5. Điểm mới của đề tài
1.7. Tình hình sản xuất rƣợu vang
1.7.1. Tình hình sản xuất rượu vang trên thế giới
Rƣợu gắn liền với đời sống văn hóa, tâm linh, kinh tế, xã hội của mỗi cộng đồng. Do tác động quá lớn của rƣợu tới sức khỏe, đời sống con ngƣời nên việc nghiên cứu, sản xuất rƣợu vang không ngừng đƣợc hoàn thiện phát triển và có nững nét đặc thù riêng của mỗi nƣớc, mỗi cộng đồng quốc gia. Sản xuất rƣợu trên thế giới có tốc độ gia tăng mạnh trong vài năm trở lại đây, do nhiều nguyên nhân khác nhau nhƣng chủ yếu do mức sống ngƣời dân tăng lên, tốc độ tăng dân số, tiến bộ của khoa học công nghệ làm cho chất lƣợng, sản lƣợng rƣợu vang tăng, giá thành hạ.Theo thống kê của hiệp hội vang quốc tế: năm 1995 mức tiêu thụ bình quân theo đầu ngƣời của một số quốc gia nhƣ sau: CH.Pháp ≈ 62 lít/năm; Italia ≈ 62 lít/năm; Bỉ ≈ 60 lít/năm; Bồ Đào Nha ≈ 60 lít/năm; Argentina ≈ 45 lít/năm
Ở thị trƣờng Châu Á và Châu Úc năm 1995 với sản lƣợng 1 tỷ lít thì: Trung Quốc 300 triệu lít, Úc khoảng 500 triệu lít, Newzealand 50 triệu lít, Nhật Bản 50 triệu lít còn lại là một số quốc gia khác nhƣ Thái Lan, Malaysia, Indonesia, Philippin đều đạt trên 10 triệu lít…
Trong vài năm gần đây, rƣợu vang của Ấn Độ và Trung Quốc đã ra nhập thị trƣờng quốc tế và sắp tới sản phẩm của họ sẽ đƣợc bày bán tại các quốc gia vốn nổi tiếng về rƣợu vang nhƣ Pháp, Mỹ,... Hiện nay, mỗi năm Ấn Độ xuất khẩu hơn 250.000 chai vang hảo hạng [25].
Rƣợu vang là sản phẩm đƣợc ƣa chuộng trên thế giới vì hầu hết trong tất cả các buổi lễ gia đình nó là một trong những đồ uống không thể thiếu đƣợc. Nó trở thành thức uống xa xƣa của ngƣời Âu – Mĩ. Trong đó Châu Âu đứng đầu thế giới về sản xuất rƣợu vang với 80%, tổng sản lƣợng rƣợu vang thế giới, Châu Mĩ 14%, Châu Phi 5%, Châu Á – Úc 0.5%. Thị trƣờng rƣợu vang theo số liệu thống kê năm 2001 đƣợc thể hiện ở bảng dƣới đây:
Pháp 41,7% Italia 17,2% Spain 9,2% Úc 4,8% Bồ Đào Nha 4,3% Đức 4,3%
Sản lƣợng vang toàn cầu đã đạt mức đỉnh vào năm 2004 khi cung vƣợt cầu khoảng 600 triệu thùng (1 thùng gồm 12 chai, tƣơng đƣơng với 9 lít) và đang trên đà giảm sút kể từ đó đến nay. Năm 2013 sản lƣợng vang toàn cầu có thể đƣợc coi là tƣơng đối cao, mang đến hy vọng về một sản lƣợng vang cao trong những năm kế tiếp.
