phân lập vi khuẩn phân hủy thuốc trừ sâu gốc lân hữu cơ chlorpyrifos ethyl từ đất canh tác lúa tại một số tỉnh ở đồng bằng sông cửu long

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG ---o0o--- NGUYỄN THỊ ANH THƯ PHÂN LẬP VI KHUẨN PHÂN HỦY THUỐC TRỪ SÂU GỐC LÂN HỮU CƠ CHLORPYRIFOS ETHYL TỪ ĐẤT CANH TÁ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

-o0o -

NGUYỄN THỊ ANH THƯ

PHÂN LẬP VI KHUẨN PHÂN HỦY THUỐC TRỪ SÂU GỐC LÂN HỮU CƠ CHLORPYRIFOS ETHYL

TỪ ĐẤT CANH TÁC LÚA TẠI MỘT SỐ TỈNH Ở

ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH NÔNG NGHIỆP SẠCH

Cần Thơ, 2014

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

-o0o -

NGUYỄN THỊ ANH THƯ

PHÂN LẬP VI KHUẨN PHÂN HỦY THUỐC TRỪ SÂU GỐC LÂN HỮU CƠ CHLORPYRIFOS ETHYL

TỪ ĐẤT CANH TÁC LÚA TẠI MỘT SỐ TỈNH Ở

ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH NÔNG NGHIỆP SẠCH

MSSV: 3103370

Người hướng dẫn khoa học:

TS DƯƠNG MINH VIỄN

Cần Thơ, 2014

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của bản thân và thầy hướng dẫn Các số liệu, kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố trong bất cứ luận văn nào trước đây

ii

LÝ LỊCH KHOA HỌC

I LÝ LỊCH SƠ BỘ

Họ và tên: Nguyễn Thị Anh Thư Giới tính: Nữ

Ngày, tháng, năm sinh: 11/03/1992 Nơi sinh: Sóc Trăng

Địa chỉ liên lạc: xã Nhơn Mỹ, huyện Kế Sách, tỉnh Sóc Trăng

Chân thành biết ơn cô Nguyễn Đỗ Châu Giang là cố vấn của lớp Nông Nghiệp Sạch khóa 36 đã định hướng, chỉ dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt khóa học

Tôi xin chân thành cảm ơn quý Thầy, Cô trong Bộ Môn Khoa Học Đất và quý Thầy, Cô của Khoa Nông nghiệp & SHƯD, đã nhiệt tình giảng dạy, truyền đạt cho tôi những kiến thức và kinh nghiệm quý báu trong suốt khóa học

Tôi xin gửi lời biết ơn đến anh Trương Quốc Tất đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện đề tài

Tôi xin cảm ơn các anh, chị và các bạn trong PTN Sinh học Đất - Bộ Môn Khoa học Đất đã tận tình giúp đỡ, động viên và hỗ trợ tôi trong thời gian thực hiện đề tài Tôi xin thân gửi lời chúc sức khỏe, thành đạt nhất đến các bạn lớp Nông Nghiệp Sạch khóa 36, những người đã luôn động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập Chúc các bạn gặp nhiều may mắn và thành công trong cuộc sống

Nguyễn Thị Anh Thư

iv

DANH SÁCH HÌNH

Trang

Hình 1.1 Công thức hóa học của Chlorpyrifos ethyl 6

Hình 1.2 Một số chế phẩm chứa Chlorpyrifos ethyl được sử dụng phổ biến 7

Hình 1.3 Động thái của thuốc BVTV dư tồn trong đất (nguồn Ross, 1989) 9

Hình 1.4 Các sản phẩm chuyển hóa của Chlorpyrifos ethyl 10

Hình 2.1 Một số địa điểm thu mẫu 16

Hình 2.2 Thu mẫu đất 18

Hình 3.1 Thống kê diện tích và số hộ sử dụng thuốc trừ sâu có chứa hoạt chất Chlorpyrifos ethyl 23

Hình 3.2 So sánh giữa liều lượng khuyến cáo với liều lượng sử dụng Chlorpyrifos ethyl thực tế của nông dân 25

Hình 3.3 Khả năng phân hủy Chlorpyrifos ethyl của hệ vi khuẩn trong môi trường dung dịch MM sau 30 ngày nuôi cấy (n=3 và độ lệch chuẩn) 27

Hình 3.4 Khả năng phân hủy Chlorpyrifos ethyl của 8 dòng vi khuẩn trong môi trường dung dịch MM sau 30 ngày nuôi cấy (n=4 và độ lệch chuẩn) 28

Hình 3.5 Hình dạng tế bào vi khuẩn của hai dòng vi khuẩn PH C3.1 và PH C4.3 được quan sát trên kính hiển (quan sát ở E100) 29

Hình 3.6 Phổ điện di sản phẩm Box-PCR của hai dòng vi khuẩn PH_C3.1 và PH_C4.3 30

CTAB Cetyltrimethylammonium bromide

ĐBSCL Đồng bằng sông Cửu Long

DEC Desethyl chlorpyrifos

DNA Deoxyribonucleic acid

ERIC Enterobacterial repetitive intergenic consensus HPLC High Pressure Liquid Chromatography

IRU Intergenic repeat units

LC50 Lethal Concentration 50

LD50 Lethal Dose 50

MM Minemal mineral medium

OPCs Organophosphorus compounds

vii

Nguyễn Thị Anh Thư, 2014 “PHÂN LẬP VI KHUẨN PHÂN HỦY THUỐC TRỪ SÂU GỐC LÂN HỮU CƠ CHLORPYRIFOS ETHYL TỪ ĐẤT CANH TÁC

LÚA TẠI MỘT SỐ TỈNH Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG” Luận văn tốt

nghiệp đại học ngành Nông Nghiệp Sạch, Khoa Nông Nghiệp & SHƯD, Trường Đại học Cần Thơ

Cán bộ hướng dẫn khoa học: Ts Dương Minh Viễn

TÓM LƯỢC

Đề tài “Phân lập vi khuẩn phân hủy thuốc trừ sâu gốc lân hữu cơ Chlorpyrifos ethyl từ đất canh tác lúa tại một số tỉnh ở Đồng bằng sông Cửu Long”

được thực hiện với mục tiêu: (1) Khảo sát tình hình sử dụng Chlorpyrifos ethyl trên

mô hình chuyên canh lúa tại Cai Lậy - Tiền Giang và Phụng Hiệp - Hậu Giang;(2)Phân lập một số dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy Chlorpyrifos ethyl trên mô hình chuyên canh lúa thuộc hai nhóm đất là đất phù sa và đất phèn Phương thức điều tra tình hình sử dụng Chlorpyrifos ethyl là phỏng vấn trực tiếp nông dân Tổng cộng 13 mẫu đất trong đó: 4 mẫu ở Cai Lậy - Tiền Giang, 4 mẫu ở Bình Tân - Vĩnh Long và 5 mẫu ở Phụng Hiệp - Hậu Giang được sử dụng để phân lập dòng vi khuẩn phân hủy Chlorpyrifos ethyl

