2.1.2 Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm
Dụng cụ thu mẫu: khoan, leng, túi đựng, giấy nhôm,… dùng để thu mẫu đất. Các dụng cụ thí nghiệm: bình tam giác, ống đong, ống nghiệm, cốc thủy tinh, lọ pi, đĩa petri,… dùng cho quá trình nuôi cấy và phân lập vi sinh vật.
Thiết bị thí nghiệm: Tủ cấy, tủ sấy, tủ hút, nồi khử trùng ướt, máy lắc, máy ly tâm, máy vortex, tủ lạnh loại 4C, tủ đông -20C và -80C. Máy sắc ký lỏng khối phổ HPLC - dùng để phân tích thuốc Chlorpyrifos ethyl. Máy GeneAmp® PCR System 9.700 chạy PCR dùng để nhân chuổi DNA. Hệ thống chụp ảnh Gel Logic 1.500 Imaging System của hãng Kodak, dùng để chụp ảnh gel chứa DNA và các thiết bị thí nghiệm khác.
16
Hình 2.1 Một số địa điểm thu mẫu 2.1.3 Hóa chất dùng trong thí nghiệm
Các thí nghiệm bố trí sử dụng hóa chất Chlorpyrifos ethyl tinh khiết của hãng Dr.Ehrenstorfer với độ tinh khiết 99,5% được sử dụng cho việc phân lập vi khuẩn và phân tích Chlorpyrifos ethyl trên máy HPLC.
Các loại dung môi có độ tinh khiết cao như Acetone (99,8%), Toluene (99,9%), Hexan (99,7%),… của hãng J.T.Baker.
Hóa chất trích DNA: CTAB 3%, Chloroform, Isopropanol và Ethanol; hóa chất thực hiện phản ứng PCR: Hỗn hợp Go Taq Green Master Mix (Promega), Primer upstream 27F (5' AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 3'), Primer downstream 907R (5' CCG TCA ATT CCT TTR AGT TT 3') và nước (không có chứa DNA).
Hóa chất chuẩn bị chạy gel Agarose kiểm tra sản phẩm Box-PCR: Agarose 1% - 1,5% (Merck), TBE buffer 0.5X, Loading buffer (chất chỉ thị màu - LB), Ethidium bromide (chất chỉ thị huỳnh quang - EtBr), thang chuẩn DNA 100 bp plus và 100 bp (Fermentas).
2.2.4 Môi trường nuôi cấy
Môi trường Tryptose Soybean Agar (TSA) gồm 30 gram Tryptose Soybean Borth (TSB) và 15 gram Agar trong một lít nước khử khoáng được khử trùng ướt ở 121C trong 20 phút, khi nhiệt độ hạ xuống khoảng 50C thì đổ môi trường nuôi cấy vào đĩa petri đã được tiệt trùng khô ở 172C trong 2 giờ. Môi trường TSA dùng để phân lập các dòng vi sinh vật sau giai đoạn làm giàu mật số.
Môi trường khoáng tối thiểu MM (Mineral minimal medium) gồm 870 mL nước khử khoáng được khử trùng ướt ở 121C trong 20 phút, khi nhiệt độ hạ xuống còn 70C thêm 25 mL dung dịch đệm, 100 mL dung dịch muối khoáng và 5 mL dung dịch
17
khoáng vi lượng. Thành phần của các dung dịch trên được trích dẫn trong Phụ chương 2.
2.2 Phương pháp
2.2.1 Khảo sát tình hình sử dụng Chlorpyrifos ethyl trên mô hình chuyên canh lúa tại Cai Lậy - Tiền Giang và Phụng Hiệp - Hậu Giang lúa tại Cai Lậy - Tiền Giang và Phụng Hiệp - Hậu Giang
Khảo sát tình hình sử dụng thuốc trừ sâu được thực hiện trên hai loại đất là đất phù sa và đất phèn. Các xã thuộc huyện Cai Lậy - Tiền Giang và Phụng Hiệp - Hậu Giang trên các hộ chuyên canh lúa.
Việc khảo sát dựa trên bảng câu hỏi điều tra, chủ yếu thu thập thông tin về tình hình sử dụng thuốc BVTV: loại thuốc sử dụng, liều lượng/vụ, lượng thuốc/năm, diện tích phun thuốc. Số lượng phiếu điều tra tại mỗi huyện khoảng từ 15-20. Các hộ được phỏng vấn được lựa chọn một cách ngẫu nhiên và phân bố đều tại các xã khảo sát. Mẫu phiếu điều tra chi tiết được trình bày ở Phụ chương 1.
