Hai dòng vi khuẩn phân hủy Chlorpyrifos ethyl sẽ được trích DNA và chạy Box- PCR để so sánh sự giống và khác nhau giữa hai dòng vi khuẩn đã phân lập. Kết quả điện di sản phẩm Box-PCR của hai dòng vi khuẩn PH_C3.1 và PH_C4.3 cho thấy chúng khác nhau về mặt di truyền (Hình 3.6) do đó hai dòng vi khuẩn này sẽ được giải trình tự và định danh.
Hình 3.6 Phổ điện di sản phẩm Box-PCR của hai dòng vi khuẩn PH_C3.1 và PH_C4.3
31
CHƯƠNG 4
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận
Có nhiều loại thuốc trừ sâu được sử dụng tại các khu vực điều tra. Hoạt chất Chlorpyrifos ethyl cũng được sử dụng khá phổ biến ở Cai Lậy - Tiền Giang và Phụng Hiệp - Hậu Giang với 54,29% nông dân sử dụng và 40,06% diện tích trồng lúa tại khu vực điều tra. Liều lượng sử dụng cao gấp 2 đến 8 lần so với liều lượng khuyến cáo.
Từ 13 mẫu đất trên mô hình chuyên lúa được thu từ hai loại đất phù sa ngọt và đất phèn đã phân lập được 2 hệ vi khuẩn ký hiệu PH_C3.1 và PH_C4.3 có khả năng phân hủy Chlorpyrifos ethy tương ứng từ 13,96% và 49,72% sau 30 ngày nuôi cấy trong môi trường MM có chứa Chlorpyrifos ethyl nồng độ 20 ppm như là nguồn carbon duy nhất.
4.2 Đề nghị
Định danh hai dòng vi khuẩn PH C3.1 và PH C4.3.
Tiếp tục bố trí thí nghiệm đánh giá khả năng phân hủy của hai dòng vi khuẩn PH C3.1 và PH C4.3 vào môi trường đất.
Tìm kiếm môi trường thuận lợi cho sự phát triển của các dòng vi khuẩn trên nhằm hướng đến việc kích thích sự sinh trưởng và tăng cường khả năng phân hủy Chlorpyrifos ethyl của hai này.
32
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Agnihotri, N.P., Paney, S.Y., Jain, H.K. and Srivastava, K.P., 1981. Persistence, leaching and movement of chlorfenvinphos, chlorpyrifos, disulfoton, fensulfothion, monocrotophos and tetrachlorvinphos in soil. Indian Journal of Agricultural Chemistry, 24: 27-31.
2. Andreu, V. and Picó, Y., 2004. Determination of pesticide and their degradation products in soil: critical review and comparision of methods. Trends in Analytical Chemistry 23. 10-11.
3. Anonymous, 2009. Environmental protection, environmental fate, http://www.al.gov.bc.ca/ pesticides/c_2.htm. 28 April 2009.
4. Anwar, S., F. Liaquat, Q.M.Khan, Z.M.Kalid and S.Iqal, 2009. Biodegradation of chlorpyrifos and its hydrolysis product 3,5,6-trichloro-2-pyridinol by Bacillus pumilus strain C2A1. Journal of Hazardous Materials, 168(1), pp 400-405.
5. Castro, J., C. Sanchez-Brunete, J.A. Rodriguez and J.L. Tadeo, 2002. Persistence of chlorpyrifos, and endosulfan in soil. Bulletin of Environmental, 11(9a): 578-582. 6. Chapman, R.A. and C.R. Harris, 1980. Persistence of chlorpyrifos in a mineral and organic soil. J. Environ. Sci. Health, Part B. 15: 39-46.
7. Đoàn Mạch Trường, 2012. Sản xuất và xuất khẩu lúa gạo của Việt Nam (giai đoạn 1990-2012). Viện lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long.
8. Fontaine DD & Teeter D, 1987. Photodegradation of Chlorpyrifos in the Vapour Phase. ABC Laboratories. Dow Chemical Company Report No GH-C 1911 dated 5 June 1987. Unpublished.
9. Gangming Xu, Wei Zheng, Yingying Li, Shenghui Wang, Jingshun Zhang, Yanchun Yan, 2008. Biodegradation of chlorpyrifos and 3,5,6-trichloro-2-pyridinol by a newly isolated Paracoccus sp. strain TRP. International biodeterioration and biodegradation, volume 62, Issue 1, p 51–56.
10. Gilani, S. T. S., Ageen, M., Shah, H., Raza, S., 2010. Chlorpyrifos degradation in soil and its effect on soil microorganisms. The Journal of Animal & Plant Sciences.