Kết quả điều tra tình hình sử dụng Chlorpyrifos ethyl cho thấy, các hoạt chất được nông dân sử dụng để phòng trừ sâu hại rất đa dạng về chủng loại, số lượng và loại hoạt chất thay đổi theo vị trí địa lý của từng vùng Hoạt chất Chlorpyrifos ethyl chỉ được sử dụng tại hai địa điểm là Cai Lậy - Tiền Giang, Phụng Hiệp - Hậu Giang

và liều lượng được nông dân sử dụng cao gấp khoảng 2 đến 8 lần so với liều lượng khuyến cáo

Kết quả thí nghiệm phân hủy Chlorpyrifos ethyl trong môi trường khoáng tối thiểu loãng bởi 13 hệ vi sinh vật cho thấy, 2/13 hệ vi sinh vật và 2/8 dòng vi khuẩn đã phân lập ở Phụng Hiệp - Hậu Giang thể hiện sự phân hủy Chlorpyrifos ethyl Hai dòng vi khuẩn PH_C3.1 và PH_C4.3 có thể phân hủy được 13,96% và 49,72% Chlorpyrifos ethyl ở nồng độ 20 ppm sau 30 ngày nuôi cấy Kết quả chạy Box-PCR từ DNA cho thấy, hai dòng vi khuẩn PH_C3.1 và PH_C4.3 khác nhau về mặt di truyền

viii

MỤC LỤC

Trang

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM TẠ iii

DANH SÁCH HÌNH iv

DANH SÁCH BẢNG v

TỪ VIẾT TẮT vi

TÓM LƯỢC vii

MỤC LỤC viii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2

1.1 Tổng quan về thuốc trừ sâu 2

1.1.1 Phân loại thuốc trừ sâu 2

1.1.2 Tính chất và độc tính của các nhóm thuốc trừ sâu 2

1.1.2.1 Thuốc trừ sâu chlor hữu cơ 2

1.1.2.2 Thuốc trừ sâu lân hữu cơ 3

1.1.2.3 Thuốc trừ sâu Carbamate 3

1.1.2.4 Thuốc trừ sâu Pyrethroid (gốc cúc tổng hợp) 4

1.2 Tình hình sản xuất lúa và sử dụng thuốc BVTV ở Việt Nam nói chung và ĐBSCL nói riêng 4

1.3 Tác động của thuốc trừ sâu đến hệ sinh thái đất 5

1.4 Tổng quan về hoạt chất Chlorpyrifos ethyl 6

1.4.1 Đặc tính của Chlorpyrifos ethyl 6

1.4.2 Tác hại của Chlorpyrifos ethyl 7

1.4.3 Động thái của Chlorpyrifos ethyl trong môi trường 8

1.4.3.1 Động thái của Chlorpyrifos ethyl trong không khí 9

1.4.3.2 Động thái của Chlorpyrifos ethyl trong nước 9

ix

1.4.3.3 Động thái của Chlorpyrifos ethyl trong đất 10

1.5 Một số kết quả nghiên cứu về các dòng vi khuẩn phân hủy Chlorpyrifos ethyl 11

1.6 Các phương pháp sinh học phân tử sử dụng trong phân tích cấu trúc hệ vi khuẩn 12 1.6.1 Box-PCR 12

1.6.2 Điện di gel agarose 12

1.7 Phân tích thuốc Chlorpyrifos ethyl bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp 13

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP 15

2.1 Phương tiện 15

2.1.1 Thời gian và địa điểm thí nghiệm 15

2.1.1.1 Thời gian 15

2.1.1.2 Địa điểm 15

2.1.1.3 Đối tượng thí nghiệm 15

2.1.2 Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm 15

2.1.3 Hóa chất dùng trong thí nghiệm 16

2.2.4 Môi trường nuôi cấy 17

2.2 Phương pháp 17

2.2.1 Khảo sát tình hình sử dụng Chlorpyrifos ethyl trên mô hình chuyên canh lúa tại Cai Lậy - Tiền Giang và Phụng Hiệp - Hậu Giang 17

2.2.2 Phân lập hệ vi khuẩn và một số dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy Chlorpyrifos ethyl 17

2.2.2.1 Làm giàu mật số hệ vi khuẩn có tiềm năng phân hủy Chlorpyrifos ethyl 18

2.2.2.2 Phân lập dòng vi khuẩn có tiềm năng phân hủy Chlorpyrifos ethyl 19

2.2.3 Đánh giá khả năng phân hủy Chlorpyrifos ethyl của các dòng vi khuẩn trong môi trường khoáng tối thiểu 19

2.2.4 Phương pháp phân tích Chlorpyrifos ethyl trong môi trường khoáng tối thiểu 21

2.2.5 Khảo sát sự khác biệt về mặt di truyền của hai dòng vi khuẩn phân hủy Chlorpyrifos ethyl bằng phương pháp sinh học phân tử Box-PCR 21

x

2.2.6 Phương pháp mô tả đặc điểm, hình thái và tế bào của vi khuẩn phân lập 22

2.2.6.1 Test gram 22

2.2.6.2 Test oxydase 22

2.2.6.3 Hình thái khuẩn lạc 22

2.2.7 Phương pháp thống kê xử lý số liệu 22

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23

3.1 Tình hình sử dụng Chlorpyrifos ethyl trên mô hình chuyên canh lúa tại Cai Lậy - Tiền Giang và Phụng Hiệp - Hậu Giang 23

3.2 Đặc tính lý, hóa học của đất của các mẫu đất thí nghiệm 25

3.3 Kết quả phân lập các hệ vi khuẩn phân hủy Chlorpyrifos ethyl trong môi trường dung dịch từ đất chuyên canh lúa 26

3.4 Đánh giá khả năng phân hủy của các dòng vi khuẩn phân hủy Chlorpyrifos ethyl trong môi trường dung dịch của các dòng vi khuẩn đã phân lập được 27

3.5 Khảo sát sự đa dạng của các vi khuẩn phân lập được 30

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 31

4.1 Kết luận 31

4.2 Đề nghị 31

TÀI LIỆU THAM KHẢO 32

1

MỞ ĐẦU

Ở đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) lúa là cây trồng chính trong hệ thống canh tác, diện tích trồng lúa năm 2011 trên 4 triệu ha (hơn 50% tổng diện tích cả nước) ĐBSCL được xem là vựa lúa cung cấp trên 50% sản lượng gạo quốc gia và cũng là nơi cung cấp 90% sản lượng gạo xuất khẩu (Trung tâm tin học và Thống kê, 2012) Canh tác lúa ở ĐBSCL có vai trò quan trọng trong đảm bảo an ninh lương thực

và xuất khẩu nông sản của quốc gia Để đạt được những thành công đó một phần do ĐBSCL có điều kiện khí hậu thuận lợi và đất đai màu mỡ, các hoạt động thâm canh tăng vụ, nâng cao kỹ thuật canh tác, nông dân còn sử dụng một lượng lớn thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) và phân bón trong sản xuất nông nghiệp Việc lạm dụng thuốc BVTV cùng với điều kiện khí hậu nóng ẩm đã làm phát sinh nhiều loài sâu bệnh mới khó phòng trị và có khả năng kháng thuốc cao, hậu quả là thuốc BVTV ngày càng tăng

về mặt số lượng và đa dạng hơn về chủng loại Bên cạnh vai trò phòng trừ sâu, bệnh và

cỏ dại, sử dụng thuốc BVTV không đúng liều lượng và không tuân theo các quy tắc an toàn khi sử dụng thuốc không chỉ làm mất năng suất cây trồng mà còn ảnh hưởng đến môi trường từ đó làm giảm quần thể sinh vật thủy sinh, làm giảm rất lớn mật số giun đất cũng như các vi sinh vật trong đất, ảnh hưởng đến nuôi trồng thủy sản và do vậy sẽ ảnh hưởng đến sức khỏe con người

