khảo sát sự đa dạng di truyền của vi khuẩn edwardsiella ictaluri gây bệnh trên cá tra (pangasianondon hypophthalmus) ở đồng bằng sông cửu long

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN DƯƠNG THANH QUY KHẢO SÁT SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri GÂY BỆNH TRÊN CÁ TRA (Pangasianondon hypophthalmus) Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2014 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN DƯƠNG THANH QUY KHẢO SÁT SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri GÂY BỆNH TRÊN CÁ TRA (Pangasianondon hypophthalmus) Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Cán hướng dẫn PGs. Ts. Từ Thanh Dung 2014 KHẢO SÁT SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri GÂY BỆNH TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypopthalmus) Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG Dương Thanh Quy1 Từ Thanh Dung2 (1) Lớp nuôi trồng thủy sản k37, khoa thủy sản, trường Đại học Cần Thơ (2) Bộ môn Bệnh học thủy sản, khoa Thủy sản, trường Đại học Cần Thơ Email: quy112899@student.ctu.edu.vn ABTRAST This study was carried out to assess phylogenetic diversity of Edwarsiella ictaluri isolates collected from striped catfish intensively farmed in the Mekong Delta, Vietnam. A total of 14 bacterial isolates were isolated and identified from diseased catfish by using PCR technique based on the upstream region of fimbrial gene cluster. The results determined that they were E. ictaluri positive with specific DNA band for the upstream region of fimbrial gene appeared at 470 bp. Ten isolates were chosen to sequence, the nucleotide blast result showed that these strains had high homology/identity (96-100%) compared with reference strains of Edwardsiella ictaluri on Genbank (NCBI). These strains were used for analyzing phylogenetic diversity. The result indicated that Tien Giang and Tra Vinh strains had close relationship and had hight similarity other in Can Tho, An Giang, Vinh Long, and Dong Thap provinces. However, the study found that there are no genetic differences between Edwardsiella ictaluri strains in two differently ecological areas of brackish and fresh water in the Mekong Delta. Title: Analysis of phylogenetic diversity of Edwarsiella ictaluri from striped catfish (Pangasianodon hypopthalmus) farmed in the Mekong Delta. Keywords: catfish, Edwarsiella ictaluri, Pangasianodon hypophthalmus, phylogenetic diversity, Mekong Delta. TÓM TẮT Mục đích nghiên cứu nhằm khảo sát đa dạng di truyền chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ tra nuôi Đồng sông Cửu Long. Tổng số 14 chủng vi khuẩn phân lập định danh Kỹ thuật PCR dựa vùng “upstream” gen bám dính. Kết cho thấy chủng vi khuẩn phân lập cho phản ứng dương tính DNA xuất vạch 470 bp. Mười chủng vi khuẩn phân lập đại diện cho tỉnh An Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ, Vĩnh Long, Tiền Giang, Trà Vinh chọn giải trình tự vùng “upstream” gen bám dính, kết cho mức tương đồng cao (96-99%) với chủng ngân hàng GenBank (NCBI). Phân tích đa dạng di truyền 10 chủng vi khuẩn giải trình tự, kết cho thấy chủng phân lập có đặc điểm di truyền giống nhau, chủng từ Tiền Giang, Trà Vinh có vị trí giáp biển kết cho