99-102.
11. Havens PL, Kieatiwong S & Shepler K, 1992. The Photochemical Degradation of Chlorpyrifos on Soil by Natural Sunlight. PTRL Project No 254W. Dow Chemical Company Study ID 90075 dated 21 September 1992. Unpublished.
33
12. Hayward, S.J., T. Gouin, F. Wania, 2010. Levels and seasonal variability of pesticides in the rural atmosphere of Southern Ontario. J. Agric. Food Chem., 58: 1077-1084.
13. Howard, P.H, 1991. Handbook of environmental fate and exposure data for organic chemicals: Pesticides. Lewis publishers. Chelsea, MI.
14. Hồ Thị Thùy Dương, 2002. Sinh học phân tử. NXB Giáo dục, TP. Hồ Chí Minh. 15. Ihrmark, K; Inga, T.M; Bödeker, K.C.M; Hanna, F; Ariana, K; Jessica, S; Ylva, S; Jan S; Mikael, B.D; Karina, E.C; Björn, D.L, 2012. New primers to amplify the fungal ITS2 region – evaluation by 454-sequencing of artificial and natural communities. Article first published online: 27 JUL 2012.DOI: 10.1111/j.1574- 6941.2012.01437.x.
16. Keouth, T., J. Versaalovic and R. Lupski, 2008. Differential sudsequece conservation of interspersed repetitive Streptococcus pneumonia Box elements in diverse bacteria. Genome Res. 408-18.
17. Kerle EA, Jenkins JJ and Vogue PA, 2007. Understanding pesticide persistence and mobility for groundwater and surface water protection. Oregon State Univ Extension Service, EM8561-E.
18. Kishi, M., N. Hirschhorn, M. Qjajadisastra, L. N. Satterlee, S. Strowman and R. Dilts, 1995. Relationship of pesticide spraying ti signs ang symptoms in Indonesian farmers. Scand. J. Work Environ. Health 21, 124-33.
19. Lê Huy Bá, 2008. Độc chất môi trường. NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. 20. Lê Minh Uy (Trung tâm Y tế dự phòng tỉnh An Giang), 2009. Hóa chất trừ sâu và sức khỏe. Bài tham luận Hội thảo “Nâng cao ý thức cộng đồng trong việc sử dụng thuốc BVTV theo hướng an toàn”. Tổ chức tại Châu Thành, An Giang, ngày 16/04/2009.
21. Lê Văn Khoa, 2010. Ô nhiễm môi trường đất và biện pháp xử lý, Nxb. Nhà xuất bản Giáo Dục & Đào Tạo, tr.104-114.
22. Linde, C.D, 1994. Physico-chemical properties and environmental fate of pesticides. Environmental hazards assessment program. California, Environmental Protection Agency, Department of Pesticide Regulation, Environmental Monitoring
and Pest Management Branch, EH94-03.
34
23. Lyman, W., W. Reehl and D. Rosenblatt, 1990. Handbook of Chemical property estimation methods, environmental behavior of organic solvents. American Chemical Society.
24. Mallick BK, Banerji A, Shakil NA, Sethunathan NN, 1999. Bacterial degradation of chlorpyrifos in pure culture and in soil. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 62(13) :48- 55.
25. Mauldin, Richard E.; Primus, Thomas M.; Buettgenbach, Theresa A.; Johnston, John J.; and Linz, G.M., 2006. A Simple HPLC Method for the Determination of Chlorpyrifos in Black Oil Sunflower Seeds. USDA National Wildlife Research Center - Staff Publications. Paper 424.
26. McEwen, F and G. Stephenson, 1979. The use and significance of pesticides in the environment. John Wiley Press, New York.
27. Nguyen Khoi Nghia, 2007. Degradation of aged creosote và diesel contaminated soils by phytoremediation or biostimulation (nutrients). Master thesis in Soil Science, SLU. Uppsala 2007. 75.
28. Nguyễn Thị Lan Hương, 2013. Khảo sát lưu tồn và phân hủy sinh học Chlopyrifos Ethyl trên mô hình canh tác rau màu tại một số huyện thuộc ĐBSCL. Luận văn thạc sĩ ngành Sinh thái học. Đại học Cần Thơ.
29. Nguyễn Thị Phi Oanh, 2011. Phân lập và khảo sát khả năng phân hủy nông dược của vi sinh vật ở một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long. Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ. Trường Đại học Cần Thơ.
30. Nguyễn Trần Oánh, 2007. Giáo trình Sử dụng Thuốc Bảo vệ Thực Vật. Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội.
