ trong của 3 chủng nấm men ...... 30 Bảng 3.7. Tổng hợp các kết quả của 3 chủng nấm men ................................ 30 Bảng 3.8. Động thái phát triển của chủng nấm men H1................................. 31 Bảng 3.9. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng đƣờng tới quá trình nhân giống của chủng nấm men H1 ..................................................................... 33 Bảng 3.10. Động thái lên men của chủng nấm men H1 ................................. 36 Bảng 3.11. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng men giống đến sự biến động số lƣợng tế bào trong thời gian 72h của chủng S.cerevisiae....................... 38 Bảng 3.12. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng men giống tới quá trình lên men vang táo mèo và nho Cabernet sauvignon ........................................... 39 Bảng 3.13. Kết quả phân tích rƣợu thành phẩm ............................................ 39 DANH MỤC HÌNH Hình 3.1. Ảnh chụp nấm men trên môi trƣờng thạch nghiêng ...................... 25 Hình 3.2. Ảnh chụp khuẩn lạc nấm men H1 trên môi trƣờng thạch đĩa ......... 25 Hình 3.3. Ảnh chụp tế bào nấm men H1 trên kính hiển vi quang học ............ 26 Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn động thái phát triển của chủng nấm men trong môi trƣờng nhân giống ........................................................................ 32 Hình 3.5. Biểu đồ biểu diễn hàm lƣợng đƣờng sót trong dịch lên men ở các hàm lƣợng đƣờng khác nhau......................................................... 34 Hình 3.6. Biểu đồ biểu diễn hàm lƣợng cồn trong dịch lên men ở các hàm lƣợng đƣờng khác nhau ................................................................ 34 Hình 3.7. Biểu dồ biểu thị độ pH trong dịch lên men ở các hàm lƣợng đƣờng khác nhau ..................................................................................... 35 Hình 3.8. Động thái sinh trƣởng của quá trình lên men ................................ 37 Hình 3.9. Động thái sinh trƣởng của chủng nấm men H1 ở các hàm lƣợng đƣờng khác nhau .......................................................................... 39 MỞ ĐẦU 1. Lí do chọn đề tài Từ xa xƣa, con ngƣời đã biết cách tạo ra rƣợu và sử dụng rƣợu mặc dù chƣa hiểu biết rõ bản chất và quá trình tạo ra rƣợu. Rƣợu đã trở thành một thứ đồ uống phổ biến và ƣa chuộng trên toàn thế giới. Hằng năm trên thế giới xuất khoảng 29 tỷ lít rƣợu vang. Trong đó các nƣớc sản xuất nhiều nhất là: Pháp, Ý, Angiêri [17]. Tuyệt đại đa số các loại rƣợu vang sản xuất từ quả nho nên danh từ “vang nho” đồng nghĩa với danh từ vang. Ở các nƣớc nhiệt đới nóng ẩm nhƣ nƣớc ta thì diện tích trồng nho còn hạn hẹp, chất lƣợng nho còn thấp mà các loại hoa quả nhiệt đới giàu đƣờng, axit, vitmin, khoáng lại rất phong phú. Vì vậy, chúng ta có thể sản xuất rƣợu vang từ các loại quả khác nhau: mơ, vải, táo, dứa… có chất lƣợng cao và hƣơng vị đặc trƣng. Ở Việt Nam, nghành sản xuất rƣợu vang mới thực sự bắt đầu từ những năm 80 của thế kỷ XX và đƣợc đánh dấu bằng sự xuất hiện của nhà máy vang Thăng Long, sau đó là một số nhà máy khác: vang Gia Lâm, vang Đà Lạt… Thực tế cho thấy phần lớn các loại quả chứa đƣờng, axit, vitamin, khoáng… và không độc hại đều có thể sử dụng để lên men vang, nhƣng để có vang tốt thì không phải loại quả nào cũng làm đƣợc. Do đó việc lựa chọn nguyên liệu phù hợp với yêu cầu công nghệ và cho sản phẩm vang có chất lƣợng cao, từng bƣớc hội nhập vào thị trƣờng khu vực và quốc tế cho đến nay vẫn là vấn đề cấp thiết đối với nghành sản xuất vang ở nƣớc ta. Nho Cabernet sauvignon là một giống nho nhỏ, tròn, có màu đen với vỏ rất dày và cứng cáp. Chính những đặc tính đó kết hợp với hƣơng vị đƣợc ƣa thích nên Cabernet sauvignon là một trong những loại nho đỏ làm rƣợu vang phổ biến nhất trên thế giới. Lớp vỏ đặc biệt dày của giống nho này mang 1 lại cho rƣợu vang nồng độ tannin khá cao, nhờ vậy làm cho loại rƣợu vang này có đặc tính biến đổi theo thời gian. Rƣợu vang mới đƣợc làm từ loại nho này có cấu trúc vững chắc và có vị chát rất khó dùng [25]. Hiện nay, ở một số tỉnh miền núi nƣớc ta có cây táo mèo cho quả có vị thơm rất đặc trƣng. Yên Bái là một trong tỉnh cho sản lƣợng táo mèo lớn. Trong đó chỉ có khoảng 30-35% tổng sản lƣợng quả thu hoạch đƣợc sử dụng vào hình thức: ăn trực tiếp, ngâm rƣợu, ngâm dịch siro… số còn lại thƣờng bị bỏ phí do không có nguồn tiêu thụ tại chỗ, vận chuyển khó khăn hoặc giá thành rẻ. Trong khi đó đời sống bà con các dân tộc ở những nơi này còn gặp nhiều khó khăn. Mỗi loại quả khi lên men sẽ cho ra một loại vang riêng với hƣơng vị đặc trƣng. Nhƣng nếu kết hợp khéo léo giữa các loại quả khác nhau (ví dụ nhƣ táo mèo và nho Cabernet sauvignon) thì có thể tạo ra một loại vang mới có chất lƣơng cao hơn và cho hƣơng vị độc đáo. Nghành sản xuất vang ở Việt Nam đang trên đà phát triển với ngày càng nhiều sản phẩm phong phú cả về chủng loại lẫn chất lƣợng. Tuy