thấy khác biệt di truyền nhiều với chủng Cần Thơ, An Giang, Vĩnh Long, Đồng Tháp. Kết đề tài tiền đề nghiên cứu ứng dụng vắcxin phòng ngừa bệnh loài vi khuẩn gây bệnh gây ra. I. GIỚITHIỆU Ngành công nghiệp cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) phát triển nhiều năm qua trở thành mặt hàng xuất mũi nhọn Việt Nam nói chung Đồng sông Cửu Long (ĐBSCL) nói riêng. Tuy nhiên, năm qua, mật độ thâm canh hóa không ngừng tăng dẫn đến tình trạng ô nhiễm môi trường, tạo điều kiện cho dịch bệnh phát triển gây thiệt hại nghiêm trọng cho người nuôi. Trong bệnh gây thiệt hại lớn cho nghề nuôi cá tra ĐBSCL bệnh gan thận mủ vi khuẩn Edwardsiella ictaluri (E. ictaluri) gây (Crumlish et al., 2002). Ngoài ra, vi khuẩn gây bệnh xác nhận Mỹ (Hawke et al., 1986), Thái Lan (Kasornchndra et al., 1987), Indonesia (Yuasa et al., 2003) Thổ Nhĩ Kì (Keskin et al., 2004). Vi khuẩn E. ictaluri coi tác nhân đặc thù gây bệnh chủ yếu cá da trơn nuôi công nghiệp nhiều nước giới. Vi khuẩn E. ictaluri vi khuẩn Gram âm, hình que, không sinh bào tử, yếm khí tùy tiện, phản ứng Oxidase âm tính, Catalase dương tính (Plum, 1999; CrumLish et al., 2002; Từ Thanh Dung ctv, 2004). Bệnh vi khuẩn gây gây thiệt hại lớn cho người nuôi cá tra ĐBSCL. Bên cạnh đó, thuốc kháng sinh biện pháp chữa bệnh phổ biến, gây tượng kháng thuốc vi khuẩn vi khuẩn môi trường xung quanh (Từ Thanh Dung, 2010), tình trạng sử dụng kháng sinh tràn lan, không kiểm soát ngày làm cho tình hình dịch bệnh diễn biến phức tạp gây khó khăn cho ngành xuất cá tra. Năm 20l0, theo kết nghiên cứu Nguyễn Thiện Nam ctv, hầu hết vi khuẩn E. ictaluri kháng với streptomycin, chloramphenocol (95%), florfenicol, enrofloxacin (77,5%), doxycycline (67,5%) 97,5% chủng vi khuẩn biểu đa kháng thuốc (kháng từ loại kháng sinh). Hơn nữa, theo kết kháng sinh đồ Phạm Thanh Hương (2010), cho thấy vi khuẩn E. ictaluri kháng với loại kháng sinh streptomycin (84,1%), enrofloxacin (74,5%); kháng hoàn toàn với flumequin, trimethoprim + sunfamethoxazol; nghiên cứu phát có 96% chủng vi khuẩn E.ictalluri biểu đa kháng. Trước tình hình đó, để giảm thiệt hại bệnh vi khuẩn gây việc sử dụng vắc-xin để phòng ngừa bệnh điều cần thiết. Để thực điều đó, trước hết cần phải khảo sát đa dạng di truyền chủng vi khuẩn gây bệnh nguy hiểm này. Trên giới có nhiều nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn E. ictaluri. Nghiên cứu Sakai et al (2009), áp dụng biện pháp khuếch đại chiều dài đoạn gen đa hình chủng vi khuẩn E. ictaluri (Amplified- Fragment Length Polymorphism, AFLP), kết cho thấy, có khác biệt di truyền chủng vi khuẩn phân lập từ Mỹ so với chủng phân lập từ Nhật Bản Indonesia, vi khuẩn E. ictaluri phân lập thủy vực Indonesia có khác biệt di truyền khác thời gian phân lập, chủng phân lập Mỹ có khác biệt di truyền khác biệt sinh thái thủy vực. Ở ĐBSCL có tỉnh nuôi thâm canh cá tra nằm vùng sinh thái nước ngọt, lợ. Vấn đề đặt vùng sinh thái nước lợ nuôi cá tra ĐBSCL có ảnh hưởng tới tính đa dạng di truyền vi khuẩn E. ictaluri hay không? Và vi khuẩn gây bệnh cá tra tỉnh khác có khác hay không? Xuất phát từ thực tế trên, đề tài “Khảo sát đa dạng di truyền vi khuẩn Edwarsiella ictaluri gây bệnh cá tra nuôi (Pangasianodon