Kết quả điều tra sẽ được tổng hợp để thống kê tình hình sử dụng hoạt chất Chlorpyrifos ethyl bao gồm % số hộ sử dụng, % diện tích khảo sát và liều lượng sử dụng tại các địa điểm trên.
2.2.2 Phân lập hệ vi khuẩn và một số dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy Chlorpyrifos ethyl Chlorpyrifos ethyl
Sử dụng 13 mẫu đất trên mô hình chuyên lúa tại 3 địa điểm Bình Tân - Vĩnh Long , Cai Lậy - Tiền Giang và Phụng Hiệp - Hậu Giang . Các mẫu đất trên mô hình chuyên lúa dùng để phân lập vi khuẩn phân hủy Chlorpyrifos ethyl được lấy ở độ sâu 0-10 cm, trên các ruộng chuyên lúa để phân lập vi khuẩn. Mỗi ruộng lấy ở 5 vị trí khác nhau, sau đó trộn đều cho vào túi nilong bảo quản ở nhiệt độ phòng. Tại mỗi ruộng khác nhau, dụng cụ được rửa sạch và tiệt trùng bằng cồn 70 (Hình 2.2).
18
Hình 2.2 Thu mẫu đất
Toàn bộ quá trình phân lập hệ vi khuẩn và một số dòng vi khuẩn, quá trình bố trí thí nghiệm đánh giá sự phân hủy đều được thực hiện trong điều kiện nhiệt độ phòng, các môi trường nuôi cấy có pH = 7-7,2.
2.2.2.1 Làm giàu mật số hệ vi khuẩn có tiềm năng phân hủy Chlorpyrifos ethyl
Làm giàu mật số cộng đồng khuẩn phân hủy Chlorpyrifos ethyl là tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của hệ vi khuẩn phân hủy Chlorpyrifos ethyl hoạt động nhân mật số. Môi trường nuôi cấy là môi trường MM có bổ sung Chlorpyrifos ethyl như là nguồn cung cấp carbon duy nhất.
Mẫu đất lấy về được trộn đều, cân 10 gram cho vào chai thủy tinh 250 mL có nắp đậy, bổ sung 100 mL dung dịch đệm phosphate (23,99 g NaH2PO4 và 15,59 g Na2HPO4 cho 1 lít nước khử khoáng), lắc với tốc độ 130 vòng/phút trong 1 giờ, để lắng 15 phút sau đó hút 1 mL dung dịch trên vào bình tam giác 100 mL đã chuẩn bị sẵn môi trường khoáng tối thiểu với Chlorpyrifos ethyl nồng độ 20 ppm với thể tích nuôi là 24 mL. Các bình tam giác được lắc liên tục trên máy lắc tròn với tốc độ 90 vòng/phút nhằm tạo khả năng trao đổi oxy tốt cho dung dịch khi lắc ở nhiệt độ phòng thí nghiệm và trong tối. Đây được xem là thế hệ nuôi cấy đầu tiên. Khi môi trường trở nên đục theo thời gian nuôi thì hút 1 mL dung dịch vi khuẩn của thế hệ nuôi cấy đầu tiên cho vào bình tam giác 100 mL đã tiệt trùng chứa môi trường MM mới có bổ sung Chlorpyrifos ethyl ở nồng độ 20 ppm. Quy trình làm giàu mật số cộng cồng vi khuẩn chi tiết như sau:
Chuẩn bị môi trường MM chứa Chlorpyrifos ethyl nồng độ 20 ppm vào bình tam giác 100 mL.
− Hút 250 µL Aceton chứa Chlorpyrifos ethyl (2.000 ppm) cho vào bình tam giác.
− Sau khi Aceton bay hơi chỉ còn lại Chlorpyrifos ethyl, hút 24 mL môi trường MM cho vào bình tam giác.
19
− Cân 10 gram đất khô cho vào chai thủy tinh 250 mL có nắp đậy, bổ sung 100 ml dung dịch đệm phosphate đã tiệt trùng, lắc trên máy lắc tròn với tốc độ 130 vòng/phút trong 1 giờ.
