ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tƣợng nghiên cứu 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu

 Qủa táo mèo (Docynia indica) đƣợc thu nhận từ tỉnh Yên Bái.

 Qủa nho Cabernet sauvignon.

 Chủng nấm men đƣợc phân lập từ dịch siro phối hợp táo mèo và nho Cabernet Sauvignon có khả năng lên men vang táo mèo và nho Cabernet sauvignon.

2.2. Hóa chất, dụng cụ thiết bị 2.2.1. Hóa chất

Các loại đường chuẩn: saccarozo, fructozo, glucozo.

Một số chất vô cơ và hữu cơ: MgSO4.7H2O; K2HPO4; (NH4)2SO4; (NH4)2HPO4; NaOH; HCl, rƣợu etylic, pepton, agar, phenolphthalein.

2.2.2. Dụng cụ thiết bị

Dụng cụ: hộp hồng, ống nghiệm, pipet, bàn trang thủy tinh, phễu thủy tinh, que cấy, đèn cồn, cốc thủy tinh.

Thiết bị lên men: bình cầu, bình tam giác, nồi hấp, buồng vô trùng, tủ sấy, cân kĩ thuật, kính hiển vi quang học có độ phóng đại gấp 1000 lần, buồng đếm hồng cầu.

2.3. Môi trường

2.3.1. Môi trường Hansen (môi trường phân lập, MT1)(g/ml) 1. Đường glucozo 50g

2. Pepton 5g 3. MgSO4.7H2O 0.5g

5. (NH4)2SO4 1g 6. Thạch agar 20g 7. Nước cất 1000ml

2.3.2. Môi trường nhân giống (môi trường 2, MT2) (g/ml) 1. Đường glucozo 50g

2. Pepton 5g 3. MgSO4.7H2O 0.5g 4. KH2PO4 1g 5. (NH4)2SO4 1g 6. Nước cất 1000ml

2.3.3. Môi trường lên men (Môi trường 3, MT3) (g/ml) 1. Dịch siro hoa quả 200ml

2. MgSO4.7H2O 0.5g 3. KH2PO4 1g 4. (NH4)2SO4 1g 5. Nước cất 1000ml 2.4. Phương pháp nghiên cứu

Trong công trình này tôi đã sử dụng một số phương pháp nghiên cứu sau:

2.4.1. Các phương pháp vi sinh

2.4.1.1. Phương pháp phân lập tuyển chọn và bảo quản, nhân giống nấm men theo phương pháp Pasteur trên môi trường thạch đĩa.

- Phương pháp mà tôi sử dụng là phương pháp phân lập hộp petri, môi trường phân lập là môi trường Hasen

- Cách tiến hành: môi trường phân lập được khử trùng và phân vào các hộp petri vô trùng và để nguội. Dịch hoa quả được pha loãng bằng nước muối sinh lí 0,9% với độ pha loãng 109-107. Nhỏ 1-2 giọt huyền phù lên bề mặt thạch, dùng bàn trang đã vô trùng dàn đều 1 lƣợt. Sau đó gói kín và nuôi trong

tủ ấm ở 24oC-28OC. Sau 2-3 ngày, trên bề mặt thạch xuất hiện các khuẩn lạc.

Ta tiến hành chọn các khuẩn lạc to, trắng bóng có hình tròn, bề mặt nhẵn bóng, trên đỉnh có một núm nhỏ, mép có thể có răng cƣa hoặc nhẵn. Khi quan sát trên kính hiển vi điện tử các tế bào có hình ovan hoặc hình trứng. Đó là đặc trƣng của khuẩn lạc tế bào nấm men.

2.4.1.2. Phương pháp hoạt hóa giống

Các khuẩn lạc đƣợc chọn sẽ cấy vào thạch nghiêng để ở 24OC-28OC trong 48 giờ, đƣợc giống cấp 1. Nấm men dung trong nhân giống tiếp đƣợc lấy từ thạch nghiêng. Để có số lƣợng nấm men lớn và có những tế bào trẻ, to, khỏe, tôi tiến hành hoạt hóa giống bằng cách nuôi trong môi trường nhân giống ở 24OC-28OC trong vòng 23 giờ trên máy lắc, đƣợc giống cấp 2. Dùng giống cấp 2 để lên men.