hypophthalmus) Đồng sông Cửu Long” thực với mục tiêu: phân lập, định danh khảo sát đa dạng di truyền số chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ cá tra nuôi thâm canh số tỉnh ĐBSCL. II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Phân lập định danh vi khuẩn E. ictaluri theo phương pháp truyền thống Đề tài thu 25 mẫu cá tra bệnh thu số ao có dấu hiệu bệnh gan thận mủ số tỉnh ĐBSCL Vĩnh Long, Đồng Tháp, An Giang, Tiền Giang, Trà Vinh, Cần Thơ năm 2014 vi khuẩn E. ictaluri phân lập từ ao khác dựa theo tài liệu Frerich and Millar (1993). Tách ròng trên môi trường Trypton soy agar (TSA) ủ 28oC 48h. Sau tiến hành trữ vi khuẩn môi trường Brain heart in broth (BHIB) có bổ sung 20% glycerol bảo quản -80oC sử dụng. Các đặc điểm hình thái sinh hóa vi khuẩn kiểm tra màu sắc khuẩn lạc, tính di động, nhuộm Gram, phản ứng Oxidase/Catalase phản ứng O/F theo cẩm nang Cowan Steel (Barrow Feltham, 1993) tài liệu hướng dẫn Buller (2004). 2.2 Tiến hành phản ứng Polymerase chain reaction (PCR) xác định E. ictaluri Ly trích DNA Các chủng vi khuẩn sau nuôi tăng sinh môi trường BHIB ly trích DNA dựa theo tài liệu Moore et al (2004). Các bước thực gồm: hút ml dung dịch nuôi cấy cho vào tube 2,2 ml, ly tâm 13000 vòng/phút phút, loại bỏ phần dung dịch phía trên. Cho vào tube 300 µl Lysis buffer (Tris [pH 8.0] M, EDTA [pH 8.0], NaCl M, SDS 10%, H2O), cho viên bi sắt vào tube lắc máy lắc, hút thêm 700 µl Lysis bufer cho vào tube, ủ nhiệt độ phòng 10 phút. Ly tâm 13000 vòng/phút phút, lấy 700 µl dung dịch phía chuyển sang tube mới. Cho 700 µl Ethanol 95% vào dung dịch, ly tâm 13000 vòng/phút, bỏ phần dung dịch phía (chỉ lấy kết tủa). Rửa kết tủa 500 µl Ethanol 70%, ly tâm 13000 vòng/phút phút. Bỏ phần dung dịch phía trên, sấy khô chân không 10 phút. Hòa tan kết tủa 100 µl TE 0,1X (Tris pH8 M, EDTA 0,5 M, H20). Trữ mẫu -20oC trình sử dụng. Tiến hành phản ứng PCR Sau ly trích, tiến hành thực phản ứng PCR khuếch đại đoạn DNA nằm vùng “upstream” gen bám dính có kích thước 470 bp, phản ứng PCR thực dựa theo qui trình Sakai et al., (2009(b)) với cặp mồi có trình tự: Edi_F: 5’CAGATGAGCGGATTTCACAG-3’ ;Edi_R5’-GCGCAATTAACATAGAGCC-3’. Thành phần phản ứng PCR gồm 2,5 µl dung dịch đệm Buffer 1X (Tris HCl 100 mM KCl 500 mM), µl MgCl2 1,5 mM, µl dNTPs (deoxyribonucleotide triphosphate) 200 µM, µl primer (EdiF) 0,4 µM, µl Primer (EdiR) 0,4 µM, 0,25 µl Taq DNA polymerase 2,5 UI, µl 20 ng DNA, thêm nước 25 µl. Chu trình nhiệt phản ứng PCR thực theo Sakai et al (2009(b)) bao gồm: Biến tính ban đầu phút 94oC, sau thực khuếch đại 30 chu kì gồm giai đoạn biến tính 94oC 30 giây, gắn mồi 65oC 30 giây, kéo dài 72oC phút, giai đoạn kéo dài ổn đinh sản phẩm thực phút 72oC. Điện di sản phẩm PCR giải trình tự Sản phẩm PCR sau phản ứng trộn với 2-3 µl dung dịch Loading Buffer trước chạy điện di gel agarose 1,5%. Sau đó, chọn 10 chủng vi khuẩn E. ictaluri đại diện cho tỉnh gởi sang công ty Macrogen, Hàn Quốc để giải trình tự. (website: http://dna.macrogen.com/ (các chủng đánh dấu (*) Bảng 1)). 