nhiên đây là ngành sản xuất khá mới và đang trên đƣờng tìm kiếm nguồn nguyên liệu phù hợp. Táo mèo và nho Cabernet sauvignon là hai nguyên liệu hoàn toàn có thể đáp ứng yêu cầu trên. Hơn nữa, khai thác hai loại quả này cho nghành công nghiệp chế biến và rƣợu vang sẽ góp phần nâng cao thu nhập và cải thiện đời sống cho nhân dân vùng cao (đặc biệt đối với Yên Bái). Chính vì những lí do trên tôi đã chọn và tiến hành nghiên cứu đề tài: “Tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men rượu vang phối hợp hợp từ táo mèo và nho Cabernet sauvignon” 2. Mục đích nghiên cứu Tuyển chọn đƣợc chủng nấm men có khả năng lên men vang phối hợp táo mèo và nho Cabernet sauvignon. Đề xuất công trình công nghệ sản xuất rƣợu vang phối hợp từ quả táo 2 mèo và nho Cabernet sauvignon. 3. Nội dung nghiên cứu 3.1. Phân lập chủng nấm man có khả năng lên men vang phối hợp táo mèo và nho Cabernet sauvignon. 3.2. Tuyển chọn và xác định tên khoa học chủng nấm men có khả năng lên men vang phối hợp táo mèo và nho Cabernet sauvignon. 3.3. Nghiên cứu động thái phát triển của chủng nấm men H1 trong môi trƣờng nhân giống 3.4. Ảnh hƣởng của các tác nhân nhƣ: hàm lƣợng đƣờng, hàm lƣợng men giống tới quá trình lên men vang phối hợp táo mèo và nho Cabernet sauvignon. 3.5. Ứng dụng lên men vang phối hợp và xây dựng quy trình sản xuất vang phối hợp ở quy mô phòng thí nghiệm. 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 4.1. Tuyển chọn để tìm ra chủng nấm men có đặc tính sinh lý, sinh hóa có khả năng lên men hỗn hợp táo mèo và nho Cabernet sauvignon. 4.2.Tận dụng nguồn nguyên liệu có sẵn của địa phƣơng nhằm sản xuất một loại vang phù hợp với thị hiếu của ngƣời tiêu dung, góp phần làm phong phú thị trƣờng vang trong nƣớc và nâng cao thu nhập cho đồng bào dân tộc vùng cao. 5. Điểm mới của đề tài Tuyển chọn đƣợc 3 chủng nấm men Saccharomyces có đƣờng kính khuẩn lạc lớn đƣa vào nghiên cứu, trong đó tôi chọn ra 1 chủng nấm men Saccharomyces tốt nhất có khả năng lên men vang phối hợp từ táo mèo và nho Cabernet sauvignnon. 3 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về đối tƣợng 1.1.1. Táo mèo và nho Cabernet sauvignon Táo mèo Hiện nay, ở một số tỉnh miền núi nƣớc ta có cây táo mèo cho quả có vị thơm rất đặc trƣng. Yên Bái là một trong tỉnh cho sản lƣợng táo mèo lớn [6]. Trong đó chỉ có khoảng 30-35% tổng sản lƣợng quả thu hoạch đƣợc sử dụng vào hình thức: ăn trực tiếp, ngâm rƣợu, ngâm dịch siro… số còn lại thƣờng bị bỏ phí do không có nguồn tiêu thụ tại chỗ, vận chuyển khó khăn hoặc giá thành rẻ. Trong khi đó đời sống bà con các dân tộc ở những nơi này còn gặp nhiều khó khăn. Nho Cabernet sauvignon Đây là giống nho nổi tiếng nhất thế giới, đƣợc tạo ra nhờ sự kết hợp giữa hai dòng nho Sauvignon trắng và Cabernet Franc. Sự lai tạo này đƣợc cho là thực hiện từ cách đây hơn 3 thế kỷ tại nơi nào đó trong vùng Gironde – Pháp. Giống nho này thích ứng tốt với những điều kiện tự nhiên khác nhau và đƣợc trồng khắp các vƣờn nho trên thế giới. Đặc tính tiêu biểu của giống nho này: Màu đỏ thẫm, có nhiều mùi thơm của trái cassis, rƣợu vang đƣợc làm từ giống nho này khi còn trẻ có màu đỏ gạch, mang nhiều mùi hƣơng gỗ thông tuyết, nó giúp tạo nên những loài vang trữ lâu năm. Chúng có tác dụng giảm cholesteron, bảo vệ thành mạch máu trong cơ thể. Điều này giải thích tại sao uống rƣợu vang đỏ lại có tác dụng tốt cho tim mạch. Ngoài ra, nho còn giúp đào thải các chất độc trong cơ thể, làm tăng cƣờng sức đề kháng. Nho đƣợc sử dụng rất phổ biến, dùng để ăn tƣơi, dịch siro và chế biến rƣợu vang [24]. 4 1.2. Khái quát chung về lên men rƣợu vang 1.2.1. Khái niệm rượu vang Rƣợu vang là một sản phẩm lên men không qua chƣng cất từ dịch ép trái cây (nho, táo mèo, mơ, dâu) của một số chủng nấm men. 1.2.2. Thành phần và giá trị dinh dưỡng của rượu vang Cồn etanon: Do lên men tự nhiên từ dịch trái cây vì vậy không lẫn anđehit, este. Đọ cồn của rƣợu vang từ 10% - 13%V, nhiều ngƣời uống đƣợc. Chất bổ dưỡng: Đƣờng trong rƣợu vang từ 6,2 g/l – 13,2 g/l, chủ yếu là đƣờng fructozo, glucozo và một ít galactozo. Chứa một lƣợng phong phú các loại muối với hàm lƣợng thấp. Chúng giữ vai trò làm tăng hƣơng vị và giá trị dinh dƣỡng của rƣợu vang. Rượu vang giàu vitamin: Vitamin có troang nƣớc hoa quả không bị quá trình lên men phân hủy. Các axitamin: có vai trò quan trọng đối với sự sinh sản và phát triển của nấm men. Ngoài lƣợng axitamin có sẵn trong dịch hoa quả, quá trình lên men vang cũng tạo thêm một số axitamin đã làm cho vang thành phẩm có hƣơng vị đặc trƣng. Các axitamin nhƣ: lizin, treonin, valin, … [15]. 