2.4.1.3. Phương pháp xác định hoạt lực lên men của nấm men Gồm 2 phương pháp sau:

 Phương pháp cân bình trọng lượng:

Lên men trong các bình có thể tích 250ml, môi trường có cùng một lƣợng tế bào nấm men của các giống khác nhau. Sau 24 giờ lên men đem cân trọng lƣợng bình một lần khi lệch giữa hai lần cân là 0,1 thì dừng lại.

 Phương pháp xác định số lượng tế bào bằng buồng đếm Goriaev:

Cấy giống vào môi trường nhân giống, nuôi ở 28, lắc đều canh trường, dùng pipet chia độ loãng canh trường. Sau đó dùng pipet lấy dung dịch pha loãng cho một giọt vào khe hở giữa lưới đếm và kính.

Chú ý: tránh để rơi xuống các rãnh tạo thành bọt khí rùi đặt lá kính lên.

Để yên 3-5 phút sau đó tiến hành soi trên kính hiển vi quang học ở vật kính x100 với độ phóng đại 1000 lần. Đếm số lƣợng tế bào trong 5 ô lớn chéo nhau theo công thức sau:

M=A.25.50.N

Trong đó: M: số lƣợng tế bào trong 1 ml dịch huyền phù N : độ pha loãng của dịch huyền phù

A: số lƣợng tế bào trung bình có trong 1 ô vuông

2.4.1.4. Phương pháp quan sát tế bào nấm men trên KHV quang học có độ phóng đại 1000 lần

Nấm men được nuôi cấy trong môi trường nhân giống (MT2). Sau 24 giờ nuôi cấy ở 28oC-300C, tiến hành nhuộm tiêu bản sống với xanhmetylen.

Sau đó quan sát trên KHV quang học có độ phóng đại 1000 lần.

2.4.1.5. Xác định khả năng kết lắng

Hòa sinh khối nấm men vào dung dịch đệm axetat (có pH: 4,5) đƣợc đựng trong các ống nghiệm có hình dạng và kích thước như nhau với thể tích dung dịch đệm và số lƣợng nấm men hòa tan bằng nhau. Lắc kỹ trên máy lắc với tốc độ 200 vòng/phút trong thời gian 3-5 phút, để lắng 15 phút. Lúc này toàn bộ khối dịch phân thành hai lớp (phía dưới đáy của ống nghiệm là nấm men đã kết lắng).

Ta tiến hành đo chiều cao của chủng nấm men trong từng ống nghiệm để xác định khả năng kết lắng của chủng nấm men. Ống nghiệm nào có chiều cao kết lắng cao nhất là chủng nấm men có độ kết lắng tốt nhất [11].

2.4.2. Phương pháp hóa học

2.4.2.1. Phương pháp xác định hàm lượng đường bằng khúc xạ kế và xác định độ cồn bằng cồn kế

2.4.2.2. Phương pháp xác định nồng độ pH và máy đo pH

2.4.2.3. Phương pháp xác định hàm lượng axit bằng chuẩn đọ với NaOH 0,1N có phenolphthalein làm chất chỉ thị màu

2.4.2.4. Phương pháp xử ly kết quả thu được bằng thống kê toán học

Giá trị trung bình số học:

n Xi X

n

i



 1

Độ lệch chuẩn:

1 ) (

1

2





 



n X Xi

n

 i (nếu n<30)

n X Xi

n

i





 1

)2

(

 (nếu n30)

Sai số trung bình học:

m   n Hệ số biến thiên:

CV   *M100

Trong đó:

n: số lần thí nghiệm

Xi: chỉ số thực nghiệm của lần thứ I (1 i  n).

2.5. Phạm vi nghiên cứu

Chủng nấm men S.cerevisiae đƣợc phân lập trên đối tƣợng là dịch hỗn hợp quả táo mèo và quả nho Cabernet sauvignon.

2.6. Địa điểm nghiên cứu

Phòng thí nghiệm Vi sinh, khoa Sinh, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2.

2.7. Thời gian nghiên cứu

Tôi tiến hành đề tài bắt đầu từ ngày 08/2014 đến 04/2015.

CHƯƠNG 3