Trong đó, Chlorpyrifos ethyl là thuốc trừ sâu thuộc nhóm lân hữu cơ, được sử dụng khá rộng rãi, chiếm khoảng 11% trong tổng số các thuốc trừ sâu được sử dụng

(EPA, 2004 được dẫn bởi Yang et al., 2006) Chlorpyrifos ethyl là loại thuốc có tính

độc thần kinh ở mức cao, gây hại cho người và nhiều loài động vật có lợi Việc sử dụng Chlorpyrifos ethyl quá mức và kéo dài có thể làm tồn trữ một lượng lớn thuốc ở trong đất và nước Để giảm thiểu ô nhiễm Chlorpyrifos ethyl trong nước thì việc làm giảm ô nhiễm Chlorpyrifos ethyl trong đất là vô cùng quan trọng Nhiều nghiên cứu gần đây đã cho thấy Chlorpyrifos ethyl có thể bị phân hủy bởi các dòng vi khuẩn đã

được phân lập như Enterobacter chủng B14 (Singh et al., 2004), Alcaligenes faecalis

DSP3 (Yang et al., 2006) Do đó, đề tài “Phân lập vi khuẩn phân hủy thuốc trừ sâu

gốc lân hữu cơ Chlorpyrifos ethyl từ đất canh tác lúa tại một số tỉnh ở Đồng bằng sông Cửu Long” được thực hiện với mục tiêu:

− Khảo sát tình hình sử dụng Chlorpyrifos ethyl trên mô hình chuyên canh lúa tại Cai Lậy - Tiền Giang và Phụng Hiệp - Hậu Giang

− Phân lập và tuyển chọn các dòng vi khuẩn phân hủy Chlorpyrifos ethyl trên đất canh tác lúa tại một số tỉnh ở ĐBSCL

2

CHƯƠNG 1 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về thuốc trừ sâu

1.1.1 Phân loại thuốc trừ sâu

Thuốc trừ sâu gồm các chất hay hỗn hợp các chất có nguồn gốc hoá học (vô cơ, hữu cơ), thảo mộc, sinh học (các loài sinh vật và sản phẩm do chúng sản sinh ra) Chúng được dùng để diệt trừ hoặc ngăn ngừa tác hại của côn trùng đến cây trồng, cây rừng, nông lâm sản, gia súc và con người Các loại thuốc trừ sâu có thể có tác động vị độc, tiếp xúc, xông hơi, nội hấp, thấm sâu, hấp dẫn, xua đuổi và điều hoà sinh trưởng Ngoài ra một số thuốc trừ sâu còn có hiệu lực trừ nhện hại cây trồng (Nguyễn Trần Oánh, 2007)

Có nhiều cách phân loại thuốc trừ sâu, tùy theo nguồn gốc hoặc mục đích sử dụng, có thể có những phân loại khác nhau về thuốc trừ sâu:

− Theo nguồn gốc hóa học:

 Thuốc trừ sâu vô cơ

 Thuốc trừ sâu hữu cơ, bao gồm: Các hợp chất Chlor hữu cơ; các hợp chất Phosphate hữu cơ; các hợp chất Carbamate; các hợp chất Pyrethroid

 Thuốc trừ sâu thảo mộc

 Thuốc trừ sâu vi sinh

− Theo con đường tác động: Thuốc trừ sâu tiếp xúc; thuốc trừ sâu vị độc; thuốc trừ sâu xông hơi; thuốc trừ sâu nội hấp (lưu dẫn); thuốc trừ sâu thấm sâu

− Theo cơ chế tác động: Thuốc trừ sâu ức chế men Cholinesterase; thuốc trừ sâu điều khiển sinh trưởng côn trùng

1.1.2 Tính chất và độc tính của các nhóm thuốc trừ sâu

1.1.2.1 Thuốc trừ sâu chlor hữu cơ

Thuốc trừ sâu Chlor hữu cơ tác động đến sâu hại bằng con đường tiếp xúc và vị độc, một số có tác dụng thấm sâu và xông hơi Các thuốc Chlor hữu cơ tác động đến côn trùng chậm, phổ tác động rộng, một số còn diệt được cả nhện hại cây (Dicofol) Các thuốc Chlor hữu cơ là những chất độc tế bào thần kinh, chúng làm tê liệt dẫn truyền xung động điện trên sợi trục thần kinh (axon) ngoại biên thông qua phản ứng liên kết với màng sợi trục và hình thành phức chất với màng sợi trục Ngoài ra, hợp chất Chlor hữu cơ còn ức chế hoạt động của men ATPase và một số men khác nhưng không ức chế men Cholinesterase (ChE) Các hợp chất trong nhóm có độ độc trung

1.1.2.2 Thuốc trừ sâu lân hữu cơ

Thuốc trừ sâu lân hữu cơ (OP) là nhóm thuốc trừ sâu lớn, ra đời sau nhóm Chlor hữu cơ Chúng là dẫn xuất của các ester trung tính hay amid của acid photphoric (có chứa gốc P-O) hay thiophosphoryl (P-S) Các thuốc trừ sâu lân hữu cơ có phổ tác động rộng (ngoài tác dụng trừ sâu, nhiều thuốc trong nhóm còn có khả năng trừ nhện và tuyến trùng) Các thuốc OP có tính hoá học kém bền vững, nên có thời gian hữu hiệu ngắn, không tích luỹ trong môi trường Tác động nhanh và mạnh đến côn trùng bằng con đường tiếp xúc và vị độc, một số thuốc trong nhóm còn có tác dụng xông hơi hay nội hấp Việc sử dụng các thuốc OP không hợp lý dễ gây hậu quả xấu với môi sinh Ngoài ra, các thuốc trong nhóm còn gây độc với động vật máu nóng (hầu hết thuộc nhóm độc II, một số ở nhóm độc Ib); rất độc đối với cá và ong mật; dễ gây hại đến các loài thiên địch Chúng tác động đến côn trùng bằng cách kìm hãm men ChE bằng cách phosphoryl hoá các vị trí hoạt động của men nên không thể làm nhiệm vụ phân giải acetylcholine (acetylcholine làm nhiệm vụ dẫn truyền xung động thần kinh qua khe xinap ở đầu mút tế bào thần kinh) Chất này được tích luỹ lại với lượng lớn, gây kích thích thần kinh quá mức làm cho dây thần kinh tổn thương và đứt đoạn Trường hợp, nếu lượng thuốc OP quá ít, không đủ kìm hãm quá trình phosphoryl hoá, men ChE lại được giải phóng, tiếp tục phân giải acetylcholine Nhờ đó, côn trùng nếu đã bị trúng độc lại có thể được phục hồi (Nguyền Trần Oánh, 2007)