− Hút 1 mL dung dịch đất ở trên cho vào bình tam giác đã chuẩn bị sẵn môi trường MM và Chlorpyrifos ethyl nồng độ 20 ppm.
− Bình đối chứng chỉ có môi trường MM và Chlorpyrifos ethyl nồng độ 20 ppm.
− Lắc các bình tam giác trên máy lắc tròn với tốc 90 vòng/phút liên tục (5-7 ngày) cho đến khi dung dịch bị đục do quá trình nhân mật số của vi sinh vật.
− Sau khi vi sinh vật phát triển làm đục môi trường, hút 1 mL dung dịch từ bình tam giác ban đầu cho vào bình tam giác mới đã chuẩn bị sẵn môi trường MM và Chlorpyrifos ethyl nồng độ 20 ppm.
Lặp lại như vậy khoảng 4 lần để tăng mật số hệ vi khuẩn có khả năng phân hủy Chlorpyrifos ethyl (quan sát dựa vào đục của dung dịch sau vài ngay nuôi cấy). Sau đó tiến hành bố trí thí nghiệm trong ống nghiệm với 4 lần lặp lại, để chọn lọc lại những hệ vi khuẩn có khả năng phân hủy Chlorpyrifos ethyl.
2.2.2.2 Phân lập dòng vi khuẩn có tiềm năng phân hủy Chlorpyrifos ethyl
Sử dụng môi trường thạch TSA để tách ròng các dòng vi khuẩn phân hủy Chlorpyrifos ethyl từ các cộng đồng phân hủy thuốc. Vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường TSA, pha loãng ở nồng độ thấp (10-5-10-6) để đảm bảo các khuẩn lạc tách rời nhau. Chuyển từng khuẩn lạc sang môi trường TSA mới cho đến khi có được các dòng thuần. Cấy các khuẩn lạc đó cho vào từng ống nghiệm có chứa dung dịch khoáng tối thiểu MM mới và Chlorpyrifos ethyl ở nồng độ 20 ppm với đối chứng dương vi khuẩn (dung dịch MM và vi khuẩn) và đối chứng âm vi khuẩn (dung dịch MM và Chlorpyrifos ethyl), theo dõi độ đục của dịch nuôi để kiểm tra sự phân hủy của các dòng vi khuẩn này. Tiến hành bố trí trong ống nghiệm với 4 lần lặp lại để kiểm tra sự phân hủy Chlorpyrifos ethyl của các dòng vi khuẩn. Sau khi đã xác định được các vi khuẩn phân hủy Chlorpyrifos ethyl, chúng được kiểm tra lần nữa về độ đồng nhất hình thái khuẩn lạc trên môi trường TSA.
2.2.3 Đánh giá khả năng phân hủy Chlorpyrifos ethyl của các dòng vi khuẩn trong môi trường khoáng tối thiểu trong môi trường khoáng tối thiểu
Quá trình làm giàu mật số cộng đồng vi sinh vật trong môi trường lỏng MM có bổ sung Chlorpyrifos ethyl ở nồng độ 20 ppm và phân lập vi sinh vật trên môi trường TSA đã phân lập được 8 dòng có khả năng phân hủy Chlorpyrifos ethyl.
20
Bảng 2.1 Nguồn gốc của tám dòng vi khuẩn phân lập được
Địa điểm Ký hiệu hệ vi khuẩn Ký hiệu dòng vi khuẩn
Phụng Hiệp - Hậu Giang PH C_3
PH C3.1 PH C3.2 PH C3.3 PH C3.4
Phụng Hiệp - Hậu Giang PH C_4
PH C4.1 PH C4.2 PH C4.3 PH C4.4
Các dòng vi khuẩn này được nhân mật số trong bình tam giác 100 mL có chứa 50 mL dung dịch giàu dinh dưỡng GYM tiệt trùng (gồm 10 gram glucose và 10 gram yeast extract cho 1 lít nước) trong hai ngày, trên máy lắc tròn với tốc độ 90 vòng/phút trong tối. Sinh khối của các dòng vi khuẩn được thu riêng biệt bằng cách chuyển toàn bộ dung dịch dinh dưỡng GYM có chứa sinh khối vi khuẩn vào trong ống Falcon 50 mL tiệt trùng. Quy trình ly tâm được thực hiện trong 3 phút với tốc độ 6.000 vòng/phút sau đó loại bỏ phần nước ở trên. Tiếp tục cho 30 mL nước khử khoáng tiệt trùng vào ống Falcon chứa sinh khối vi khuẩn, vortex 2 phút nhằm hòa tan sinh khối vi khuẩn vào nước, sau đó ly tâm. Toàn bộ quy trình được lặp lại liên tục trong ba lần nhằm loại bỏ hoàn toàn nguồn carbon còn sót lại từ môi trường dung dịch giàu dinh dưỡng GYM. Tiếp theo, hiệu chỉnh độ đục của dung dịch chứa vi khuẩn với nước khử khoáng tiệt trùng bằng máy so màu Spectrometer (Thermo Scientific, Multiskan Spectrum) về optical density (OD) 600 nm = 0,7.