1.7.2. Tình hình sản xuất rượu vang trong nước
Hiện nay, rƣợu vang nƣớc ta cũng đã trở thành thức uống phổ biến trong những bữa tiệc. Theo thống kê của hiệp hội Rƣợu Bia và Nƣớc giải khát Việt Nam, hiện cả nƣớc có hơn 15 doanh nghiệp sản xuất và đóng chai rƣợu vang với sản lƣợng vang mỗi năm tăng khoảng 12-13 triệu lít. Bên cạnh đó Việt Nam cũng đã đang có sự góp mặt của các thƣơng hiệu vang nổi tiếng trên thế giới nhƣ: vang Đà Lạt, Anh Đào… Việt Nam là một quốc gia đông dân, vì thế sức tiêu thụ rất lớn và là nƣớc có tiềm năng trong thu hút khách du lịch, có vùng nhiệt đới khí hậu ẩm nên nghề trồng nho sản xuất rƣợu vang chỉ phát triển ở một số vùng khí hậu thích hợp nhƣ Ninh Thuận và Bắc Bình Thuận. Tuy nhiên, nho quả Việt Nam có độ chua cao, chất lƣợng nho còn thấp. Bên cạnh nguyên liệu là quả nho, các loại quả nhiệt đới nhƣ: Xoài, mơ, dứa, dâu, táo mèo,…cũng rất thích hợp để sản xuất vang. Tuy vậy, vang của Việt Nam thƣờng lên men bằng siro dịch quả nên chất lƣợng không cao (do mất đi hƣơng, vị của quả tƣơi). Bên cạnh đó còn có phƣơng pháp lên men
bằng cả xác quả sẽ mang lại mùi hƣơng và vị đặc trƣng của từng quả sản xuất rƣợu vang.
Mức độ sản xuất rƣợu vang của Việt Nam còn thấp, đến năm 2002, trong nƣớc hiện có khoảng 10 doanh nghiệp sản xuất rƣợu vang và ƣớc tính tổng sản lƣợng vang sản xuất tại Việt Nam chỉ đạt 12,5 triệu lít. Theo hiệp hội rƣợu bia và nƣớc giải khát Việt Nam, năm 2007 trong nƣớc có hơn 15 doanh nghiệp sản xuất rƣợu vang với sản lƣợng mỗi năm khoảng 12 – 13 triệu lít. Trên thị trƣờng, ngoài các sản phẩm vang của ngƣời Việt nhƣ: vang Đà Lạt, vang Đông Đô, vang Thăng Long,… còn có rất nhiều sản phẩm vang nhập từ nƣớc ngoài nhƣ: Pháp, Úc, Chile, Mỹ,….
Đối với ngƣời Việt Nam rƣợu nói chung là một loại thức uống không thể thiếu trong các bữa tiệc, các buổi liên hoan gặp gỡ, các dịp lễ tết. Chính vì thói quen và nhu cầu lớn đó của con ngƣời nên trên thế giới đã xuất hiện nhiều công ty sản xuất rƣợu và cũng đã đƣa ra rất nhiều các sản phẩm rƣợu ngon. Lƣợng rƣợu tiêu thụ hàng năm trên thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng là rất lớn. Trong khi đó lƣợng rƣợu đạt chất lƣợng thì lại chƣa đáp ứng đƣợc nhu cầu của ngƣời tiêu dùng [24].
CHƢƠNG 2
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Qủa táo mèo (Docynia indica) đƣợc thu nhận từ tỉnh Yên Bái.
Qủa nho Cabernet sauvignon.
Chủng nấm men đƣợc phân lập từ dịch siro phối hợp táo mèo và nho Cabernet Sauvignon có khả năng lên men vang táo mèo và nho Cabernet sauvignon.
2.2. Hóa chất, dụng cụ thiết bị
2.2.1. Hóa chất
Các loại đƣờng chuẩn: saccarozo, fructozo, glucozo.
Một số chất vô cơ và hữu cơ: MgSO4.7H2O; K2HPO4; (NH4)2SO4; (NH4)2HPO4; NaOH; HCl, rƣợu etylic, pepton, agar, phenolphthalein.
2.2.2. Dụng cụ thiết bị
Dụng cụ: hộp hồng, ống nghiệm, pipet, bàn trang thủy tinh, phễu thủy
tinh, que cấy, đèn cồn, cốc thủy tinh.
Thiết bị lên men: bình cầu, bình tam giác, nồi hấp, buồng vô trùng, tủ
sấy, cân kĩ thuật, kính hiển vi quang học có độ phóng đại gấp 1000 lần, buồng đếm hồng cầu.