2.3 Phân tích đa dạng di truyền Kết mẫu sau giải trình tự xếp hàng (alignment) phần mềm ClustalW (DNA Data Bank of Japan; http: Clustalw.ddbj.nig.ac.jp/top-j.html). Cây phả hệ (Phylogenetic tree) xây dựng phần mềm Mega (Tamura et al.,2013) thuật toán Neighbor-joining với giá trị bootstrap 1000 lần lặp lại. III. KẾT QUẢ 3.1 Phân lập vi khuẩn Đề tài thu 25 mẫu cá tra từ ao có dấu hiệu bệnh gan thận mủ với dấu hiệu bên xuất huyết, mắt lồi, xuất nhiều đốm trắng đục có kích cỡ 1-3 mm gan, thận tỳ tạng phân lập 14 chủng vi khuẩn. Nguồn gốc chủng vi khuẩn phân lập trình bày Bảng 1. Bảng 1. Các chủng vi khuẩn E. ictaluri phân lập từ cá tra bệnh gan thận mủ ĐBSCL Stt Địa phương Cần Thơ Vĩnh Long An Giang Đồng Tháp Tiền Giang Trà Vinh Tổng cộng: Số mẫu thu thập 4 4 25 Các chủng phân lập 17ED4* 42ED4* 20ED4*, 21ED4*, 29ED4 11ED4*, 12ED4*, 31ED4, 34ED4 13ED4*, 15ED4 2ED4*, 3ED4*, 51ED4* 14 Thời gian 2014 2014 2014 2014 2014 2014 Ghi chú: kí hiệu số thứ tự chủng phân lập, kí hiệu tên vi khuẩn năm phân lập, kí hiệu tên viết tắt tỉnh; * chủng chọn giải trình tự khảo sát đa dạng di truyền. 3.2 Kiểm tra tiêu hình thái, sinh lý, sinh hóa Vi khuẩn E. ictaluri phân môi trường TSA 48h ủ 28oC tủ ấm. Kết cho thấy khuẩn lạc có màu trắng đục, nhỏ, không nhân rìa có dạng không đồng (Hình 1A). Kết kiểm tra tính di động vi khuẩn kính hiển vi với vật kính 100X cho thấy, vi khuẩn có khả di động. Kết nhuộm Gram cho thấy tất, chủng vi khuẩn không bắt màu tím xanh thuốc nhuộm Crystal Violet mà bắt màu đỏ Fushin. Qua cho thấy chủngvi khuẩn phân lập Gram âm (Hình 1B). A B Hình 1.Kết phân lập vi khuẩn E. ictaluri môi trường TSA 48h nhuộm Gram vi khuẩn A: Hình thái khuẩn lạc môi trường TSA B: Kết nhuộm Gram vi khuẩn E. ictaluri chụp kính hiển vi 100X Khuẩn lạc chủng vi khuẩn phân lập môi trường TSA 48h thử nghiệm để kiểm tra diện enzym catalase cytochrome oxidase. Khi thử nghiệm catalase (H2O2, 3%) tất chủng vi khuẩn cho tượng sủi bọt khí, điều chứng tỏ vi khuẩn có hệ enzyme catalase để phân giải H2O2 thành nước oxi hay nói cách khác chủng vi khuẩn dương tính với Catalase. Khi thử nghiệm Oxidase cách cho vi khuẩn tiếp xúc với giấy lọc có tẩm thuốc thử Tetramethyl- p- phenylendiamin dihydrochlorid, chủng vi khuẩn cho kết âm tính không làm đổi màu giấy lọc từ trắng sang tím. Khuẩn lạc chủng vi khuẩn phân lập kiểm tra khả oxi hóa lên men đường glucose (O-F test). ống phủ 0,5-1 ml parafin tạo điều kiện yếm để kiểm tra khả lên men (F), ống lại tạo điều kiện hiếu khí để kiểm tra khả oxi hóa (O), kết cho thấy tất chủng vi khuẩn làm đổi màu ống nghiệm chứa môi trường O/F từ màu xanh sang màu vàng. 3.3 Kết xác định vi khuẩn E. ictaluri dựa vào vùng “upstream” gen bám dính PCR Vi khuẩn phân lập định danh kỹ thuật PCR khuếch đại vùng “upstream” gen bám dính với cặp mồi đặc hiệu Edi_F Edi_R. Kết sau phản ứng PCR 14 chủng vi khuẩn phân lập xuất band ADN 470 bp (Hình 2). Kết cho thấy 14 chủng vi khuẩn phân lập định danh kỹ thuật PCR vi khuẩn E. ictaluri gây bệnh gan thận mủ. L 500bp 470bp Hình 2. Kết chạy điện di sản phẩm PCR dựa vùng “upstream”của gen bám dính vi khuẩn E. ictaluri (Chú giải : 1_17ED4(CT); 2_21ED4(AG); 3_20ED4(AG); 4_51ED4(TV); 5_3ED4(TV); 6_2ED4(TV). Kết giải trình tự 10 chủng vi khuẩn E. ictaluri phân lập nhận từ công ty Macrogen, Hàn Quốc. Sử dụng chương trình BLASTN để so sánh mức độ đồng hình trình tự chủng vi khuẩn phân lập với trình tự chủng vi khuẩn