Quy trình bố trí thí nghiệm đánh giá khả năng phân hủy Chlorpyrifos ethyl của các dòng vi khuẩn được thực hiện trong điều kiện nhiệt độ phòng thí nghiệm. Các dòng vi khuẩn được nuôi trong môi trường lỏng MM bổ sung Chlorpyrifos ethyl nồng độ 20 ppm và theo dõi hàm lượng Chlorpyrifos ethyl. Thí nghiệm gồm 2 nghiệm thức và 4 lần lặp lại được trình bày chi tiết trong bảng 2.1.
21
Bảng 2.2 Các nghiệm thức thí nghiệm khảo sát tốc độ phân hủy Chlorpyrifos ethyl
Tên nghiệm thức Chỉ tiêu theo dõi
Nghiệm thức 1: 4 mL dung dịch MM + Chlorpyrifos ethyl 20 ppm, 4 lặp lại
Hàm lượng Chlorpyrifos ethyl
Nghiệm thức 2: 4 mL dung dịch MM + Chlorpyrifos ethyl 20 ppm + 100 L dung dịch vi khuẩn, 4 lặp lại
Xác định hàm lượng Chlorpyrifos ethyl còn lại trong môi trường MM
2.2.4 Phương pháp phân tích Chlorpyrifos ethyl trong môi trường khoáng tối thiểu thiểu
Trích Chlorpyrifos ethyl từ các ống nghiệm bố trí thí nghiệm với dung dịch khoáng tối thiểu MM có Chlorpyrifos ethyl bằng hỗn hợp dung môi Toluene:Acetone (2:1). Quy trình trích mẫu từ dung dịch chi tiết như sau:
– Chuyển dung dịch nuôi từ ống nghiệm sang lọ pi 12 mL, tráng nhiều lần. Thêm 4 mL hỗn hợp Toluen:Acetone (2:1) vào lọ pi.
– Đem vortex lọ pi chứa mẫu ở vận tốc 2.500 vòng/phút, sau đó ly tâm với tốc độ 2.500 vòng/phút trong 3 phút, hút phần dung môi tách lớp bên trên cho vào lọ pi mới, tránh phần nước bên dưới. Thao tác trích lặp lại 3 lần để đạt hiệu suất trích cao.
– Thêm hỗn hợp Toluene:Acetone (2:1) để đạt thể tích 10 mL sau đó cho vào vial và đo trên máy HPLC.
Phương pháp phân tích Chlorpyrifos ethyl trên HPLC, được sử dụng theo phương pháp của Mauldin et al., 2006. Nồng độ Chlorpyrifos ethyl trong các mẫu bố trí trong dung dịch được đo trên máy HPLC, sử dụng cột C18 (dài: 25 cm, đường kính trong: 4,6 mm), tỷ lệ pha động Methanol:Nước là 80:20, bước sóng 230 nm, tốc độ dòng 1,00 mL.
2.2.5 Khảo sát sự khác biệt về mặt di truyền của hai dòng vi khuẩn phân hủy Chlorpyrifos ethyl bằng phương pháp sinh học phân tử Box-PCR Chlorpyrifos ethyl bằng phương pháp sinh học phân tử Box-PCR
Kiểm tra sự khác biệt của hai dòng vi khuẩn ký hiệu PH_C3.1 và PH_C4.3 thể hiện khả năng phân hủy Chlorpyrifos ethyl trong môi trường MM. Hai dòng vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường TSA trong ba ngày để thu sinh khối. DNA của vi khuẩn được tách chiết theo quy trình của Ihrmark et al. (2012) sau đó trữ mẫu trong tủ đông ở -20oC. Quy trình trích DNA của hai dòng vi khuẩn được trình bày ở Phụ chương 3.