1.2.3. Nguyên liệu sản xuất rượu vang Có rất nhiều nguồn nguyên liệu để sản xuất rƣợu vang. Trên thị trƣờng quốc tế có thể nói nho là nguyên liệu phổ biến cho sản xuất rƣợu vang nho, nhƣng hiện nay rƣợu vang phối hợp táo mèo và nho Cabernet sauvignon đƣợc sử dụng khá rộng rãi, có nhiều vitamin C, có đầy đủ các chất khoáng và có lƣợng protein đáng kể. Với nguyên liệu chính táo mèo và nho Caernet sauvigon ngâm với đƣờng để thu dịch nƣớc quả dùng cho lên men: Nho: chất lƣợng tốt hƣơng, vị đậm đà, vị ngọt, nóng của cồn cân đối với vị chua chát của axit. Thành phần hóa học của nho có (%): 10-30 đƣờng (glucose, fructose, saccharose); 0,5-0,7 axit hữu cơ (axit tactaric, axit malic); 5 0,1-0,9 các chất protein; 0,1-0,5 chất khoáng; có các vitamin C, B1, B2, cùng các chất thơm. Ngoài nho các loại quả khác nhƣ: dâu, dứa, mơ, mận, táo, cũng là nguyên liệu để sản xuất rƣợu vang [22]. Thành phần hóa học của quả, điều kiện chăm sóc, khí hậu… có ảnh hƣởng lớn đến chất lƣợng rƣợu vang. Thành phần hóa học của một số loại quả đƣợc dẫn ra ở bảng 1.1 [16]. Bảng 1.1. Thành phần hóa học của một số loại quả Tên quả Thành phần hóa học cơ bản (%) Nƣớc Đƣờng Acid Pectin Tanin Dâu 84,74 9,19 0,49 0,31 0,035 Dứa 54,3 3,9 0,6 0,249 0,83 Mơ 73,8 9,0 1,1 0,249 0,83 Táo mèo 84 4,8 1,45 0,249 0,83 1.2.4. Phân loại vang Rƣợu vang là một loại nƣớc giải khát thơm ngon giàu chất bổ dƣỡng với độ cồn nhẹ và có hƣơng thơm từ trái cây còn giữ lại trong rƣợu.hiện nay trên thị trƣờng có nhiều loại rƣợu vang, để thuận tiện ngƣời ta tiến hành phân loại vang theo nhiều cách nhƣ màu sắc hàm lƣợng đƣờng, hàm lƣợng axit, tiêu chí của chất có ga, tiêu chí tuổi thọ…vì vây chia vang thành hai nhóm là vang có ga và vang không có ga [3], [4], [5]. Căn cứ theo màu sắc của sản phẩm: vang đỏ, vang trắng, vang hồng. Theo tiêu chí hàm lƣợng đƣờng: - Vang khô: chứa dƣới 2g đƣờng/lít rƣợu - Vang bán thô: từ 2g đến 30g đƣờng/lít rƣợu - Vang mềm: từ 30g đến 50g đƣờng/lít rƣợu 6 - Vang ngọt: trên 50g đƣờng/lít rƣợu - Dựa vào tiêu chí của chất có ga: vang êm và vang sủi. 1.3. Hệ vi sinh vật tham gia vào quá trình lên men 1.3.1. Nấm men 1.3.1.1. Sơ lược về nấm men Nấm men là tên chung chỉ nhóm nấm men có cấu tạo và sinh sản bằng cách nảy chồi, cũng có khi theo hình thức phân cắt tế bào. Chúng phân bố rộng rãi khắp nơi: đất trồng nho, nơi trồng hoa quả, nơi sản xuất rƣợu vang, nhất là trong môi trƣờng chứa đƣờng và pH thấp [6]. 1.3.1.2. Hình thái và cấu trúc của tế bào nấm men Saccharomyces cereciviae Hình thái: Tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae (S.cerevisiae) có dạng hình ovan hoặc hình trứng. Kích thƣớc nấm men 2-8µm x 4-10µm. Hình dạng này tùy thuộc vào tuổi của tế bào. Mặc dù cấu tạo đơn bào nhƣng nấm men mang đầy đủ tính chất của một cơ thể sống. Cấu tạo: nấm men có cấu tạo tế bào khá phức tạp, gần giống nhƣ tế bào thực vật. Có đầy đủ các cấu tạo thành tế bào, màng tế bào chất, ty thể, riboxom, nhân, không bào và các hạt dự trữ. Thành tế bào: Thành tế bào nấm men đƣợc cấu tạo bởi hai lớp phân tử bao gồm 90% là hợp chất glucan và mannan, phần còn lại là protein, lipit và glucozamin. Glucan là hợp chất cao phân tử của D – Glucoza, mannan là hợp chất cao phân tử của D – Manoza. Trên thành tế bào có nhiều lỗ, qua đố chất dinh dƣỡng đƣợc hấp thu và các sản phẩm của quá trình trao đỏi chất đƣợc thải ra. Màng nguyên sinh chất: Màng nguyên sinh chất của tế bào nấm men dày khoảng 8nm có cấu tạo tƣơng tự nhƣ màng nguyên sinh chất của vi khuẩn. Tế bào chất: Nấm men cũng nhƣ tế bào chất của vi khuẩn, độ nhớt của 7 tế bào chất cao hơn của nƣớc 800 lần. Nhân tế bào: Nhân tế bào nấm men là điển hình, có dịch nhân bên trong là chất dịch nhân. Cũng nhƣ nhân của tế bào sinh vật bậc cao, nhân của tế bào nấm men ngoài ADN còn có protein và nhiều loại men. Hạch nhân của tế bào nấm men không chỉ có một phân tử ADN nhƣ ở vi khuẩn mà có cấu tạo nhiễm sắc thể điển hình và có quá trình phân bào nguyên nhiễm gọi là gián phân. Quá trình gián phân gồm bốn giai đoạn nhƣ ở sinh vật bậc cao. Số lƣợng nhiễm sắc thể trong tế bào nấm men cũng khác nhau ở tế bào nấm men. S.cerevisiae là nhóm phân bố rộng rãi nhất có nhiễm sắc thể đơn bội n = 17, ở thể lƣỡng bội 2n = 34. Ngoài ra nhiễm sắc thể trong nhân tế bào còn chứa từ 50 – 100 plasmid có cấu tạo một phân tử ADN dạng vòng kín có kích thƣớc 2mm có khả năng sao chép độc lập mang thông tin di truyền. Ty thể: Khác với vi khuẩn, nấm men đã có ty thể giống nhƣ ở tế bào bậc cao, đó là cơ quan sinh năng lƣợng của tế bào. Ty thể của nấm men có hình bầu dục, đƣợc bao bọc bởi hai lớp màng, màng trong gấp khúc thành nhiều tấm răng lƣợc hoặc nhiều ống nhỏ làm cho diện tích bề mặt của màng trong tăng lên. Riboxom: có hai loại: loại 80S gồm 2 tiểu thể 60S và 40S nằm trong tế bào chất, một số khác gắn với màng tế bào chất. Một số nghiên cứu chứng minh rằng: Các riboxom gắn với màng tế bào chất có hoạt tính tổng hợp protein cao hơn. Loại 70S là loại riboxom có trong ti thể. Ngoài các cơ quan trên, nấm men còn có không bào và hạt dự trữ volutin. Bào tử: Nhiều nấm men có khả năng hình thành bào tử, đó là một hình thức sinh sản của nấm men. Có hai loại bào tử : bào tử bắn và bào tử túi [7], [9]. 