2.3. Môi trƣờng
2.3.1. Môi trường Hansen (môi trường phân lập, MT1)(g/ml)
1. Đƣờng glucozo 50g 2. Pepton 5g 3. MgSO4.7H2O 0.5g
5. (NH4)2SO4 1g 6. Thạch agar 20g 7. Nƣớc cất 1000ml
2.3.2. Môi trường nhân giống (môi trường 2, MT2) (g/ml)
1. Đƣờng glucozo 50g 2. Pepton 5g 3. MgSO4.7H2O 0.5g 4. KH2PO4 1g 5. (NH4)2SO4 1g 6. Nƣớc cất 1000ml
2.3.3. Môi trường lên men (Môi trường 3, MT3) (g/ml)
1. Dịch siro hoa quả 200ml 2. MgSO4.7H2O 0.5g
3. KH2PO4 1g
4. (NH4)2SO4 1g
5. Nƣớc cất 1000ml
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
Trong công trình này tôi đã sử dụng một số phƣơng pháp nghiên cứu sau:
2.4.1. Các phương pháp vi sinh
2.4.1.1. Phương pháp phân lập tuyển chọn và bảo quản, nhân giống nấm men theo phương pháp Pasteur trên môi trường thạch đĩa.
- Phƣơng pháp mà tôi sử dụng là phƣơng pháp phân lập hộp petri, môi trƣờng phân lập là môi trƣờng Hasen
- Cách tiến hành: môi trƣờng phân lập đƣợc khử trùng và phân vào các hộp petri vô trùng và để nguội. Dịch hoa quả đƣợc pha loãng bằng nƣớc muối sinh lí 0,9% với độ pha loãng 109
-107
. Nhỏ 1-2 giọt huyền phù lên bề mặt thạch, dùng bàn trang đã vô trùng dàn đều 1 lƣợt. Sau đó gói kín và nuôi trong
tủ ấm ở 24o
C-28OC. Sau 2-3 ngày, trên bề mặt thạch xuất hiện các khuẩn lạc. Ta tiến hành chọn các khuẩn lạc to, trắng bóng có hình tròn, bề mặt nhẵn bóng, trên đỉnh có một núm nhỏ, mép có thể có răng cƣa hoặc nhẵn. Khi quan sát trên kính hiển vi điện tử các tế bào có hình ovan hoặc hình trứng. Đó là đặc trƣng của khuẩn lạc tế bào nấm men.
2.4.1.2. Phương pháp hoạt hóa giống
Các khuẩn lạc đƣợc chọn sẽ cấy vào thạch nghiêng để ở 24O
C-28OC trong 48 giờ, đƣợc giống cấp 1. Nấm men dung trong nhân giống tiếp đƣợc lấy từ thạch nghiêng. Để có số lƣợng nấm men lớn và có những tế bào trẻ, to, khỏe, tôi tiến hành hoạt hóa giống bằng cách nuôi trong môi trƣờng nhân giống ở 24O
C-28OC trong vòng 23 giờ trên máy lắc, đƣợc giống cấp 2. Dùng giống cấp 2 để lên men.
2.4.1.3. Phương pháp xác định hoạt lực lên men của nấm men
Gồm 2 phƣơng pháp sau:
Phương pháp cân bình trọng lượng:
Lên men trong các bình có thể tích 250ml, môi trƣờng có cùng một lƣợng tế bào nấm men của các giống khác nhau. Sau 24 giờ lên men đem cân trọng lƣợng bình một lần khi lệch giữa hai lần cân là 0,1 thì dừng lại.
Phương pháp xác định số lượng tế bào bằng buồng đếm Goriaev:
Cấy giống vào môi trƣờng nhân giống, nuôi ở 28, lắc đều canh trƣờng, dùng pipet chia độ loãng canh trƣờng. Sau đó dùng pipet lấy dung dịch pha loãng cho một giọt vào khe hở giữa lƣới đếm và kính.
Chú ý: tránh để rơi xuống các rãnh tạo thành bọt khí rùi đặt lá kính lên. Để yên 3-5 phút sau đó tiến hành soi trên kính hiển vi quang học ở vật kính x100 với độ phóng đại 1000 lần. Đếm số lƣợng tế bào trong 5 ô lớn chéo nhau theo công thức sau:
M=A.25.50.N
Trong đó: M: số lƣợng tế bào trong 1 ml dịch huyền phù N : độ pha loãng của dịch huyền phù
A: số lƣợng tế bào trung bình có trong 1 ô vuông
2.4.1.4. Phương pháp quan sát tế bào nấm men trên KHV quang học có độ phóng đại 1000 lần
Nấm men đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng nhân giống (MT2). Sau 24 giờ nuôi cấy ở 28o
C-300C, tiến hành nhuộm tiêu bản sống với xanhmetylen. Sau đó quan sát trên KHV quang học có độ phóng đại 1000 lần.