ngân hàng gen trang NCBI BLAST. Kết thu cho thấy 100% chủng vi khuẩn phân lập thuộc loài Edwardsiella ictaluri. Trình tự “upstream” gen bám dính chủng vi khuẩn phân lập có tỉ lệ tương đồng cao với với trình tự vùng “upstream” gen bám dính chủng ngân hàng liệu NCBI 96-99%. (Bảng 2). Hình 3. Kết so sánh tính tương đồng chủng 13ED4 so với vi khuẩn E. ictaluri ngân hàng liệu NCBI Hình 4. Kết so sánh tính tương đồng chủng 42ED4 so với vi khuẩn E. ictaluri ngân hàng liệu NCBI Kết giải trình chủng vi khuẩn phân lập so sánh với trình tự chủng ngân hang gen (Bảng 2), kết cho thấy trình tự nucleotide vùng upstream gen bám dính 10 chủng phân lập có mức tương đồng cao (96-99%) với trình tự nucleotide vùng upstream gen bám dính chủng ngân hàng liệu (NCBI). Trình tự chủng phân lập 2ED4(TV), 13ED4(TG), 12ED4(DT) có mức tương đồng thấp 96%, chủng phân lập lại có mức tương đồng 99% với dòng ngân hàng liệu. Bảng 2. Kết xác định tính tương đồng trình tự “upstream” gen bám dính 10 chủng vi khuẩn so với chủng ngân hàng GenBank Số TT Chủng vi khuẩn phân lập Số nucleotide Vi khuẩn tương đồng ngân hàng liệu Số truy cập Tỉ lệ tương đồng 10 17ED4(CT) 21ED4(AG) 20ED4(AG) 51ED4((TV) 3ED4(TV) 2ED4(TV) 42ED4(VL) 13ED4(TG) 12ED4(DT) 11ED4(DT) 444 446 445 473 449 458 502 518 472 446 Edwardsiella ictaluri strain JF0278 Edwardsiella ictaluri strain PH0744 Edwardsiella ictaluri strain FPC1093 Edwardsiella ictaluri strain JCM1680 Edwardsiella ictaluri strain JF0278 Edwardsiella ictaluri strain PH0744 Edwardsiella ictaluri strain FPC1093 Edwardsiella ictaluri strain JCM1680 Edwardsiella ictaluri strain JF0278 Edwardsiella ictaluri strain JF0207 AB469966.1 AB469964.1 AB469962.1 AB469968.1 AB469966.1 AB469964.1 AB469962.1 AB469968.1 AB469966.1 AB469965.1 99% 99% 99% 99% 98% 96% 99% 96% 96% 99% 3.4 Kết phân tích đa dạng di truyền Cây phả hệ xây dựng phần mềm Mega thể mối quan hệ 10 chủng vi khuẩn phân lập đại diện cho tỉnh giải trình tự chủng ngân hàng liệu NCBI (Hình 3). Cây phả hệ chia thành nhánh (cluster) lớn: nhánh lớn A gồm chủng12ED4(DT) nhánh lớn B có chủng phân bố tỉnh. Nhánh B lớn chia thành nhánh nhỏ B1 gồm 2ED4(TV) B2 gồm chủng lại, nhánh B2 chia thành nhánh nhỏ B21 gồm chủng 13ED4(TG) nhánh B22 gồm chủng phân bố tỉnh. Nhánh B22 chia thành nhánh nhỏ B221 gồm chủng 3ED4(TV) B222 gồm chủng lại phân bố tỉnh. Trong nhánh B222, chủng 51ED4(TV) 42ED4(VL) tạo thành nhóm riêng với chủng lại gồm 11ED4(DT), 17ED4(CT), 20ED4(AG), 21ED4(AG) chủng có mối quan hệ gần với chủng ngân hàng liệu NCBI. Các chủng phân lập có mức tương đồng thấp (96%) với chủng ngân hàng liệu NCBI 13ED4(TG), 2ED4(TV), 12ED(DT) có mối quan hệ xa với chủng ngân hàng liệu NCBI so với chủng lại có mức tương đồng (98-99%) thể phả hệ. Chủng 12ED4(DT) phân lập từ tỉnh nước quanh năm lại có quan hệ gần với chủng phân lập từ tỉnh có tháng nước lợ Trà Vinh, Tiền Giang có quan hệ xa với chủng phân lập từ Vĩnh Long, Cần Thơ, An Giang Đồng Tháp (11ED4(DT)). Bi B222 B22 B2 B B221 B21 B1 A Hình 5. Mối quan hệ tiến hóa (cây phả hệ) chủngvi khuẩn E. ictaluri phân lập tỉnh ĐBSCL chủng so sánh ngân hàng gen (Bi). (Phương pháp Neighbor- joining, số lần giản đồ thiết lập: 1000 lần) Bảng 3. Mức tương đồng chủng vi khuẩn