31. Pike, K.S. and L.W. Getzin, 1981. Persistence and movement of chlorpyrifos in sprinkler- irrigated soiol. J. Econ. Entomol. 74: 385-388.
32. Pimental, D., H. Acqay and M. Biltonen, 1992. Enviromenttal and economics costs of pesticide use. Bioscience 42, 750-60.
33. Phạm Thành Nhơn, 2005. Đánh giá sự lưu tồn của thuốc Bảo vệ thực vật và kim loại nặng trong môi trường đất và nước ngầm ở tỉnh Trà Vinh. Luận văn Thạc sĩ. Trường Đại học Cần Thơ.
34. Racke KD, Coats JR, 1990. Pesticides in soil microbial ecosystems. Am. Chem. Soc. Symp. Ser. 426:1-12.
35
35. Racke KD, Steele KP, Yoder RN, Dick WA & Avidov E, 1996. Factors Affecting the Hydrolytic Degradation of Chlorpyrifos in Soil. J Agric Food Chem, 44: 1582-1592.
36. Rani, M.S., Lakshmi, K. V., Devi, P. S., Madhuri, R. J., Aruna, S., Jyothi, K., Narasimha, G., and Venkateswarlu, K, 2008. Isolation and characterization of a chlorpyrifos degrading bacterium from agricultural soil and its growth reponse.
African Journal of Microbiology Research 2. 26-31.
37. Ranjan, K. B and Malik, A, 2008. Utilization of Chlorpyrifos as a sole source of cacbon by bacteria isolated from wastewater Irrigated Agriculture Soil in an Industrial Area of Western Uttar Pradesh, India. Reseach Journal of Microbiology3, 293-307. 38. Rosenstock, L., M. Keifer, E. Daninell, R. McConnell, K. Claypoole, 1991. Chronic central nervous system effects of acute organophosphate pesticide intoxication. Lancet 338, 223-27.
39. Shahida Akhtar, Syeda Talat Shaheen Gilani and Nusrat Hasan, 2004. Persistence of Chlorpyrifos and Fenpropathrin alone and in combination with fertilizer in soil and their effect on soil microbes. Pak. J. Bot 36, 863-870.
40. Singh, B.K., Walker, A. and Wright, D.J, 2002. Degradation of chlorpyrifos, fenamiphos and chlorothalonil alone and in combination and their effect on soil microbial activity. Environmental Toxicology and Chemitry, 21.
41. Singh, B.K., Walker, A., Morgan, J.A.W. and Wright, D.J, 2003. Effect of soil pH on the biodegradation of chlorpyriphos and isolation of a chlorpyriphos-degrading bacterium. Applied and Evironmental Microbiology, 69.
42. Singh, B.K., Walker, A., Morgan, J.A.W. and Wright, D.J, 2004. Biodegradation of chlorpyrifos by Enterobacter strain B-14 and its use in bioremediation of contaminated Soils. Applied and Environmental Microbiology, 70: 4855-4863.
43. Smith M.D., Hartnett D.C. and Rice C.W, 2000. Effects of long-term fungicide applications on microbial properties in tallgrass prairie soil. Soil Biol. Biochem, 32, 935-946.
44. Sở NN & PTNT An Giang, 2009. Báo cáo kết quả chuyển giao tiến bộ kỹ thuật trên lúa giai đoạn 2005-2008 và kế hoạch 2009-1010.
36
45. Tagatz ME, Gregory NR, Plaia GR, 1982. Effects of chlorpyrifos on field-and laboratory-devel- oped estuarine benthic communities. J Toxicol Environ Health 10:411–421.
46. Tomlin, C. (ed.), 2000. The pesticide manual. British Crop Protection Council and The Royal Soc. of Chem., Cambridge.
47. Trần Quang Hùng, 1999. Thuốc bảo vệ thực vật. NXB Nông nghiệp, Hà Nội. 48. Trung tâm Tin học và Thống kê, 2012. Báo cáo kết quả thực hiện kế hoạch 4 tháng năm 2012 ngành nông nghiệp và phát triển nông thôn. Bộ Nông Nghiệp và PTNT, Hà Nội.
49. US EPA, 1989. Registration Standard (Second Round Review) for the Reregistration of Pesticide Products Containing Chlorpyrifos. Office of Pesticide Programs, US EPA, Washington, DC.
50. WHO, 1990. Public health impact of pesticides used in agriculture.
51. Yang Chao, Na Liu, Xinmin Guo and Chuanling Qiao, 2006. Cloning of mpd gene from a chlorpyrifos-degrading bacterium and use of this strain in bioremediation of contaminated soil. FEMS Microbialogical Review 265, 118-125.