22
DNA của hai dòng vi khuẩn phân lập sẽ được khuếch đại bằng phản ứng Box- PCR để so sánh sự giống và khác nhau của hai dòng vi khuẩn này. Chu trình nhiệt và thời gian của phản ứng bao gồm: biến tính sơ khởi 95oC (2 phút), 35 chu kỳ khuếch đại: 94oC (3 giây) - 92oC (30 giây) - 50oC (1 phút) - 65oC (8 phút), và kéo dài hoàn tất ở 65oC (8 phút). Các hóa chất để thực hiện một phản ứng Box-PCR 50 L bao gồm: 5 L PCR buffer 10X, 3 L MgCl2 25 mM, 0,8 L BSA1%, 2,5 L dNTPs (2,5mM mỗi loại), 0,85 L mồi BoxA1R (0,1 mM) (CTACGGCAAGGCGACGCTG ACG, Koeuth
et al., 2008), 5 L DMSO 100%, 0,5 LTaq polymerase (5U.L-1) và 15ng DNA (Breugelmans and Uyttebroek, 2004). Sản phẩm Box-PCR được phân tích trên gel agarose 1,5% với dòng điện 150V trong 65 phút. Quy trình được trình bày ở Phụ chương 4.
2.2.6 Phương pháp mô tả đặc điểm, hình thái và tế bào của vi khuẩn phân lập
2.2.6.1 Test gram
Khuẩn lạc tinh sạch sau khi được tách ròng của vi khuẩn sẽ được trải lên lame và nhỏ một vài giọt KOH 3%, dùng tăm trộn đều vi khuẩn và KOH. Nếu giữa tăm và lame kéo lên thành sợi chỉ thì vi khuẩn được test là gram âm và ngược lại. Phương pháp này dựa vào khả năng tạo nhầy giữa sinh khối vi khuẩn và dung dịch KOH 3%. Dưới tác dụng của dung dịch kiềm loãng, vách tế bào của vi khuẩn gram âm bị phá vỡ làm giải phóng DNA và tạo dịch nhầy khi phản ứng với dung dịch KOH (Suslow et al., 1982 được dẫn bởi Nguyễn Khởi Nghĩa, 2007).
2.2.6.2 Test oxydase
Vi khuẩn được kiểm tra enzyme oxydase với bộ Kit (Bactident Oxydase, Merck), để xác định vi khuẩn có enzyme Cytochrome C oxydase hay không. Vi khuẩn có chứa enzyme này có thể sử dụng oxy tham gia vào chuỗi dẫn truyền điện tử, sinh ATP trong quá trình hô hấp.
2.2.6.3 Hình thái khuẩn lạc
Hình thái khuẩn lạc sẽ được mô tả về hình dạng, độ nổi, bờ và màu sắc khi chúng phát triển trên môi trường TSA.
2.2.7 Phương pháp thống kê xử lý số liệu
Số liệu thí nghiệm được kiểm định phân phối chuẩn, đồng nhất phương sai, so sánh trung bình, phân tích ANOVA với phần mềm Minitab 16.
23
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Tình hình sử dụng Chlorpyrifos ethyl trên mô hình chuyên canh lúa tại Cai Lậy - Tiền Giang và Phụng Hiệp - Hậu Giang Lậy - Tiền Giang và Phụng Hiệp - Hậu Giang
Những năm gần đây, do thâm canh tăng vụ, tăng diện tích và thay đổi cơ cấu giống cây trồng nên tình hình sâu bệnh diễn biến phức tạp hơn. Vì vậy số lượng và chủng loại thuốc trừ sâu sử dụng cũng tăng lên. Khảo sát tình hình sử dụng hoạt chất trừ sâu Chlorpyrifos ethyl được thực hiện tại các địa điểm thuộc huyện Cai Lậy - Tiền Giang và Phụng Hiệp - Hậu Giang. Tổng số phiếu điều tra ở hai huyện như sau: Cai Lậy - Tiền Giang điều tra được 20 phiếu và Phụng Hiệp - Hậu Giang là 21 phiếu. Nhìn chung, hiện nay hoạt chất trừ sâu Chlorpyrifos ethyl được nông dân sử dụng khá phổ biến với tên thương mại là Dragon 585EC và Winter 635EC để phòng trị nhiều đối