phân lập (%) Kí hiệu CT17ED4 STT AG21ED4 97,9 AG20ED4 TV51ED4 TV3ED4 98,4 98,4 98,4 98,4 98,9 98,9 97,9 98,4 99,5 TV2ED4 VL42ED4 98,9 97,9 96,8 96,8 97,3 97,3 97,3 97,3 97,9 96,8 97,9 TG13ED4 DT12ED4 DT11ED4 10 98,4 98,4 97,3 96,8 96,8 97,9 97,3 97,3 97,9 98,4 98,4 98,9 98,4 98,4 98,4 98,4 98,4 96,8 97,9 97,9 96,2 99,5 97,3 97,3 10 IV.THẢO LUẬN Kết phân lập vi khuẩn cho thấy đặc điểm chủng vi khuẩn phân lập giống với mô tả Plum, 1999; CrumLish et al., 2002; Từ Thanh Dung ctv, 2004, vi khuẩn E. ictaluri Gram âm, hình que, có khả di động yếu, Catalase dương tính Oxidase âm tính, có khả lên men glucose, không sinh H2S indole âm tính. Theo kết phân lập cá tra bệnh phân lập ĐBSCL Crumlish et al., (2002) cho thấy tiêu âm tính ngoại trừ khả thủy phân lysine khả lên men glucose dương tính. Như kết đề tài phù hợp với kết nghiên cứu Crumlish et al., (2002) Plumb, 1999; Crumlish et al., 2002; Từ Thanh Dung ctv, 2004. Ứng dụng kỹ thuật PCR để phát vi khuẩn E. ictaluri nhiều nghiên cứu tiến hành nhiều gen khác vùng gen 16S rRNA (Đặng Thị Hoàng Oanh Đặng Thụy Mai Thy, 2009), gen eip18 với kích thước 480 bp (Trần Thị Thanh Huyền ctv, 2011). Do đó, việc phát vi khuẩn kỹ thuật PCR nhanh chóng đặc hiệu, ứng dụng kỹ thuật cho phép người nuôi chuẩn đoán phát kịp thời cá tra bị nhiễm bệnh. Trong nghiên cứu này, đề tài định danh 14 chủng vi khuẩn phân kỹ thuật PCR khuếch đại vùng “upstream” gen bám dính cặp mồi đặc hiệu Edi_F Edi_R theo phương pháp Sakai et al (2009), kết đề tài phù hợp với kết nghiên cứu Sakai et al (2009) với sản phẩm PCR có kích thước 470 bp. Theo nhiều nghiên cứu phân tích đa dạng di truyền việc dựa vào gen 16S rRNA xem công cụ thích hợp cho việc xác định lịch sử tiến hóa mối quan hệ phát sinh loài (Weisburg et al., 1991). Kết nghiên cứu Trần Ngọc Được ctv (2013) dựa việc khuếch đại vùng gen 16S rRNA có kích thước 1200 bp cho thấy có khác biệt di truyền 65 dòng vi khuẩn acid lactic từ vùng sinh thái nước ngọt, mặn, lợ ĐBSCL. Điều khẳng định, vùng sinh thái khác có ảnh hưởng tới quan hệ dòng vi khuẩn acid lactic. Ngoài ra, dựa việc vùng gen 16S rDNA, kết nghiên cứu Nguyễn Thị Pha Nguyễn Hữu Hiệp (2012) cho thấy khác biệt di truyền dòng vi khuẩn có khả cố định đạm huyện có vùng đất phù sa huyện có vùng đất nhiễm phèn tỉnh Đồng Tháp. Trong nghiên cứu này, vi khuẩn E. ictaluri khảo sát đa dạng di truyền dựa vùng “upstream” gen bám dính. Nghiên cứu Sakai et al. (2009) dựa trình tự vùng gen “upstream” gen bám dính để đánh giá đa dạng dạng di truyền chủng vi khuẩn E. ictaluri gây bệnh có thời gian phân lập khác khác nhau, kết cho thấy khác biệt chủng vi khuẩn E. ictaluri. Nghiên cứu đa dạng di truyền gần Bartie et al., (2012) dựa kỹ thuật phân tích macrorestriction 59 chủng vi khuẩn E. ictaluri phân lập từ Mỹ, Việt Nam Indonesia cho thấy có khác biệt di truyền chủng vi khuẩn với chủng vi khuẩn phân lập từ Mỹ xếp vào cụm phả hệ, chủng vi khuẩn phân lập từ Việt Nam Indonesia chia thành cụm lớn cụm nhỏ, chủng phân lập từ Indonesia xếp vào nhóm với Việt Nam. Các dòng phân lập từ Việt Nam Indonesia có mức tương đồng cao 64%, dòng phân lập từ Mỹ có mức tương đồng thấp so với nhóm này. Điều chứng tỏ có khác biệt di truyền theo vị trí khoảng cách địa