1.3.1.3. Sinh sản của tế bào nấm men Nấm men sinh sản dƣới hai hình thức: vô tính và hữu tính Sinh sản vô tính gồm: sinh sản bằng hình thức nảy chồi và sinh sản 8 bằng hình thức phân chia. Phổ biến nhất là hình thức nảy chồi.Khi tế bào phát triển đến một mức nhất định thì cơ thể của nó đâm ra một chồi mới gọi là mầm (hay chồi). Mầm sinh ra ở một tƣ thế lệch tâm ở trên đầu tế bào mẹ. Cùng một lúc tế bào có thể đâm ra nhiều chồi, ở mỗi chồi sẽ nhận đƣợc một phần chất nhân và chất nguyên sinh của tế bào mẹ, sau đó nó tách ra khỏi tế bào mẹ sống độc lập không tách khỏi mà tạo thành những chồi nhỏ liên kết với nhau tạo thành một chuỗi khuẩn ty giả [8]. Sinh sản hữu tính: do hai tế bào nấm men kết hợp với nhau hình thành hợp tử. Hợp tử phân chia thành các bào tử nằm trong nang, nang chín bào tử đƣợc phát ra ngoài. Nếu hai tế bào nấm men có kích thƣớc giống nhau tiếp hợp với nhau thì đƣợc gọi là tiếp hợp đẳng giao, hai tế bào nấm men khác nhau thì đƣợc gọi là tiếp hợp dị giao. Nấm men cũng có hình thức sinh sản bằng bào tử. Bào tử túi đƣợc hình thành trong túi bào tử nhỏ gọi là nang, trong nang có từ 1-8 bào tử đôi khi có đến 12 bào tử. Đó là quá trình tạo bào tử riêng rẽ không qua quá trình tiếp hợp. Bào tử sau khi ra khỏi túi gặp điều kiện thuận lợi sẽ phát triển thành tế bào nấm men mới. Tiếp theo là quá trình nảy chồi [9]. 1.3.1.4. Vai trò của chủng nấm men S.cereviae tới quá trình lên men rượu vang Nấm men có thể sử dụng đƣờng glucose và fructose trong dịch quả và chuyển hóa chúng theo con đƣờng đƣờng phân pyruvat. Qúa trình này cung cấp năng lƣợng và chất khử để phục vụ sinh tổng hợp cho tế bào.Trong điều kiện kỵ khí, nấm men loại CO 2 khỏi pyruvat trong phản ứng xúc tác bởi enzyme pyruvat decarboxylase tạo ra axetanlđehyt và CO 2. Tiếp theo, acetalđehyt khử thành ethanol dƣới tác động của enzyme alcohol ddehydrogenaasse và NADH. 9 1.3.2. Vi khuẩn lactic Trong dịch quả cũng nhƣ trong rƣợu vang có rất nhiều vi khuẩn. Những loại này có tác dụng cải tạo hƣơng vị cho rƣợu vang hoặc làm xấu hƣơng vị, thậm trí làm hỏng rƣợu vang. Đặc biệt có sự tham gia của vi khuẩn lactic. Vi khuẩn lactic trong dịch quả cũng nhƣ trong vang thƣờng gặp khá nhiều loại vi khuẩn lactic, trong đó có nhiều loài cần thiết cho quá trình sản xuất rƣợu vang từ các loại quả giàu axit malic. Ví dụ các chủng vi khuẩn lên men lactic thuộc các giống Pediococus và Leuconostoc. Ngày nay, ngƣời ta xác định cả các vi khuẩn lactic đồng hình nhƣ : Lactobacillus plantanrum, L.casie và các chủng lên men lactich dị hình: L.buchneri, L.brevis đều có thể lên men [13]. 1.3.3. Nấm mốc Phát triển ở quả, chất bã của quá trình sản xuất rƣợu vang, thùng chứa thiết bị hoặc không khí mang đến. Đại diện: chi Rhizopus, Aspergillus. 1.3.4. Vi sinh vật làm hỏng vang Một số vi sinh vật tồn tại khá nhiều trong rƣợu vang gây hỏng rƣợu vang, vang bị đục, có vị chua gắt, mùi khó chịu nhƣ: Bacterium gracile, Acetobacter xylium, Acetobacter aceti [7]. 1.3.5. Bệnh vang Là hiện tƣợng rƣợu vang bị chua chất lƣợng rƣợu vang bị giảm rất nhanh. Nguyên nhân là do vang bị tiếp xúc với không khí và do dƣới tác dụng của vi khuẩn axetic đã biến cồn thành axit axetic. Hoặc có thể do vi sinh vật lên men trong điều kiện kỵ khí gây ra [20]. Một số bệnh vang thƣờng gặp: Bệnh vang dính Đặc điểm: vang chảy không đều, lỏng nhƣ nƣớc mà dính lại nhƣ hồ. Bệnh này thƣờng kéo dài hơn bệnh chua và bệnh đắng. Do vi khuẩn lactic đặc 10 biệt là do Leuconostoc tiết ra một loại đƣờng riêng là dextran gây nên bệnh vang dính. Bệnh vang đắng Đặc điểm: Rƣợu vang có vị chua và có vị vang đắng. Do vi khuẩn lactic phá hủy glixerin tạo thành acrolrin. Vang chua lactic Đặc điểm: Rƣợu có mùi khó chịu. Khi quả quá ngọt hoặc cho thêm quá nhiều đƣờng, kĩ thuật lên men thấp, làm cho nấm men ngừng hoạt động, hoặc do cấy nấm men chƣa đủ, nhiệt độ cao và thiếu oxy,... vi khuẩn lactic sẽ chuyển hóa đƣờng khử thành đƣờng manit và axit bay hơi. Vang bị đục Vang có màu đục không trong. Do xuất hiện những kết tủa màu trong rƣợu hay sự oxy hóa của thành phần polyphenol có trong nguyên liệu làm rƣợu, hoặc do sự tạo thành kết tủa bông protein của thành phần tanin trong rƣợu và một số dạng kết tủa khác. Bệnh chua giấm Rƣợu có mùi giấm. Do vi khuẩn acetic chuyển hóa cồn trong rƣợu thành axetic [16]. 1.4. Các yếu tố ảnh hƣởng tới quá trình sinh trƣởng và phát triển của nấm men 1.4.1. Nguồn cacbon Hợp chất cacbon chiếm vị trí hàng đầu cho sự sống của nấm men. Cacbon có trong tế bào chất, thành tế bào, trong tất cả các phản ứng enzyme và sản phẩm trao đổi chất. Nguồn cacbon cung cấp chủ yếu cho nấm men Saccharomyces cerevisia đƣợc lấy chủ yếu từ các nguồn đƣờng: glucoza, saccharoza, fructoza. 11 Nguồn cacbon đáp ứng đƣợc 3 nhu cầu cơ bản của nấm men: - Sản sinh ra năng lƣợng thông qua quá trình oxi hóa khử. - Tạo thành những tiền chất. - Tham gia vào các quá trình oxi hóa khử. 1.4.2. Nguồn photpho vô cơ Photpho có vai trò quan trọng đối với tế bào nấm men, là nguyên liệu tổng hợp acid nucleic, các enzyme, các hợp chất cao năng ATP, ... 