52. Zahm, M. H. W. and A. Blair, 1997. Pesticides and cancer. In: Occupational medicine: State of the Art Reviews, M. Keifer (ed.) Vol. 12: Pesticides. Hanley and Belfus, Inc., Philadelphia, 269-89.
i
PHỤ CHƯƠNG I
CÁC PHƯƠNG TIỆN VÀ QUY TRÌNH THÍ NGHIỆM Phụ chương 1: Phiếu điều tra tình hình sử dụng thuốc BVTV
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ Mã số phiếu: …………..
KHOA NÔNG NGHIỆP & SHƯD BỘ MÔN KHOA HỌC ĐẤT
PHIẾU ĐIỀU TRA
HIỆN TRẠNG SỬ DỤNG THUỐC BVTV TRÊN LÚA 1. Thông tin chung
Tên người điều tra:...Ngày điều tra:……/……./20…… Tên nông dân:………..Nam , Nữ , Tuổi:…….. Trình độ học vấn:……/12.
Địa chỉ: Ấp:………….. Xã:……….. Huyện……… Tỉnh:………. Diện tich trồng:……….m2.
Thời gian canh tác:………năm.
Loại đất: Phù sa Sét Cát Thịt Nhiễm phèn Từ tháng ……….. đến tháng………….
2. Kỹ thuật canh tác
Giống:……….. Thời gian sinh trưởng:……… ngày. Kỹ thuật làm đất:
Bón vôi: Có Không Liều lượng:……… kg/1000m2. Xử lý thuốc: Có Không Làm đất: Có Không Chuẩn bị đất: Cày Xới
Phơi đất: Có Không Thời gian phơi:……….. ngày. Kỹ thuật tưới: Tự chảy Bơm bằng động cơ Nguồn nước tưới tiêu:……. Có làm 3 vụ không? Có Không
Nếu có Thời gian nghỉ giữa vụ:………….. ngày. Đất có ngập nước trong thời gian nghỉ giữa hai vụ?
ii
Có Không Lý do ngập: Mưa, lũ Chủ động xã lũ Thời gian rút nước trong vụ:……… ngày.
Thời điểm xuống giống và năng suất: Thời điểm thực hiện
(tháng) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Thời vụ Năng suất
3. Phân bón (bao gồm phân hóa học & hữu cơ, hữu cơ vi sinh)
Loại phân Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5 NSKS Liều lượng NSKS Liều lượng NSKS Liều lượng NSKS Liều lượng NSKS Liều lượng
4. Sâu, bệnh : Điều tra riêng lẻ cho vụ ĐX, HT, TĐ
STT Loại dịch hại (Sâu, bệnh, cỏ dại, ốc, chuột) Tên thuốc Liều lượng/công Nồng độ
Thời điểm phun,
rãi thuốc Ghi chú ĐÔNG XUÂN 1 2 3 4 HÈ THU 1 2 3
iii 4 THU ĐÔNG 1 2 3 4 5. Chi phí sản xuất Mùa vụ Tổng chi phí/ Công Chi phí (1.000 đồng) Ngày công lao động Doanh thu/công
Giống Thuốc Phân bón Khác (bơm nước, cắt cỏ, thu hoạch) Đông xuân Hè thu Thu đông
6. Thông tin khác liên quan đến việc sử dụng thuốc BVTV của nông dân:
Tình hình sử dụng thuốc BVTV (loại thuốc, lượng thuốc sử dụng) trong 20 năm trở lại đây (quan tâm nhiều hơn đến 10 năm cuối, chú ý đến các loại thuốc gốc chlor).
……… ………
Người điều tra Phụ chương 2: Môi trường nuôi cấy
Dung dịch đệm phosphate ( Phostphate buffer) dùng để trích vi khuẩn từ đất:
23,99 gram NaH2PO4 và 15,59 gram Na2HPO4 pha trong một lít nước khử khoáng.
Môi trường Tryptose Soybean Agar (TSA): 30 gram Tryptone Soya Broth (TSB), 15
gram Agar pha trong một lít nước khử khoáng.
Môi trường MM (Mineral Minimal Medium): 870 mL nước khử khoáng được khử
iv
dung dịch đệm, 100 mL dung dịch muối khoáng và 5 mL dung dịch vi lượng. Các dung dịch trên được pha như sau:
+ Dung dịch đệm (buffer solution): 35 gram Na2HPO4.2H2O, 4 gram KH2PO4 pha trong một lít nước cất.
+ Dung dịch muối khoáng (mineral salt solution): 10 gram (NH4)2SO4, 2 gram MgCl2.6H2O, 1 gram Ca(NO3)2.4H2O pha trong một lít nước khử khoáng.