lý. Kết nghiên cứu này, mười chủng phân lập chọn giải trình tự nghiên cứu có khác biệt di truyền không cao tỉnh nuôi ĐBSCL có vị trí địa lý đặc điểm tự nhiên giống nhau. Hơn nữa, nguồn giống mà hộ nuôi chọn mua từ sở tỉnh nên cá giống mang mầm bệnh phân bố từ tỉnh sang tỉnh khác. Vùng sinh thái tỉnh Tiền Giang Trà Vinh có vị trí tiếp biển có tháng nước lợ nên chủng phân lập có mối quan hệ gần gũi có khác biệt với chủng phân lập từ vùng nước quanh năm Vĩnh Long, Cần Thơ, An Giang, Đồng Tháp, chứng tỏ vùng sinh thái ảnh hưởng di truyền loài vi khuẩn này. Chủng 12ED4 phân lập từ Đồng Tháp có mối quan hệ gần gũi với chủng phân lập từ Trà Vinh, Tiền Giang khác biệt nhiều với dòng phân phân lập từ tỉnh An Giang, Cần Thơ, Vĩnh Long, Đồng Tháp, biến đổi di truyền góp phần vào đa dạng di truyền vi khuẩn E. ictaluri ĐBSCL. V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 4.1 Kết luận Để tài phân lập định danh 14 chủng vi khuẩn E. ictaluri. Các chủng có mức tương đồng cao có mức độ tương đồng cao với chủng ngân hàng gen (96-99%). Kết khảo sát đa dạng di truyền cho thấy khác biệt nhiều chủng vi khuẩn E. ictaluri phân lập cá tra bệnh gan thận mủ số tỉnh ĐBSCL. 4.2 Đề xuất Cần nghiên cứu đa dạng di truyền vi khuẩn E. ictaluri dựa vùng 16S rRNA khảo sát đa dạng vi khuẩn diện vùng nuôi cá tra khác nhiều loại cá khác để tìm hiểu thêm đa dạng phong phú vi khuần này. Cần nghiên cứu ứng dụng giải pháp phòng trị bệnh vi khuẩn khác vắcxin để giảm rủi ro bệnh vi khuẩn gây ra. 10 LỜI CẢM TẠ Xin gởi lời cảm ơn chân thành đến Quách Văn Cao Thi, chị Huỳnh Thị Diễm Trang, anh Nguyễn Bảo Trung bạn tập thể lớp Nuôi trồng Thủy Sản K37 tận tình giúp đỡ thời gian thực đề tài. TÀI LIỆU THAM KHẢO Barrow, G.I., and R.K.A. Feltham., 1993. Cowan and Steel’s manual for Identification of Medical bacteria. Cambridge University Press. Bartie, K. L., Austin, F. W., Diab. A., Dickson, C., Dung, T. T., Giacomini. M., and Crumlish, M., 2012. Intraspecific diversity of Edwardsiella ictaluri isolates from diseased freshwater catfish, Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage), cultured in the Mekong Delta, Vietnam. Journal of Fish Diseases (2012), 35. 671-682. Buller, B.N., 2004. Bacteria from Fish and Other Aquatic Animal-A Practical Identification Manual. CABI Publishing. 353 pp. Crumlish, M., Dung, T. T., Turnbull., J. F, Ngoc, N. T. N., and Ferguson (2002). Identification of Edwardsiella ictaluri from diseased freshwater catfish, Pangasius hypophthalmus (Sauvage), cultured in the Mekong Delta, Vietnam. Journal of Fish Diseasees 2002, 25, 733-736. Đặng Thị Hoàng Oanh Đặng Thụy Mai Thy (2009). Nghiên cứu công trình PCR chuẩn đoán vi khuẩn Edwarsiella ictaluri thận cá tra (Pangasianodon hypophthalmus). Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc năm 2009: 289292. Dung, T.T., 2010. Edwardsiella ictaluri in Pangasianodon catfish: antimicrobial resistance and the early interactions with its host. Department of Pathology, Bacteriology and Avian Diseases Faculty of Veterinary Medicine, Ghent University, Belgium. 136. Frerichs, G. N., and S. D. Millar., 1993. Manual for the isolation and identification of fish bacterial pathogent. Istitute of Aquaculture, University of Stirling, Scotland. 