1.1.2.3 Thuốc trừ sâu Carbamate

Thuốc trừ sâu Carbamate tác động đến sâu hại bằng con đường tiếp xúc và vị độc Một số còn có tác động xông hơi, thấm sâu và nội hấp Các thuốc Carbamate thường không có tính độc vạn năng như thuốc lân hữu cơ Về cơ chế tác động của thuốc trừ sâu Carbamate tương tự như các thuốc trừ sâu OP Các thuốc Carbamate kìm hãm men ChE bằng cách carbaryl hoá các vị trí hoạt động của toàn men Quá trình carbaryl hoá cũng là quá trình thuận nghịch Nhưng sự liên kết giữa các thuốc Carbamate với men ChE thường không bền, nên có trường hợp sâu hại hồi phục được Các thuốc Carbamate an toàn với cây, ít độc đối với cá hơn các thuốc OP; không tồn lưu quá lâu trên nông sản và môi trường sống Độ độc của thuốc đối với động vật máu nóng rất khác nhau, tùy thuộc vào loại thuốc (Nguyễn Trần Oánh, 2007)

4

1.1.2.4 Thuốc trừ sâu Pyrethroid (gốc cúc tổng hợp)

Thuốc trừ sâu Pyrethroid tác động đến sinh vật bằng con đường tiếp xúc và vị độc, ngoài ra còn có tác động xua đuổi côn trùng Các thuốc trong nhóm có phổ tác động rộng, trừ nhiều loài sâu hại miệng nhai và chích hút, nhất là các loài sâu thuộc bộ cánh vảy, cánh cứng, cánh nửa cứng hại cây ăn quả, cây thực phẩm, lúa và ngũ cốc, cây công nghiệp, Một số được phun vào đất để trừ sâu hại trong đất, ngoài ra thuốc còn được dùng trừ sâu hại kho lương thực, côn trùng gây hại sức khỏe cho người như ruồi, muỗi, gián, côn trùng và ký sinh ngoài da hại gia súc Nhiều loại thuốc trong nhóm có thể trừ được nhện Các thuốc Pyrethroid không tác động đến các hệ men sống của cơ thể sinh vật, mà tác động trực tiếp đến hệ thần kinh của côn trùng và động vật máu nóng Ở côn trùng, thuốc Pyrethroid tác động đến hệ thần kinh trung ương và ngoại vi ở liều rất thấp Thuốc gây rối loạn sự dẫn truyền xung động của kênh natri dọc sợi trục của tế bào thần kinh côn trùng Tác động đến sự truyền xung động của tế bào sợi trục thần kinh, ngăn cản và kìm hãm sự truyền xung động trong tế bào thần kinh Còn ở động vật máu nóng, thuốc Pyrethroid tác động đến các trung tâm hô hấp ở tuỷ sống và hệ thần kinh kiểm soát chức năng của tim Triệu chứng ngộ độc thuốc trừ sâu Pyrethroid ở côn trùng và động vật máu nóng rất giống nhau, trước tiên là kích động, rùng mình, rối loạn tiếp sau là bại liệt và chết (Nguyễn Trần Oánh, 2007)

1.2 Tình hình sản xuất lúa và sử dụng thuốc BVTV ở Việt Nam nói chung và ĐBSCL nói riêng

Ở Việt Nam, cây lúa được xem là cây lương thực hàng đầu trong hoạt động sản xuất nông nghiệp, nó luôn giữ vai trò quan trọng trong nhu cầu đời sống của con người

và sự phát triển kinh tế chung của đất nước Với diện tích đất canh tác hiện nay khoảng 9,44 triệu ha, nông dân chiếm 70% dân số cả nước, Việt Nam trở thành một trong những nước có thế mạnh trong xuất khẩu nông sản Theo thống kê của ngành nông nghiệp, khối lượng gạo xuất khẩu của Việt Nam năm 2011 đạt khoảng 7,5 triệu tấn với kim ngạch hơn 3,7 tỷ USD Miền Nam có diện tích trồng lúa khoảng 5,14 triệu ha, trong đó, vùng ĐBSCL có diện tích trồng lúa năm 2011 trên 4 triệu ha (hơn 50% tổng diện tích cả nước) ĐBSCL được xem là vựa lúa cung cấp trên 50% sản lượng gạo quốc gia và cũng là nơi cung cấp 90% sản lượng gạo xuất khẩu (Trung tâm tin học và Thống kê, 2012) Những năm gần đây, diện tích đất canh tác lúa ở nước ta bị thu hẹp

từ 7,67 triệu ha năm 2000 giảm xuống còn 7 triệu ha trong năm 2012 (Đoàn Mạch Trường, 2012) Vì thế, nhiều mô hình phải thay đổi cơ cấu giống cây trồng, tiến hành thâm canh tăng vụ, cùng với sự thay đổi bất thường của khí hậu Đặc biệt ở ĐBSCL có

5

điều kiện khí hậu nóng ẩm đã tạo điều kiện thuận lợi cho nhiều loại cỏ dại, sâu bệnh diễn biến phức tạp hơn Trong những năm gần đây ĐBSCL sử dụng khoảng 2 triệu tấn phân hóa học và gần 500.000 tấn thuốc BVTV hằng năm (Phạm Đình Đôn, 2009), trong đó lượng thuốc BVTV dùng cho lúa chiếm 80,3%, các cây trồng khác chỉ chiếm

từ 5-11% (Lê Văn Khoa, 2010) An Giang là một trong những tỉnh có trữ lượng lúa lớn nhất ở ĐBSCL (cung cấp 16,63% sản lượng lúa cho vùng ĐBSCL và 8,64% sản lượng lúa cả nước) theo thống kê của Sở Nông nghiệp & PTNT An Giang hàng năm

có khoảng 183.000 tấn phân hóa học các loại và khoảng trên 1.000 tấn thuốc BVTV đổ xuống đồng ruộng (Sở NN & PTNT An Giang, 2009)

Theo thống kê của chương trình bảo vệ môi trường quốc gia, ít nhất 20.000 nông dân chết mỗi năm, chủ yếu ở các nước đang phát triển, do ngộ độc thuốc BVTV trong

đó có các loại thuốc BVTV nhóm Carbamate và Phosphate hữu cơ (WHO, 1990; Kishi

et al., 1995; Pimental et al., 1992; Rosenstock et al., 1991) Theo báo cáo của tổ chức

của WHO, vào năm 2002 từng có 7.170 trường hợp nhiễm độc thuốc trừ sâu được ghi nhận tại Việt Nam Năm 1995, ĐBSCL có 13.000 người nhiễm độc, trong đó có 354 người chết (Lê Huy Bá, 2008) Một số tỉnh ở ĐBSCL như tỉnh Bến Tre từ 1986-1993

có 1.102 người bị nhiễm độc, trong đó có 208 người chết; ở tỉnh Tiền Giang có 3.167 người bị nhiễm độc và 333 người chết (Phạm Thành Nhơn, 2005)

1.3 Tác động của thuốc trừ sâu đến hệ sinh thái đất

Mặc dù thuốc BVTV nói chung và thuốc trừ sâu nói riêng được dùng để bảo vệ cây trồng nhưng chúng có thể ảnh hưởng đến các sinh vật không mong muốn và gây ô nhiễm môi trường đất thông qua thay đổi sự cân bằng của các quá trình sinh học trong