1.4.3. Nguồn nitơ vô cơ Nitơ là thành phần cấu tạo nên tế bào. Nguồn nitơ dƣợc nấm men lấy từ các hợp chất vô cơ và hợp chất hữu cơ. Do vậy, khi nhân giống nấm men ngƣời ta thƣờng bổ sung thêm lyzin,arginin hoặc (NH4)2SO4 để tăng cƣờng khả năng sinh sản cho nấm men [14]. 1.4.4. Nguồn oxi Hầu hết các chủng nấm men trong lên men rƣợu vang thuộc giống Saccharomyces. Chúng là nhóm vi sinh vật kỵ khí tùy tiện. Khi môi trƣờng đủ lƣợng oxi nấm men phân hủy đƣờng dùng làm nguồn năng lƣợng và cấu tạo tế bào tăng sinh sinh khối. 1.4.5. Các nguyên tố khoáng Sự trao đổi của tế bào nấm men cần các nguyên tố khoáng nhƣ: Ca, P, Mg, S,... chúng đóng vai trò quan trọng trong sự hình thành màng và nhân tế bào Ca, Mg là trung tâm chuyển hóa của nhiều loại enzyme tham gia vào quá trình chuyển hóa đƣờng thành rƣợu. 1.4.6. Nước Nƣớc là thành phần không thể thiếu vì nó là môi trƣờng sinh sống của tế bào nấm men. 1.4.7. Các vitamin Một số vitamin nhƣ B1, biotin, vitamin E... có tác dụng rất tốt đến sự sinh trƣởng và phát triển của nấm men. Nhiều loại vitamin còn có tác dụng tăng cƣờng sự hoạt hóa của một số enzyme trong quá trình lên men rƣợu [14]. 12 1.5. Yêu cầu của việc lựa chọn chủng nấm men lên men vang Có năng suất lên men cao, tốc độ lên men lớn. Chịu cồn cao. Chịu pH thấp. Có hương thơm đặc trưng. Dễ lắng trong và dễ lọc. 1.6. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình lên men 1.6.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ Nhiệt độ lên men có ảnh hƣởng trực tiếp đến các phản ứng sinh hóa trong tế bào nấm men. Nếu nhiệt độ < 200C: sự lên men diễn ra chậm chạp, độ rƣợu đƣợc tạo thành thấp. Nhiệt độ < 100C: không diễn ra quá trình lên men. Nhiệt độ ở 350C: nguy hiểm cho quá trình lên men, nấm men mặc dù không chết nhƣng mất tác dụng. Nhiệt độ > 350C: quá trình lên men dừng lại, lƣợng đƣờng sót lại còn cao, vi khuẩn hoạt động, đặc biệt là nhiều vi khuẩn chuyển hóa đƣờng thành axit acetic gây chua, làm giảm chất lƣợng vang. Nhiệt độ thích hợp nhất cho nấm men phát triển là 26-280C [20]. 1.6.2. Ảnh hưởng của hàm lượng đường và men giống Hàm lƣợng đƣờng thích hợp cho lên men vang là 12-25%V và tới 30%V sẽ ức chế mạnh mẽ quá trình lên men. Tỷ lệ các loại đƣờng có trong dịch lên men cũng ảnh hƣởng lớn tới tốc độ và hiệu suất lên men, glucose là loại đƣờng phù hợp nhất cho sự sinh sản và phát triển của nấm men cũng nhƣ quá trình lên men rƣợu vang, tiếp đó là đƣờng fructose và saccharose... Vì vậy quả có chứa hàm lƣợng đƣờng khử càng cao thì càng có lợi cho quá trình lên men cũng nhƣ đến chất lƣợng vang thành phẩm [14]. 13 Hàm lƣợng men giống : hàm lƣợng men giống đóng vai trò quan trọng đến quá trình sinh trƣởng cũng nhƣ quá trình lên men của nấm men. Hàm lƣợng tế bào nấm men có trong dịch lên men càng thấp thì thời gian lên men càng kéo dài hơn, dễ bị nhiễm vi khuẩn. Ngƣợc lại hàm lƣợng men giống trong dịch lên men càng cao thì thời gian lên men ngắn hơn, hạn chế đƣợc khả năng nhiễm khuẩn. Nhƣng hàm lƣợng men giống quá cao sẽ làm thay đổi thành phần môi trƣờng lên men và sẽ không có lợi cho quá trình lên men và chất lƣợng rƣợu vang. Nhìn chung, hàm lƣợng men giống thích hợp cho quá trình lên men khoảng 10% [21]. 1.6.3. Ảnh hưởng của độ pH Trong quá trình nuôi cấy pH môi trƣờng luôn bị biến đổi đƣợc điều khiển bởi sự sinh sản của nấm men.Vào giai đoạn cuối cùng pH tăng một ít do điều kiện môi trƣờng bắt đầu khan hiếm chất dinh dƣỡng và hoạt lực của enzyme trong tế bào lớn. Nấm men lúc đó tự phân huỷ và giải phóng NH3. Đối với dịch quả thƣờng có độ pH từ 2,8 – 3,8. Khoảng pH này nấm men vẫn hoạt động đƣợc, vùng pH tối thích của nấm men là 4 – 6. Trong sản xuất rƣợu vang ngƣời ta thƣờng sử dụng môi trƣờng dịch quả có pH 3,0 – 3,5. 1.6.4. Ảnh hưởng của nồng độ cồn Nấm men phát triển tốt nhất ở nồng độ cồn thích hợp là 9 – 14%V. Trong quá trình lên men nồng đổ rƣợu tăng dần sẽ gây ức chế hoạt động sống của nấm men và kìm hãm hoạt động của nhiều loại enzyme chuyển hoá đƣờng thành rƣợu.Vì vậy, khả năng chịu cồn và lên men tốt trong môi trƣờng có nồng độ cồn thích hợp là một tiêu chí để tuyển chọn chủng nấm men cho quá trình sản xuất rƣợu vang [14]. 1.6.5. Ảnh hưởng của thời gian lên men Thời gian là yếu tố quan trọng ảnh hƣởng đến chất lƣợng sản phẩm vang. Trong thời gian lên men chính, nếu thời gian lên men quá ngắn, lƣợng 14 cồn tạo ra quá ít. Trong thời gian lên men phụ, nếu thời gian lên men không đủ để hƣơng hình thành, mùi vang sẽ không đặc trƣng. Nhìn chung thời gian lên men chính tốt nhất là 7 – 20 ngày. Thời gian lên men phụ và tàng trữ vang phải vài tháng trở lên [1]. 