+ Dung dịch vi lượng (trace element): 273 gram NaCl, 8,2 mg MnCl2.2H2O, 1,5mg CuSO4.5H2O, 2mg ZnCl2, 0,6 mg, SnCl2.2H2O, 2mg KBr, 5,8mg BaCl2.2H2O, 470 mg FeCl2.4H2O, 4 mg CoCl2.6H2O, 3 mg Na2MoO4.2H2O, 0,7mg LiCl.H2O, 1 mg H3BO3, 2 mg KI. Khử trùng bằng màng lọc có đường kính 0,2µm và trữ ở nhiệt độ 40C. Tất cả các môi trường trước khi sử dụng được khử trùng ướt ở 1210C trong 20 phút.
Phụ chương 3: Quy trình trích DNA trong dung dịch bằng CTAB
Cân 0,45 gram cát mịn sạch, đã tiệt trùng cho vào các eppendorf 1,5 mL. Lấy từ 8-10 khuẩn lạc đã thuần từ đĩa môi trường TSA cho vào eppendorf.
Cho 1 mL CTAB 3% vào mỗi eppendorf, trộn đều hỗn hợp khuẩn lạc và cát trong dung dịch CTAB.
Vortex các eppendorf sau đó đem ủ ở 65oC trong 1-2 giờ, cách 15 phút lắc đều các eppendorf để mẫu nóng đều.
Ly tâm ở tốc độ 13.000 vòng/phút trong 10 phút.
Chuyển 700 µL dịch trong bên trên cho sang eppendorf 1,5 mL mới.
Cho thêm 500 µL chloroform vào 700 µL dịch trong vừa chuyển và vortex nhanh để tăng sự tiếp xúc của mẫu và chloroform.
Ly tâm ở tốc độ 13.000 vòng/phút trong 8 phút.
Chuyển 500 µL dịch trong bên trên sang eppendorf 1,5 mL mới. Kết tủa DNA bằng 750 µL isopropanol lạnh, giữ lạnh trong 30 phút. Ly tâm mẫu ở tốc độ 13000 vòng/phút trong 30 phút.
Loại bỏ isopropanol cẩn thận, tránh làm trôi DNA. Làm sạch DNA bằng 200 µL ethanol lạnh.
Ly tâm ở tốc độ 6.500 vòng/phút trong 5 phút. Loại bỏ ethanol và để khô mẫu qua đêm.
v
Cho thêm 30-100 µL TE vào để trữ mẫu và cho vào tủ đông ở -20oC.
Phụ chương 4: Quy trình điện di gel chứa sản phẩm phản ứng Box-PCR Bước 1: Chuẩn bị gel agarose 1,5% (Merck)
Đặt khay nơi bằng phẳng, để khuôn vào khay, đặt lược vào khuôn, kiểm tra sự cân bằng của khay bằng miếng bọt khí. Cân 0,15 gram agarose cho vào bình tam giác dung tích 100 mL, thêm 100 mL dung dịch TBE 1X đối với gel 20 giếng, lắc nhẹ cho agarose tan đều. Đặt bình tam giác vào lò vi sóng, đun ở chế độ phù hợp khoảng 3-4 phút cho agarose hòa tan hoàn toàn, tạo thành một dung dịch trong suốt. Lấy bình tam giác ra khỏi lò vi sóng; đậy giấy bạc lại trành bay hơi; để nguội khoảng 500C; bổ sung 1 L Ethidium Bromide; lắc đều. Đổ nhẹ dung dịch vào khuôn đã chuẩn bị sẵn, tránh bọt khí, để nguội khoảng 60 phút cho gel đặt lại, lấy nhẹ lược ra khỏi khuôn, tránh bể giếng, lấy khuôn gel ra khỏi khay chuẩn bị chạy điện di.
Bước 2: Chạy điện di trên gel agarose
Đặt khuôn gel vào bể điện di TBE buffer 1X cho ngập giếng. Load (nạp) vào mỗi giếng 4 L dung dịch sản phẩm. Load khoảng 2 L thang chuẩn vào giếng còn lại, Bật nguồn điện cho thiết bị chạy ở 150V trong 65 phút. Quan sát khi thấy chất chỉ thị màu di chuyển đến gần cuối gel (khoảng 1-1,5 cm), tắt nguồn điện, lấy khuôn gel ra khỏi thiết bị điện di chuẩn bị chụp hình gel.
Bước 3: Chụp hình gel đã chạy điện di
Sau khi chạy điện di sản phẩm phản ứng Box-PCR, quan sát kết quả các băng