2.4.1.5. Xác định khả năng kết lắng
Hòa sinh khối nấm men vào dung dịch đệm axetat (có pH: 4,5) đƣợc đựng trong các ống nghiệm có hình dạng và kích thƣớc nhƣ nhau với thể tích dung dịch đệm và số lƣợng nấm men hòa tan bằng nhau. Lắc kỹ trên máy lắc với tốc độ 200 vòng/phút trong thời gian 3-5 phút, để lắng 15 phút. Lúc này toàn bộ khối dịch phân thành hai lớp (phía dƣới đáy của ống nghiệm là nấm men đã kết lắng). Ta tiến hành đo chiều cao của chủng nấm men trong từng ống nghiệm để xác định khả năng kết lắng của chủng nấm men. Ống nghiệm nào có chiều cao kết lắng cao nhất là chủng nấm men có độ kết lắng tốt nhất [11].
2.4.2. Phương pháp hóa học
2.4.2.1. Phương pháp xác định hàm lượng đường bằng khúc xạ kế và xác định độ cồn bằng cồn kế
2.4.2.2. Phương pháp xác định nồng độ pH và máy đo pH
2.4.2.3. Phương pháp xác định hàm lượng axit bằng chuẩn đọ với NaOH 0,1N có phenolphthalein làm chất chỉ thị màu
2.4.2.4. Phương pháp xử ly kết quả thu được bằng thống kê toán học
Giá trị trung bình số học: n Xi X n i 1
Độ lệch chuẩn: 1 ) ( 1 2 n X Xi n i (nếu n<30) n X Xi n i 1 2 ) ( (nếu n30) Sai số trung bình học: n m Hệ số biến thiên: M CV *100 Trong đó: n: số lần thí nghiệm
Xi: chỉ số thực nghiệm của lần thứ I (1 i n).
2.5. Phạm vi nghiên cứu
Chủng nấm men S.cerevisiae đƣợc phân lập trên đối tƣợng là dịch hỗn hợp quả táo mèo và quả nho Cabernet sauvignon.
2.6. Địa điểm nghiên cứu
Phòng thí nghiệm Vi sinh, khoa Sinh, trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2.
2.7. Thời gian nghiên cứu
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập chủng nấm men có khả năng lên men vang phối hợp từ táo mèo và nho Cabernet sauvignon mèo và nho Cabernet sauvignon
3.1.1. Các tỷ lệ phối hợp hai nguyên liệu táo mèo và nho Cabernet sauvignon dùng trong thí nghiệm sauvignon dùng trong thí nghiệm
Trong quá trình nghiên cứu tôi đã kết hợp thử hai nguồn nguyên liệu táo mèo và nho Cabernet sauvignon theo các tỷ lệ phối hợp khác nhau, cụ thể dƣới bảng 3.1:
Bảng 3.1. Các tỷ lệ phối hợp dịch siro táo mèo và nho Cabernet Sauvignon
Mẫu thí nghiệm Nguồn nguyên liệu Tổng số (%)
Táo mèo Nho
1 90 10 100 2 80 20 100 3 70 30 100 4 60 40 100 5 50 50 100 6 40 60 100 7 30 70 100 8 20 80 100 9 10 90 100
Trong các tỉ lệ phối hợp trên qua nghiên cứu tôi nhận thấy mẫu có tỉ lệ phối hợp 50%táo và 50%nho Cabernet sauvignon cho rƣợu có chất lƣợng cao hơn các mẫu còn lại.
3.1.2. Phân lập chủng nấm men có khả năng lên men vang phối hợp từ táo mèo và nho Cabernet sauvignon táo mèo và nho Cabernet sauvignon
Bằng phƣơng pháp phân lập nhƣ đã giới thiệu ở trên, với nguyên liệu ban đầu từ táo mèo và nho Cabernet sauvignon, tôi đã phân lập đƣợc 30
chủng nấm men. Từ những mẫu đó tôi tiến hành lựa chọn ra 3 chủng có đƣờng kính khuẩn lạc lớn nhất, trơn, nhẵn, bóng đƣa sang nghiên cứu tiếp. Tôi ký hiệu 3 chủng nấm nen này là H1, H2, H3.