1.6.6. Những biến đổi sinh lí, sinh hóa, vi sinh trong quá trình lên men rượu vang Saccharomyces là chủng nấm men đƣợc sử dụng rộng rãi nhất, chủng này có hàm lƣợng đƣờng cao. PTTQ của sự lên men: C6H12O6 → CH3 CH2 OH + 33 Kcal Qúa trình lên men đƣờng thành rƣợu là một dãy phản ứng oxi hoá khử nhờ hệ enzim trong tế bào nấm men. Qúa trình biến đổi đƣờng thành rƣợu là chuỗi các phản ứng diễn ra phức tạp gồm 5 giai đoạn sau: - Giai đoạn 1: Biến đổi glucozo thành fructozo – 1,6 điphotphat dƣới tác dụng của enzym hexokinaza và isomeraza. - Giai đoạn 2: Từ fructozo – 1,6 điphotphat biến đổi thành 3 – photphoglixeraldehit và photphodioxiaxeton dƣới tác dụng của enzim andolaza. - Giai đoạn 3: Trƣớc hết là 3 – photphoglixeraldehit sẽ biến đổi thành photphoglyxerat và tiếp tục biến đổi thành 2 - photphoglyxerat nhờ xúc tác của các enzim photphoglyxeratmutaza. Sản phẩm cuối cùng của giai đoạn này là sự biến đổi 2 – photphoglyxerat thành axit piruvic dƣới tác dụng của enzim andolaza và kinaza. - Giai đoạn 4: Axit piruvic phân cắt thành axetaldehit đồng thời giải phóng CO2 dƣới tác dụng của enzimdecacboxylaza. - Giai đoạn 5: Tạo thành etanol từ axetandehit nhờ tác dụng của enzim alcoldehydrogenaza [2]. 15 1.7. Tình hình sản xuất rƣợu vang 1.7.1. Tình hình sản xuất rượu vang trên thế giới Rƣợu gắn liền với đời sống văn hóa, tâm linh, kinh tế, xã hội của mỗi cộng đồng. Do tác động quá lớn của rƣợu tới sức khỏe, đời sống con ngƣời nên việc nghiên cứu, sản xuất rƣợu vang không ngừng đƣợc hoàn thiện phát triển và có nững nét đặc thù riêng của mỗi nƣớc, mỗi cộng đồng quốc gia. Sản xuất rƣợu trên thế giới có tốc độ gia tăng mạnh trong vài năm trở lại đây, do nhiều nguyên nhân khác nhau nhƣng chủ yếu do mức sống ngƣời dân tăng lên, tốc độ tăng dân số, tiến bộ của khoa học công nghệ làm cho chất lƣợng, sản lƣợng rƣợu vang tăng, giá thành hạ.Theo thống kê của hiệp hội vang quốc tế: năm 1995 mức tiêu thụ bình quân theo đầu ngƣời của một số quốc gia nhƣ sau: CH.Pháp ≈ 62 lít/năm; Italia ≈ 62 lít/năm; Bỉ ≈ 60 lít/năm; Bồ Đào Nha ≈ 60 lít/năm; Argentina ≈ 45 lít/năm Ở thị trƣờng Châu Á và Châu Úc năm 1995 với sản lƣợng 1 tỷ lít thì: Trung Quốc 300 triệu lít, Úc khoảng 500 triệu lít, Newzealand 50 triệu lít, Nhật Bản 50 triệu lít còn lại là một số quốc gia khác nhƣ Thái Lan, Malaysia, Indonesia, Philippin đều đạt trên 10 triệu lít… Trong vài năm gần đây, rƣợu vang của Ấn Độ và Trung Quốc đã ra nhập thị trƣờng quốc tế và sắp tới sản phẩm của họ sẽ đƣợc bày bán tại các quốc gia vốn nổi tiếng về rƣợu vang nhƣ Pháp, Mỹ,... Hiện nay, mỗi năm Ấn Độ xuất khẩu hơn 250.000 chai vang hảo hạng [25]. Rƣợu vang là sản phẩm đƣợc ƣa chuộng trên thế giới vì hầu hết trong tất cả các buổi lễ gia đình nó là một trong những đồ uống không thể thiếu đƣợc. Nó trở thành thức uống xa xƣa của ngƣời Âu – Mĩ. Trong đó Châu Âu đứng đầu thế giới về sản xuất rƣợu vang với 80%, tổng sản lƣợng rƣợu vang thế giới, Châu Mĩ 14%, Châu Phi 5%, Châu Á – Úc 0.5%. Thị trƣờng rƣợu vang theo số liệu thống kê năm 2001 đƣợc thể hiện ở bảng dƣới đây: 16 Pháp 41,7% Italia 17,2% Spain 9,2% Úc 4,8% Bồ Đào Nha 4,3% Đức 4,3% Sản lƣợng vang toàn cầu đã đạt mức đỉnh vào năm 2004 khi cung vƣợt cầu khoảng 600 triệu thùng (1 thùng gồm 12 chai, tƣơng đƣơng với 9 lít) và đang trên đà giảm sút kể từ đó đến nay. Năm 2013 sản lƣợng vang toàn cầu có thể đƣợc coi là tƣơng đối cao, mang đến hy vọng về một sản lƣợng vang cao trong những năm kế tiếp. 1.7.2. Tình hình sản xuất rượu vang trong nước Hiện nay, rƣợu vang nƣớc ta cũng đã trở thành thức uống phổ biến trong những bữa tiệc. Theo thống kê của hiệp hội Rƣợu Bia và Nƣớc giải khát Việt Nam, hiện cả nƣớc có hơn 15 doanh nghiệp sản xuất và đóng chai rƣợu vang với sản lƣợng vang mỗi năm tăng khoảng 12-13 triệu lít. Bên cạnh đó Việt Nam cũng đã đang có sự góp mặt của các thƣơng hiệu vang nổi tiếng trên thế giới nhƣ: vang Đà Lạt, Anh Đào… Việt Nam là một quốc gia đông dân, vì thế sức tiêu thụ rất lớn và là nƣớc có tiềm năng trong thu hút khách du lịch, có vùng nhiệt đới khí hậu ẩm nên nghề trồng nho sản xuất rƣợu vang chỉ phát triển ở một số vùng khí hậu thích hợp nhƣ Ninh Thuận và Bắc Bình Thuận. Tuy nhiên, nho quả Việt Nam có độ chua cao, chất lƣợng nho còn thấp. Bên cạnh nguyên liệu là quả nho, các loại quả nhiệt đới nhƣ: Xoài, mơ, dứa, dâu, táo mèo,…cũng rất thích hợp để sản xuất vang. Tuy vậy, vang của Việt Nam thƣờng lên men bằng siro dịch quả nên chất lƣợng không cao (do mất đi hƣơng, vị của quả tƣơi). Bên cạnh đó còn có phƣơng pháp lên men 17 bằng cả xác quả sẽ mang lại mùi hƣơng và vị đặc trƣng của từng quả sản xuất rƣợu vang. Mức độ sản xuất rƣợu vang của Việt Nam còn thấp, đến năm 2002, trong nƣớc hiện có khoảng 10 doanh nghiệp sản xuất rƣợu vang và ƣớc tính tổng sản lƣợng vang sản xuất tại Việt Nam chỉ đạt 12,5 triệu lít. Theo hiệp hội rƣợu bia và nƣớc giải khát Việt Nam, năm 2007 trong nƣớc có hơn 15 doanh nghiệp sản xuất rƣợu vang với sản lƣợng mỗi năm khoảng 12 – 13 triệu lít. Trên thị trƣờng, ngoài các sản phẩm vang của ngƣời Việt nhƣ: vang Đà Lạt, vang Đông Đô, vang Thăng Long,… còn có rất nhiều sản phẩm vang nhập từ nƣớc ngoài nhƣ: Pháp, Úc, Chile, Mỹ,…. Đối với ngƣời Việt Nam rƣợu nói chung là một loại thức uống không thể thiếu trong các bữa tiệc, các buổi liên hoan gặp gỡ, các dịp lễ tết. Chính vì thói quen và nhu cầu lớn đó của con ngƣời nên trên thế giới đã xuất hiện nhiều công ty sản xuất rƣợu và cũng đã đƣa ra rất nhiều các sản phẩm rƣợu ngon. Lƣợng rƣợu tiêu thụ hàng năm trên thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng là rất lớn. Trong khi đó lƣợng rƣợu đạt chất lƣợng thì lại chƣa đáp ứng đƣợc nhu cầu của ngƣời tiêu dùng [24]. 