đất dù trong một thời gian ngắn hay dài (Smith et al., 2000) Những loại thuốc này ảnh

hưởng đến các vi sinh vật bằng cách giảm số lượng, sự đa dạng và thay đổi cấu trúc cộng đồng vi sinh vật Ngoài ra, thuốc trừ sâu còn ảnh hưởng đến hoạt động sinh hóa của vi sinh vật như nitrat hóa, ammonium hóa, phân hủy các chất hữu cơ và cố định

đạm (Agnihotri et al., 1981)

Thuốc trừ sâu trong đất và nước có thể bị suy thoái bởi các con đường sinh học

và phi sinh học Trong quá trình phân hủy sinh học, vi sinh vật đất đóng vai trò vô cùng quan trọng vì chúng có thể sử dụng hoặc phân hủy các loại thuốc trừ sâu trong hoạt động của chúng Kết quả của các tiến trình đó làm phân hủy hoặc chuyển hóa các

loại thuốc này (Shahida et al., 2004) Khi thuốc trừ sâu mới tiếp xúc với đất, các loài

vi sinh vật đất có sự tự đáp ứng Những vi sinh vật không có khả năng tận dụng thuốc trừ sâu làm nguồn thức ăn sẽ bị thuốc tác động, nên bị hạn chế số lượng hay ngừng hẳn không phát triển nữa Ngược lại, những loài vi sinh vật có khả năng này sẽ phát

6

triển thuận lợi và tăng số lượng nhanh chóng Số lượng và hoạt động của vi sinh vật chiếm một tỷ lệ cao trong các tầng đất mặt, đặc biệt là trong các đất có hàm lượng hữu

cơ cao Thông thường, tỷ lệ hữu cơ giảm dần theo độ sâu trong đất, nơi có điều kiện

như độ ẩm, nhiệt độ và không khí ít thuận lợi cho hoạt động của vi sinh vật (Kerle et

al., 2007; Anonymous, 2009) Ngoại lệ của quy luật này là một số vùng trầm tích bão

hòa có tốc độ dòng chảy cao thì số lượng và hoạt động của vi sinh vật giống như trên tầng mặt

Sự phân hủy sinh học thuốc trừ sâu nói chung và thuốc trừ sâu lân hữu cơ nói riêng là vấn đề rất đáng quan tâm bởi vì độc tính cao đối với động vật hữu nhũ của một vài loại hoạt chất, hơn nữa chúng lại được sử dụng rất phổ biến Các loài vi sinh vật đất có khả năng phân hủy các thuốc trừ sâu thành các chất hóa học và sử dụng các thành phần này để tổng hợp các hợp cần thiết cho chúng, kết quả là làm giảm đi tính

bền vững của các loại thuốc này (Shahida et al., 2004)

1.4 Tổng quan về hoạt chất Chlorpyrifos ethyl

1.4.1 Đặc tính của Chlorpyrifos ethyl

Chlorpyrifos ethyl còn có tên thương mại là Lorsban, Dursban, Dorsan, Pyrinex, Brodan, Tên hóa học là O,O-dietyl-O-3,5,6-trichloro-2-pyridylphotphorothioat Công thức hóa học: C9H11Cl3NO3PS Phân tử lượng: 350,62 g/mol Công thức hóa học:

Hình 1.1 Công thức hóa học của Chlorpyrifos ethyl

Chlorpyrifos ethyl có dạng tinh thể không màu, tan rất ít trong nước, tan tốt trong benzene, acetone, xylen Độ tan trong benzene 7.900 g/kg, acetone 6.500 g/kg, clorofom 6.300 g/kg, cacbondisunfua 5.900 g/kg, dietyl ete 5.100 g/kg , methanol 450 g/kg Độ thủy phân của Chlorpyrifos ethyl tăng lên khi pH tăng DT50 của thuốc trong nước (pH = 8,25) là 1,5 ngày Thuộc nhóm độc II, LD50 peros (xâm nhập qua miệng vào đường ruột): 135-163 mg/kg, dermal (xâm nhập qua da): 2.000 mg/kg; ADI (lượng chất độc không gây hại cơ thể người được chấp nhận): 0,01 mg/kg; MRL (mức

dư lượng tối đa): cam, chanh 0,3 mg/kg, hoa quả khác 0,2 mg/kg, rau 0,05 mg/kg; PHI

7

(thời gian cách ly): 14-21 ngày, thuốc độc với cá và ong mật Trong đất, Chlorpyrifos ethyl phân giải chậm, DT50 khoảng 60-120 ngày, sản phẩm chuyển hóa 3,5,6-trichloro-2-pyridinol (TCP) tiếp tục phân giải thành hợp chất Chlor hữu cơ và khí CO2 (Trần Quang Hùng, 1999)

Chlorpyrifos ethyl có tác dụng tiếp xúc vị độc và xông hơi Thuốc trừ được nhiều

loài sâu miệng nhai và chích hút hại lúa, rau, màu, cây công nghiệp, cây ăn quả, hoa và

cây cảnh, trừ côn trùng y tế và thú y Chlorpyrifos ethyl được gia công thành các dạng

sữa (20-48%), bột thấm nước (25%) Chlorpyrifos ethyl còn được chế biến hỗn hợp (hoặc dùng hỗn hợp) với Cypermethrin, Dimethoat, Diflubenzuron

(Karalliedde & Senanayake, 1999; Sogorb et al., 2004 được dẫn bởi Yang et al.,

2006) Chúng được xem như chất độc thần kinh do tác động ức chế sự tạo thành enzyme Acetylcholinesterase (AchE) làm cho sự truyền tín hiệu thần kinh ở sinh vật bị

ngăn chặn đáng kể (Cho et al., 2002 được dẫn bởi Yang et al., 2006)

Chlorpyrifos ethyl được sử dụng thương mại hóa vào năm 1965 để khống chế các loại côn trùng gây hại trên lúa, rau màu, bông và đồng cỏ Việc sử dụng Chlorpyrifos ethyl phổ biến đã gây ô nhiễm không khí, tầng nước mặt, sông, hồ và không khí Các triệu chứng nhiễm độc cấp tính bao gồm nhức đầu, buồn nôn, nhức mỏi cơ, một số trường hợp có thể dẫn đến tử vong Các khuyết tật bẩm sinh ở người cũng được xem là

có liên quan tới sự tiếp xúc với các sản phẩm chứa Chlorpyrifos ethyl Các nghiên cứu cũng cho thấy thuốc BVTV nhóm Carbamate và Phosphate hữu cơ có thể làm thai

8

chết, thay đổi hormone, ảnh hưởng đến DNA, thai dị dạng, tinh trùng, buồng trứng và

trứng phát triển không bình thường (Zahm et al., 1997) Chlorpyrifos ethyl cũng rất

độc đối với các loài động vật máu nóng khác, LD50 qua miệng đối với chuột 135-163 mg/kg, chuột lang 504 mg/kg và thỏ 1.000-2.000 mg/kg LD50 qua da thỏ 5.000 mg/kg; chuột > 2.000 mg/kg Chlorpyrifos độc đối với nhiều loại động vật chân đốt có lợi như ong, bọ rùa và ong bắp cày, các loài bọ cánh cứng Chim cũng dễ bị ảnh hưởng bởi Chlorpyrifos từ việc giảm khối lượng chim non đến bị dị tật và tử vong, LD50 qua miệng đối với vịt trời 490 mg/kg, gà 32-405 mg/kg Chlorpyrifos ethyl giết chết các loài cá ở nồng độ thấp khoảng vài phần nghìn tỷ (ppt), cá hồi 0,007-0,051 mg/L, LC50