H1 đƣợc phân lập từ mẫu thí nghiệm 6 (40% Táo 60% Nho). H2 đƣợc phân lập từ mẫu thí nghiệm 4 (60% Táo 40% Nho). H3 đƣợc phân lập từ mẫu thí nghiệm 5 (50% Táo 50% Nho).
Dƣới đây là hình ảnh chụp khuẩn lạc, thạch nghiêng và tế bào nấm men
S.cerevisiae :
Hình 3.1. Ảnh chụp nấm men H1 trên môi trường thạch nghiêng
Hình 3.3.Ảnh chụp tế bào nấm men H1 trên kính hiển vi quang học
3.2. Tuyển chọn và xác định tên khoa học của chủng nấm men có khả năng lên men vang phối hợp táo mèo và nho Cabernet sauvignon năng lên men vang phối hợp táo mèo và nho Cabernet sauvignon
3.2.1. Xác định tên khoa học của chủng nấm men có khả năng lên men vang táo mèo và nho Cabernet sauvignon vang táo mèo và nho Cabernet sauvignon
Dựa vào khóa luận phân loại của Lodder năm 1972 tôi nhận thấy 3 chủng nấm men nghiên cứu trên đều có các đặc tính sau: sinh sản bằng nảy chồi nhiều phía, không đồng hóa nitrat, tế bào hình trứng, hình ovan hoặc hình cầu, lên men glucozo mạnh, lên men đƣợc saccarozo, galactozo, mantozo, trong điều kiện không thuận lợi hình thành từ 1 đến 8 bào tử. Vì vậy, tôi tạm thời đặt tên cho 3 chủng nấm men đã đƣợc lựa chọn là
Saccharomyces cerevisiae H1, H2, H3.
3.2.2. Tiêu chuẩn chọn chủng nấm men có khả năng lên men vang phối hợp táo mèo và nho Cabernet sauvignon hợp táo mèo và nho Cabernet sauvignon
Nấm men có ảnh hƣởng tới toàn bộ quy trình sản xuất và chất lƣợng của rƣợu vang. Vì vậy, phải tuyển chọn ra chủng tốt nhất để lên men. Nấm men sử dụng để lên men rƣợu vang từ dịch trái cây (trong đó có dịch táo mèo và nho Cabernet sauvignon) phải đạt đƣợc những yêu cầu cơ bản sau [12]:
Lên men tốt trong điều kiện có hàm lƣợng đƣờng cao.
Chịu độ cồn và độ axit cao.
Có hiệu suất lên men cao.
Tốc độ phát triển nhanh, chu kỳ lên men ngắn.
Tạo hƣơng thơm đặc trƣng, không có vị lạ, không sinh độc tố.
Dễ lắng trong, ổn định lâu dài trong sản xuất.
3.2.2.1. Nghiên cứu hoạt lực lên men của cả 3 chủng nấm men đã tuyển chọn
Hoạt lực lên men đƣợc đánh giá bằng hàm lƣợng CO2 thoát ra trong quá trình lên men, lƣợng CO2 thoát ra càng nhiều thì chứng tỏ hoạt lực lên men càng lớn. Tôi đã tiến hành nghiên cứu hoạt lực lên men trên môi trƣờng dịch siro phối hợp táo mèo và nho Cabernet sauvignon (50% táo và 50% nho
Cabernet sauvignon). Tiến hành lên men trong 3 bình tam giác với dung tích
150 ml trong thời gian là 48h tôi thu đƣợc kết quả nhƣ sau:
Bảng 3.2. Thử hoạt lực lên men của 3 chủng nấm men H1, H2, H3
Tên chủng Trọng lƣợng bình ban đầu(m1)(g) Trọng lƣợng bình sau 2 ngày(m2)(g) Trọng lƣợng bình sau khi CO2 thoát ra(m3)(g) Hàm lƣợng CO2 thoát ra(m2- m3)(g) H1 130,78 130,7 130,65 0,13 H2 108,08 108,07 108 0,08 H3 1131,70 131,5 131,68 0,02
Từ kết quả trên tôi nhận thấy chủng nấm men có hoạt lực lên men mạnh nhất là chủng H1.
3.2.2.2. Xác định khả năng kết lắng của 3 chủng nấm men đã tuyển chọn