18 CHƢƠNG 2 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu  Qủa táo mèo (Docynia indica) đƣợc thu nhận từ tỉnh Yên Bái.  Qủa nho Cabernet sauvignon.  Chủng nấm men đƣợc phân lập từ dịch siro phối hợp táo mèo và nho Cabernet Sauvignon có khả năng lên men vang táo mèo và nho Cabernet sauvignon. 2.2. Hóa chất, dụng cụ thiết bị 2.2.1. Hóa chất Các loại đƣờng chuẩn: saccarozo, fructozo, glucozo. Một số chất vô cơ và hữu cơ: MgSO4.7H2O; K2HPO4; (NH4)2SO4; (NH4)2HPO4; NaOH; HCl, rƣợu etylic, pepton, agar, phenolphthalein. 2.2.2. Dụng cụ thiết bị Dụng cụ: hộp hồng, ống nghiệm, pipet, bàn trang thủy tinh, phễu thủy tinh, que cấy, đèn cồn, cốc thủy tinh. Thiết bị lên men: bình cầu, bình tam giác, nồi hấp, buồng vô trùng, tủ sấy, cân kĩ thuật, kính hiển vi quang học có độ phóng đại gấp 1000 lần, buồng đếm hồng cầu. 2.3. Môi trƣờng 2.3.1. Môi trường Hansen (môi trường phân lập, MT1)(g/ml) 1. Đƣờng glucozo 50g 2. Pepton 5g 3. MgSO4.7H2O 0.5g 4. KH2PO4 1g 19 5. (NH4)2SO4 1g 6. Thạch agar 20g 7. Nƣớc cất 1000ml 2.3.2. Môi trường nhân giống (môi trường 2, MT2) (g/ml) 1. Đƣờng glucozo 50g 2. Pepton 5g 3. MgSO4.7H2O 0.5g 4. KH2PO4 1g 5. (NH4)2SO4 1g 6. Nƣớc cất 1000ml 2.3.3. Môi trường lên men (Môi trường 3, MT3) (g/ml) 1. Dịch siro hoa quả 200ml 2. MgSO4.7H2O 0.5g 3. KH2PO4 1g 4. (NH4)2SO4 1g 5. Nƣớc cất 1000ml 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu Trong công trình này tôi đã sử dụng một số phƣơng pháp nghiên cứu sau: 2.4.1. Các phương pháp vi sinh 2.4.1.1. Phương pháp phân lập tuyển chọn và bảo quản, nhân giống nấm men theo phương pháp Pasteur trên môi trường thạch đĩa. - Phƣơng pháp mà tôi sử dụng là phƣơng pháp phân lập hộp petri, môi trƣờng phân lập là môi trƣờng Hasen - Cách tiến hành: môi trƣờng phân lập đƣợc khử trùng và phân vào các hộp petri vô trùng và để nguội. Dịch hoa quả đƣợc pha loãng bằng nƣớc muối sinh lí 0,9% với độ pha loãng 10 9 -10 7 . Nhỏ 1-2 giọt huyền phù lên bề mặt thạch, dùng bàn trang đã vô trùng dàn đều 1 lƣợt. Sau đó gói kín và nuôi trong 20 tủ ấm ở 24oC-28OC. Sau 2-3 ngày, trên bề mặt thạch xuất hiện các khuẩn lạc. Ta tiến hành chọn các khuẩn lạc to, trắng bóng có hình tròn, bề mặt nhẵn bóng, trên đỉnh có một núm nhỏ, mép có thể có răng cƣa hoặc nhẵn. Khi quan sát trên kính hiển vi điện tử các tế bào có hình ovan hoặc hình trứng. Đó là đặc trƣng của khuẩn lạc tế bào nấm men. 2.4.1.2. Phương pháp hoạt hóa giống Các khuẩn lạc đƣợc chọn sẽ cấy vào thạch nghiêng để ở 24 OC-28OC trong 48 giờ, đƣợc giống cấp 1. Nấm men dung trong nhân giống tiếp đƣợc lấy từ thạch nghiêng. Để có số lƣợng nấm men lớn và có những tế bào trẻ, to, khỏe, tôi tiến hành hoạt hóa giống bằng cách nuôi trong môi trƣờng nhân giống ở 24OC-28OC trong vòng 23 giờ trên máy lắc, đƣợc giống cấp 2. Dùng giống cấp 2 để lên men. 2.4.1.3. Phương pháp xác định hoạt lực lên men của nấm men Gồm 2 phƣơng pháp sau:  Phương pháp cân bình trọng lượng: Lên men trong các bình có thể tích 250ml, môi trƣờng có cùng một lƣợng tế bào nấm men của các giống khác nhau. Sau 24 giờ lên men đem cân trọng lƣợng bình một lần khi lệch giữa hai lần cân là 0,1 thì dừng lại.  Phương pháp xác định số lượng tế bào bằng buồng đếm Goriaev: Cấy giống vào môi trƣờng nhân giống, nuôi ở 28, lắc đều canh trƣờng, dùng pipet chia độ loãng canh trƣờng. Sau đó dùng pipet lấy dung dịch pha loãng cho một giọt vào khe hở giữa lƣới đếm và kính. Chú ý: tránh để rơi xuống các rãnh tạo thành bọt khí rùi đặt lá kính lên. Để yên 3-5 phút sau đó tiến hành soi trên kính hiển vi quang học ở vật kính x100 với độ phóng đại 1000 lần. Đếm số lƣợng tế bào trong 5 ô lớn chéo nhau theo công thức sau: 21 M=A.25.50.N Trong đó: M: số lƣợng tế bào trong 1 ml dịch huyền phù N : độ pha loãng của dịch huyền phù A: số lƣợng tế bào trung bình có trong 1 ô vuông 2.4.1.4. Phương pháp quan sát tế bào nấm men trên KHV quang học có độ phóng đại 1000 lần Nấm men đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng nhân giống (MT2). Sau 24 giờ nuôi cấy ở 28oC-300C, tiến hành nhuộm tiêu bản sống với xanhmetylen. Sau đó quan sát trên KHV quang học có độ phóng đại 1000 lần. 2.4.1.5. Xác định khả năng kết lắng Hòa sinh khối nấm men vào dung dịch đệm axetat (có pH: 4,5) đƣợc đựng trong các ống nghiệm có hình dạng và kích thƣớc nhƣ nhau với thể tích dung dịch đệm và số lƣợng nấm men hòa tan bằng nhau. Lắc kỹ trên máy lắc với tốc độ 200 vòng/phút trong thời gian 3-5 phút, để lắng 15 phút. Lúc này toàn bộ khối dịch phân thành hai lớp (phía dƣới đáy của ống nghiệm là nấm men đã kết lắng). Ta tiến hành đo chiều cao của chủng nấm men trong từng ống nghiệm để xác định khả năng kết lắng của chủng nấm men. Ống nghiệm nào có chiều cao kết lắng cao nhất là chủng nấm men có độ kết lắng tốt nhất [11]. 