(96 giờ) đối với tôm Triều Tiên Palaemon Macrodactylus 0,05 µg/L Đối với cây

trồng, có thể chậm hình thành hạt, dị dạng trái và phân chia tế bào bất thường khi tiếp xúc kéo dài với Chlorpyrifos ethyl (Cox, 1995 được dẫn bởi Ranjan và Malik, 2008) Chlorpyrifos ethyl còn thay đổi thành phần của cộng đồng sinh vật phù du ở nồng độ

ethyl tăng theo nhiệt độ đất (Singh et al., 2002)

Ở Việt Nam, Chlorpyrifos ethyl vẫn là loại hoạt chất được sử dụng phổ biến Chlorpyrifos ethyl có thể được sử dụng dưới dạng đơn chất (các loại thuốc như: God 550EC, Vitashield 18EC, Mapy 48EC, Chlorban 20EC, Sanpyriphos 20EC…) hoặc kết hợp với các hoạt chất khác như Cypermethrin (các thuốc như: Soddy 430EC, Supertac 250EC, Subside 505EC,…), với Imidacloprid (các thuốc như: Losmine 250EC, Pro-per 250EC,…) có hiệu quả tốt với các loại sâu cuốn lá, sâu đục thân, rệp sáp, rầy nâu,… trên lúa, cà phê, thuốc lá, chè, rau màu, cây ăn quả,… Ngoài ra Chlorpyrifos ethyl còn được sử dụng làm thuốc diệt mối (các thuốc như: Dursban 40EC, Lenfos 50EC, MAP Sedan 48EC,…)

1.4.3 Động thái của Chlorpyrifos ethyl trong môi trường

Thuốc BVTV có thể bị phân hủy bằng các con đường hóa học và con đường sinh học Phân hủy hóa học xảy ra thông qua các phản ứng như sự quang phân, sự thủy

9

phân, sự oxy hóa và sự khử Phân hủy sinh học khi có sự tham gia của các vi sinh vật đất trong quá trình phân hủy (Andreu và Picó, 2004)

Hình 1.3 Động thái của thuốc BVTV dư tồn trong đất (nguồn Ross, 1989)

Khi hoạt chất Chlorpyrifos ethyl vào trong đất sẽ chịu ảnh hưởng bởi các yếu tố

lý, hóa và sinh trong môi trường Những yếu tố này có thể kết hợp làm ảnh hưởng đến tính bền của thuốc, bao gồm sự phân hủy hóa học và sinh học, hay làm ảnh hưởng đến tính di động của thuốc, bao gồm sự hấp phụ trên tầng mặt, sự hấp thụ từ thực vật, bay

hơi, xói mòn do gió, rửa trôi và thấm lậu (Galani et al., 2010) Tiêu chuẩn tốt nhất để

mô tả số phận của thuốc trừ sâu là chu kỳ bán rã của nó (Linde, 1994)

1.4.3.1 Động thái của Chlorpyrifos ethyl trong không khí

Chu kỳ bán rã của Chlorpyrifos ethyl trong không khí là 72 giờ (Lyman et al., 1990) Theo một nghiên cứu khác của Hayward et al (2010) chu kỳ bán rã của

Chlorpyrifos ethyl là 14 giờ Mặc khác, theo Howard (1991) chu kỳ bán rã của Chlorpyrifos ethyl 6,34 giờ Sự phân hủy của Chlorpyrifos ethyl trong không khí khi không được chiếu sáng tạo ra sản phẩm duy nhất là TCP, ngược lại trong điều kiện chiếu xạ có hai sản phẩm phụ khác được hình thành (Fontaine và Teeter, 1987)

1.4.3.2 Động thái của Chlorpyrifos ethyl trong nước

Chlorpyrifos ethyl có chu kỳ bán rã là 14 ngày trong môi trường nước (McEwen

và Stephenson, 1979) Theo Howard (1991) chu kỳ bán rã của Chlorpyrifos ethyl trong môi trường dung dịch có pH trung tính (pH = 7,0) ở 25oC là 35-78 ngày Chu kỳ bán

rã của Chlorpyrifos ethyl trong môi trường acid từ 1-2 tháng, các sản phẩm chuyển hóa chính tạo thành TCP và desethyl chlorpyrifos (DEC) Sự thủy phân xảy ra nhanh hơn trong môi trường kiềm tạo thành TCP Sự thủy phân trong dung dịch được xúc tác bởi

Rửatrôi

bề mặt Thuốc hấp phụ

trong đất

Bay hơiPhân hủy

quang hóa

Thực vật hấp thu

Trực di

Phânhủy sinh học Chuyển hóa

hóa học

10

các ion đồng (II) và sự tác động của vi sinh vật cũng góp phần làm tăng độ phân hủy

Các sản phẩm chuyển hóa trung gian thủy phân nhanh hơn so với Chlorpyrifos ethyl

1.4.3.3 Động thái của Chlorpyrifos ethyl trong đất

Theo Tomlin (2000), chu kỳ bán rã của Chlorpyrifos ethyl trong đất là 94 ngày Các nghiên cứu khác cũng cho thấy, trong điều kiện phòng thí nghiệm chu kỳ bán rã trong đất là 14-84 ngày trên đất đã nhiễm Chlorpyrifos ethyl (Chapman và Harris, 1980; Pike và Getzin, 1981) Sự phân hủy sinh học chiếm ưu thế trong một số loại đất Trong đất hiếu khí, chu kỳ bán rã của Chlorpyrifos ethyl dao động từ 11-141 ngày trong bảy loại đất Các loại đất này có thành phần sa cấu khác nhau và pH biến động từ 5,4-7,4 Trong đất yếm khí, chu kỳ bán rã là 15 ngày trong mùn và 58 ngày trong đất sét (US EPA, 1989) Sự phân hủy chậm lại rõ rệt ở nồng độ cao hơn (1.000 mg/kg), chu kỳ bán rã của Chlorpyrifos ethyl kéo dài từ 4-12 tháng và có thể hơn 4 năm trong

đất cát, phù hợp với độ tan trong nước thấp của Chlorpyrifos ethyl (Racke et al.,

1996) Sự quang phân trong đất góp phần không đáng kể đến động thái của

Chlorpyrifos ethyl trong môi trường (Havens et al., 1992)

Nhiều nghiên cứu cho rằng sự tích tụ TCP - sản phẩm chính trong quá trình chuyển hóa của Chlorpyrifos ethyl có tác động như chất kháng khuẩn đã làm cản trở

hoạt động của các loại vi sinh vật phân hủy Chlorpyrifos ethyl trong đất (Singh et al.,

2003) Sự phân hủy của TCP tạo trichloromethoxypyridine (TMP) và CO2 Sự phân hủy của TMP xảy ra trong đất tạo thành CO2 và TCP và chu kỳ bán rã được ghi nhận

từ 1-2 tháng

Hình 1.4 Các sản phẩm chuyển hóa của Chlorpyrifos ethyl

11

1.5 Một số kết quả nghiên cứu về các dòng vi khuẩn phân hủy Chlorpyrifos ethyl

Đối với một số hoạt chất lân hữu cơ như Parathion, các nghiên cứu thực nghiệm

đã chứng minh có thể dễ dàng để phân lập các vi sinh vật phân hủy hoạt chất này, hai

dòng vi khuẩn là Flavobacterium sp chủng ATCC 27551 và Pseudomonas diminuta chủng Gm, đã được phân lập từ trong đất tương ứng ở Philippine và Mỹ (Singh et al.,

2002) Trong khi đó với nghiên cứu của Rani và Latitha Kumari đã tìm thấy một dòng

thuộc Pseudomonas putida có thể thủy phân Methyl parathion - một hoạt chất khác của lân hữu cơ (Rani et al., 2008)

Chlorpyrifos ethyl đặc trưng bởi liên kết P-O-C giống như các thuốc BVTV lân hữu cơ khác như Diazinon, Fenitrothion, Methyl parathion và Parathion Song không giống với trường hợp của các hợp chất lân hữu cơ khác, có rất ít kết quả nghiên cứu về

sự tăng cường phân hủy Chlorpyrifos ethyl trong thời gian Chlorpyrifos ethyl được sử dụng từ năm 1965

Nhiều nỗ lực đã được thực hiện để phân lập vi khuẩn phân hủy chlorpyrifos từ

đất nông nghiệp đã không thành công (Mallick et al., 1999; Racke et al., 1990) Một

số nghiên cứu được xem như bước đầu trong sự phân hủy Chlorpyrifos ethyl đã cho thấy Chlorpyrifos ethyl có thể bị phân hủy theo dạng đồng biến dưỡng trong môi

trường lỏng bởi Flavobacterium sp và Pseudomonas diminuta tương ứng trên những cánh đồng có sử dụng Diazinon và trên đất được làm giàu với Parathion (Yang et al.,

2006) Tuy nhiên, những vi sinh vật này không sử dụng Chlorpyrifos ethyl như là nguồn carbon chính Mọi cố gắng trong việc phân lập vi sinh vật phân hủy Chlorpyrifos ethyl từ đất nhiễm Chlorpyrifos ethyl đều không thành công cho đến năm

2003 Singh và cộng tác viên đã phân lập được 6 dòng vi khuẩn từ đất ở Úc cho thấy có

sự tăng cường phân hủy Chlorpyrifos ethyl Singh (2004) cũng đã phân lập được vi

khuẩn Enterobacter chủng B-14 có khả năng tăng cường phân huỷ sinh học

Chlorpyrifos ethyl Tương tự, trong năm 2006 Yang và ctv đã phân lập được vi khuẩn

Alcaligenes faecalis DSP3 có khả năng phân huỷ cả Chlorpyrifos ethyl và TCP Một

nghiên cứu khác của Ghanem và ctv năm 2007 cũng phân lập được dòng Klebsiella và công trình năm 2009 của Anwar và ctv phân lập được vi khuẩn Bacillus pumilus dòng

C2A1 cũng có khả năng phân hủy Chlorpyrifos ethyl và TCP, dòng này phân hủy này đến 90% TCP ở nồng độ 300 ppm chỉ sau 8 ngày nuôi cấy Ngoài ra, dòng vi khuẩn

Paracoccus-TRP phân lập từ bùn có khả năng phân hủy sinh học Chlorpyrifos ethyl và

TCP, bên cạnh đó dòng vi khuẩn này cũng có khả năng phân hủy Pyridine, Methyl parathion và Carbonfuran khi bổ sung các thuốc này như là nguồn carbon duy nhất

nhờ các enzymes ngoại bào được tiết ra (Gangming Xu et al., 2008) Kết quả của các

12

nghiên cứu trên cho thấy tìm năng ứng dụng của chủng vi khuẩn Paracoccus sp trong

việc xử lý ô nhiễm nông dược là rất lớn

Mặc dù sự phân hủy vi sinh Chlorpyrifos ethyl đã được nghiên cứu nhưng vẫn còn rất ít thông tin về gene và các enzyme liên quan đến sự phân hủy này Gần đây, có nhiều gene/hệ enzyme có liên quan đến sự phân hủy các hoạt chất lân hữu cơ đã được xác định Một gene có tên “gene phân hủy hoạt chất lân hữu cơ” (Organophosphate

degrading gene - opd) đã được tìm thấy ở nhiều loại vi sinh vật khác nhau ở các vùng địa lý khác nhau (Yang et al., 2006) Enzyme thủy phân hoạt chất lân hữu cơ (Organophosphate hydrolase - OPH) được mã hóa bởi gene opd phù hợp với nhiều loại

chất nền và có đặc tính thủy phân mạnh Tuy nhiên khi Chlorpyrifos ethyl bị thủy phân bởi OPH thì gần như chậm hơn đến 1.200 lần với loại hoạt chất thích hợp hơn là Paraoxon

1.6 Các phương pháp sinh học phân tử sử dụng trong phân tích cấu trúc hệ vi khuẩn

1.6.1 Box-PCR

Trong bộ gene của vi sinh vật sơ hạch có các đoạn DNA ngắn với trình tự nucleotide giống nhau Chúng có thể có cấu trúc hình vòng do các nucleotide trong các đoạn này có thể tự liên kết bổ sung hoặc palindromes units (PU) hoặc repetitive extra-genic palindromes (REP), hoặc không có cấu trúc vòng như intergenic repeat units (IRU) hoặc ERIC (enterobacterial repetitive intergenic consensus) Các nghiên cứu gần đây đã phát hiện một đoạn DNA cũng hiện diện rãi rác trong bộ gene của vi khuẩn Gram dương được gọi là BOX Các nhân tố BOX cũng có cấu trúc vòng, là các đoạn DNA có trình tự lặp lại bao gồm 3 thành phần boxA, boxB, boxC với số lượng nucleotide lần lượt là 59, 45 và 50 Mặc dù kích thước, số lượng và cấu trúc của các nhân tố BOX tương tự như REP và ERIC nhưng trình tự DNA của chúng rất khác nhau Kết quả nghiên cứu về lai DNA (DNA hydridization) và PCR cho thấy các trình

tự oligonucleotide của boxA được bảo tồn ở nhiều loài vi khuẩn khác nhau Vì vậy, trình tự oligonucleotide của boxA có thể được sử dụng để thiết kế các đoạn mồi giúp

xác định sự khác biệt giữa các dòng vi khuẩn ở mức độ phân tử (Koeuth et al., 2008)

1.6.2 Điện di gel agarose

Điện di là kỹ thuật được sử dụng trong thí nghiệm để phân tích các đại phân tử Trong phòng thí nghiệm sinh học phân tử người ta sử dụng phương pháp điện di để tách ly, phát hiện phân tử DNA nguyên vẹn, DNA bị cắt hạn chế và DNA của sản phẩm PCR

13

Gel agarose là loại gel thông dụng nhất, một phần do thao tác đơn giản, thường dùng để phân tách những đoạn có kích thước trong khoảng 0,5-20 kb Gel được đổ trên một giá thể nằm ngang và điện di được thực hiện theo phương nằm ngang Các nucleic acid trong gel agarose sẽ hiện dưới tia tử ngoại (UV) nhờ một hóa chất có tên

là ethidium bromide Chất này có khả năng gắn xen vào giữa các base của nucleic acid

và dưới tác dụng của tia tử ngoại sẽ phát huỳnh quang Trong thao tác, ethidium bromide được cho vào gel trước khi đổ Sau điện di, gel được chiếu sáng bằng tia tử ngoại, nucleic acid sẽ hiện dưới dạng những vạch màu đỏ cam (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2002)