2.4.2. Phương pháp hóa học 2.4.2.1. Phương pháp xác định hàm lượng đường bằng khúc xạ kế và xác định độ cồn bằng cồn kế 2.4.2.2. Phương pháp xác định nồng độ pH và máy đo pH 2.4.2.3. Phương pháp xác định hàm lượng axit bằng chuẩn đọ với NaOH 0,1N có phenolphthalein làm chất chỉ thị màu 2.4.2.4. Phương pháp xử ly kết quả thu được bằng thống kê toán học n Giá trị trung bình số học: X  22  Xi i 1 n n Độ lệch chuẩn:    ( Xi  X ) 2 (nếu n[...]... trình công nghệ sản xuất rƣợu vang phối hợp từ quả táo 2 mèo và nho Cabernet sauvignon 3 Nội dung nghiên cứu 3.1 Phân lập chủng nấm man có khả năng lên men vang phối hợp táo mèo và nho Cabernet sauvignon 3.2 Tuyển chọn và xác định tên khoa học chủng nấm men có khả năng lên men vang phối hợp táo mèo và nho Cabernet sauvignon 3.3 Nghiên cứu động thái phát triển của chủng nấm men H1 trong môi trƣờng nhân... chế biến và rƣợu vang sẽ góp phần nâng cao thu nhập và cải thiện đời sống cho nhân dân vùng cao (đặc biệt đối với Yên Bái) Chính vì những lí do trên tôi đã chọn và tiến hành nghiên cứu đề tài: Tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men rượu vang phối hợp hợp từ táo mèo và nho Cabernet sauvignon” 2 Mục đích nghiên cứu Tuyển chọn đƣợc chủng nấm men có khả năng lên men vang phối hợp táo mèo và nho Cabernet... hàm lƣợng men giống tới quá trình lên men vang phối hợp táo mèo và nho Cabernet sauvignon 3.5 Ứng dụng lên men vang phối hợp và xây dựng quy trình sản xuất vang phối hợp ở quy mô phòng thí nghiệm 4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 4.1 Tuyển chọn để tìm ra chủng nấm men có đặc tính sinh lý, sinh hóa có khả năng lên men hỗn hợp táo mèo và nho Cabernet sauvignon 4.2.Tận dụng nguồn nguyên liệu có sẵn của... thành từ 1 đến 8 bào tử Vì vậy, tôi tạm thời đặt tên cho 3 chủng nấm men đã đƣợc lựa chọn là Saccharomyces cerevisiae H1, H2, H3 3.2.2 Tiêu chuẩn chọn chủng nấm men có khả năng lên men vang phối hợp táo mèo và nho Cabernet sauvignon Nấm men có ảnh hƣởng tới toàn bộ quy trình sản xuất và chất lƣợng của rƣợu vang Vì vậy, phải tuyển chọn ra chủng tốt nhất để lên men Nấm men sử dụng để lên men rƣợu vang từ. .. (50% Táo 50% Nho) Dƣới đây là hình ảnh chụp khuẩn lạc, thạch nghiêng và tế bào nấm men S.cerevisiae : Hình 3.1 Ảnh chụp nấm men H1 trên môi trường thạch nghiêng Hình 3.2 Ảnh chụp khuẩn lạc nấm men H1 trên môi trường thạch đĩa 25 Hình 3.3.Ảnh chụp tế bào nấm men H1 trên kính hiển vi quang học 3.2 Tuyển chọn và xác định tên khoa học của chủng nấm men có khả năng lên men vang phối hợp táo mèo và nho Cabernet... xuất một loại vang phù hợp với thị hiếu của ngƣời tiêu dung, góp phần làm phong phú thị trƣờng vang trong nƣớc và nâng cao thu nhập cho đồng bào dân tộc vùng cao 5 Điểm mới của đề tài Tuyển chọn đƣợc 3 chủng nấm men Saccharomyces có đƣờng kính khuẩn lạc lớn đƣa vào nghiên cứu, trong đó tôi chọn ra 1 chủng nấm men Saccharomyces tốt nhất có khả năng lên men vang phối hợp từ táo mèo và nho Cabernet sauvignnon... nguyên liệu Tổng số (%) Táo mèo Nho 1 90 10 100 2 80 20 100 3 70 30 100 4 60 40 100 5 50 50 100 6 40 60 100 7 30 70 100 8 20 80 100 9 10 90 100 Trong các tỉ lệ phối hợp trên qua nghiên cứu tôi nhận thấy mẫu có tỉ lệ phối hợp 50 %táo và 50 %nho Cabernet sauvignon cho rƣợu có chất lƣợng cao hơn các mẫu còn lại 3.1.2 Phân lập chủng nấm men có khả năng lên men vang phối hợp từ táo mèo và nho Cabernet sauvignon... và phát triển của nấm men Nhiều loại vitamin còn có tác dụng tăng cƣờng sự hoạt hóa của một số enzyme trong quá trình lên men rƣợu [14] 12 1.5 Yêu cầu của việc lựa chọn chủng nấm men lên men vang Có năng suất lên men cao, tốc độ lên men lớn Chịu cồn cao Chịu pH thấp Có hương thơm đặc trưng Dễ lắng trong và dễ lọc 1.6 Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình lên men 1.6.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ Nhiệt độ lên. .. cứu Chủng nấm men S.cerevisiae đƣợc phân lập trên đối tƣợng là dịch hỗn hợp quả táo mèo và quả nho Cabernet sauvignon 2.6 Địa điểm nghiên cứu Phòng thí nghiệm Vi sinh, khoa Sinh, trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2 2.7 Thời gian nghiên cứu Tôi tiến hành đề tài bắt đầu từ ngày 08/2014 đến 04/2015 23 CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập chủng nấm men có khả năng lên men vang phối hợp từ táo. .. chất lƣợng vang Nhiệt độ thích hợp nhất cho nấm men phát triển là 26-280C [20] 1.6.2 Ảnh hưởng của hàm lượng đường và men giống Hàm lƣợng đƣờng thích hợp cho lên men vang là 12-25%V và tới 30%V sẽ ức chế mạnh mẽ quá trình lên men Tỷ lệ các loại đƣờng có trong dịch lên men cũng ảnh hƣởng lớn tới tốc độ và hiệu suất lên men, glucose là loại đƣờng phù hợp nhất cho sự sinh sản và phát triển của nấm men cũng