1.7 Phân tích Chlorpyrifos ethyl bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp

Sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography) là kỹ thuật tách và phân tích đồng thời các chất trong một hỗn hợp

Phương pháp sắc ký lỏng cao áp ra đời năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển HPLC là một phương pháp chia tách trong

đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ Phương pháp này ngày càng được sử dụng rộng rãi và phổ biến vì nhiều lý do: có độ nhạy cao, khả năng định lượng lượng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt Phạm vi ứng dụng của phương pháp HPLC rất rộng, như phân tích các hợp chất thuốc trừ sâu, thuốc kháng sinh, các chất phụ gia thực phẩm trong lĩnh vực thực phẩm, dược phẩm, môi trường…

Quá trình tách trong kỹ thuật tách HPLC là tổ hợp của nhiều quá trình hóa học và

lý học Đó là những cân bằng động xảy ra trong cột sắc ký giữa pha tĩnh và pha động,

là sự vận chuyển và phân bố lại liên tục của các chất tan trong hỗn hợp mẫu phân tích (pha động) theo từng lớp qua chất nhồi cột (pha tĩnh) từ đầu cột tới cuối cột tách Trong quá trình đó, chất tan luôn luôn được phân bố lại giữa hai pha, trong khi pha động luôn luôn chảy qua cột tách với một tốc độ nhất định, hay gradient Trong những điều kiện sắc ký nhất định, chất tan luôn luôn phân bố trong hai pha theo những cân bằng động học Chẳng hạn, mẫu phân tích được bơm vào cột sắc ký và được pha tĩnh giữ lại, thời gian mẫu bị giữ lại trong pha tĩnh gọi là thời gian lưu Sau đó, quá trình sắc ký các chất trong mẫu phân tích sẽ diễn ra khi dung môi rửa giải của pha động bơm qua cột sắc ký Trong quá trình sắc ký, các chất trong mẫu phân tích dịch chuyển qua lại giữa pha tĩnh và pha động nhiều lần từ đầu đến cuối cột sắc ký, quá trình này diễn ra cho đến khi chất cuối cùng trong mẫu phân tích được rửa giải xong Nếu ghi lại

14

quá trình đó ta sẽ có một sắc đồ gồm nhiều đỉnh trên giản đồ (peak), số đỉnh sẽ tương ứng với số chất có trong mẫu phân tích Như vậy trong quá trình sắc ký, chất nào bị lưu giữ mạnh nhất sẽ được rửa giải ra sau cùng và do vậy được thể hiện ở đỉnh cuối cùng, chất nào bị lưu giữ yếu nhất sẽ được rửa giải đầu tiên nên được thể hiện ở đỉnh đầu tiên của sắc đồ

Kết quả sắc ký có thể định tính hoặc định lượng Mẫu phân tích được tính bằng cách so sánh thời gian lưu của đỉnh sắc ký của mẫu phân tích với mẫu chuẩn Nồng độ các chất trong mẫu phân tích có thể được xác định bằng cách so sánh chiều cao hay diện tích các đỉnh sắc ký của mẫu phân tích với mẫu chuẩn (Luận, 1999 được dẫn bởi Nguyễn Thị Phi Oanh, 2011)

15

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Phương tiện

2.1.1 Thời gian và địa điểm thí nghiệm

2.1.1.3 Đối tượng thí nghiệm

Khảo sát tình hình sử dụng Chlorpyrifos ethyl trên mô hình chuyên canh lúa tại các huyện Cai Lậy - Tiền Giang và Phụng Hiệp - Hậu Giang

Sử dụng 13 mẫu đất tại 3 địa điểm khảo sát trên mô hình chuyên canh lúa để phân lập vi khuẩn phân hủy Chlorpyrifos ethyl Trong đó, thu được 4 mẫu đất tại các

xã Long Khánh và xã Bình Phú (Cai Lậy - Tiền Giang), 4 mẫu đất ở xã Thuận An

(Bình Tân - Vĩnh Long), 5 mẫu đất thuộc xã Hòa An (Phụng Hiệp - Hậu Giang) (Hình 2.1)

2.1.2 Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm

Dụng cụ thu mẫu: khoan, leng, túi đựng, giấy nhôm,… dùng để thu mẫu đất Các dụng cụ thí nghiệm: bình tam giác, ống đong, ống nghiệm, cốc thủy tinh, lọ

pi, đĩa petri,… dùng cho quá trình nuôi cấy và phân lập vi sinh vật

Thiết bị thí nghiệm: Tủ cấy, tủ sấy, tủ hút, nồi khử trùng ướt, máy lắc, máy ly tâm, máy vortex, tủ lạnh loại 4C, tủ đông -20C và -80C Máy sắc ký lỏng khối phổ

HPLC - dùng để phân tích thuốc Chlorpyrifos ethyl Máy GeneAmp® PCR System

9.700 chạy PCR dùng để nhân chuổi DNA Hệ thống chụp ảnh Gel Logic 1.500 Imaging System của hãng Kodak, dùng để chụp ảnh gel chứa DNA và các thiết bị thí

nghiệm khác

Các loại dung môi có độ tinh khiết cao như Acetone (99,8%), Toluene (99,9%), Hexan (99,7%),… của hãng J.T.Baker

Hóa chất trích DNA: CTAB 3%, Chloroform, Isopropanol và Ethanol; hóa chất thực hiện phản ứng PCR: Hỗn hợp Go Taq Green Master Mix (Promega), Primer upstream 27F (5' AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 3'), Primer downstream 907R (5' CCG TCA ATT CCT TTR AGT TT 3') và nước (không có chứa DNA)

Hóa chất chuẩn bị chạy gel Agarose kiểm tra sản phẩm Box-PCR: Agarose 1% - 1,5% (Merck), TBE buffer 0.5X, Loading buffer (chất chỉ thị màu - LB), Ethidium bromide (chất chỉ thị huỳnh quang - EtBr), thang chuẩn DNA 100 bp plus và 100 bp (Fermentas)

2.2.4 Môi trường nuôi cấy

Môi trường Tryptose Soybean Agar (TSA) gồm 30 gram Tryptose Soybean Borth (TSB) và 15 gram Agar trong một lít nước khử khoáng được khử trùng ướt ở 121C trong 20 phút, khi nhiệt độ hạ xuống khoảng 50C thì đổ môi trường nuôi cấy vào đĩa petri đã được tiệt trùng khô ở 172C trong 2 giờ Môi trường TSA dùng để phân lập các dòng vi sinh vật sau giai đoạn làm giàu mật số

Môi trường khoáng tối thiểu MM (Mineral minimal medium) gồm 870 mL nước khử khoáng được khử trùng ướt ở 121C trong 20 phút, khi nhiệt độ hạ xuống còn

70C thêm 25 mL dung dịch đệm, 100 mL dung dịch muối khoáng và 5 mL dung dịch Bình Tân - Vĩnh Long Cai Lậy - Tiền Giang Phụng Hiệp - Hậu Giang