60pp. Hawke J.P., 1979. A bacterium associated with disease of pond cultured channel catfish. Journal of the Fisheries Research Board of Canada. 36:150–1512. Kasornchndra, J., W.A. Rogers and J.A. Plumb., 1987. Edwardsiella ictaluri from walking catfish, Clarias batrachus L., in Thailand. Journal of Fish disease: 10: 137-138. Keskin., Secer., O. S., Izgur, M., Turkyilmaz. S., and R. S. Mkakosya., 2004. Edwardsiella ictaluri infection in Rainbow Trout (Oncorhynchus mykiss). Turk J Vet Anim Sci, 28: 649-653. Moore .E., Arnscheidt .A., Kruger .A., Strompl C., Mau. M., (2004). Simplified protocols for the preparation of genomic DNA from bacterial cultures. Molecular Microbial Ecology Manual, Second Edition 101: 3-18. Nguyễn Thị Pha Nguyễn Hữu Hiệp, 2012. Khảo sát vùng gen 16S rDNA số dòng vi khuẩn có khả cố định đạm đất vùng rễ lúa tỉnh Đồng Tháp. Tạp chí khoa học 2012 :23a, 184- 192 11 Nguyễn Thiện Nam, Phạm Thanh Hương, Trần Duy Phương, Từ Thanh Dung, 2010. Nghiên cứu đa kháng thuốc vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh cá tra (Pangasianodon hypophthalmus). Tạp chí Khoa học, Đại học Cần Thơ. 2010: 14b, 200-210. Phạm Thanh Hương, 2010. Nghiên cứu kháng thuốc kháng sinh vi khuẩn Edwardsiella ictaluri Aeromonas hydophila gây bệnh cá tra (Pangasianodon hypopthalmus) Đồng Bằng Sông Cửu Long. Luận văn tốt nghiệp Cao học, khoa Thủy sản, trường Đại học Cần Thơ. Plumb, J. A., (1999). Health maintenance and principal microbial diseases of cultured fishes. Iowa state Press, U.S. A Sakai, T., Yuasa, K., Sano, M., & Iida. T, (2009): Identification of Edwardsiella ictaluri and E. tarda by Species pecific Polymerase Chain Reaction Targetedtothe Upstream Region of the Fimbrial Gene, Journal of Aquatic Animal Health, 21:2(b), 124-132. Sakai, T., Yuasa, K., Ozaki, A., Sano, M., Okuda, R., Nakai, T., and Iida, T., (2009). Genotyping of Edwardsiella ictaluri isolates in Japan using amplified-fragment length polymorphism analysis. Agency, 422-1(a) Nakatsuhamaura, Minami-ise, Mie 516-0193, Japan. Trần Ngọc Được ctv, 2013. Khảo sát tính đa dạng sinh học vi khuẩn acid lactic phân lập tử cơm mẻ ba vùng sinh thái Đông Sông Cửu Long. Tạp chí khoa học, Đại học Cần Thơ. Phần B: Nông nghiệp, Thủy sản Công nghệ sinh học 25(2013), 58-66. Trần Thị Thanh Huyền, Nguyễn Thị Trung, Trương Nam Hải, 2011. Phát vi khuẩn Edwarsiella Ictaluri gây bệnh cá tra Việt Nam Kỹ thuật PCR. Tạp chí Công nghệ sinh học 9(1), 61-65. Từ Thanh Dung, Crumlish, M., Nguyễn Thị Như Ngọc, Nguyễn Quốc Thịnh Đặng Thụy Mai Thy, 2004. Xác định vi khuẩn trắng gan cá tra (Pangasianodon hypophthalmus). Tạp chí khoa học Đại học Cần Thơ. 2004,137–142. Weisburg, W. G., Barns. S. M., Pelletier D. A., and Lane D. J., Bacteriol J., 1991. 16S Ribosomal DNA Amplification for Phylogenetic study. 73: 697. Yuasa, K., Kholidin E.B., Panigoro N., and Haiti. K., 2003. First isolation of Edwardsiella ictaluri from cultured striped catfish Pangasius hypophthalmus in Indonesia. Fish Pathology, 38, 181-183. 12 [...]... ictaluri phân lập trên cá tra bệnh gan thận mủ ở một số tỉnh của ĐBSCL 4.2 Đề xuất Cần nghiên cứu sự đa dạng di truyền của vi khuẩn E ictaluri dựa trên vùng 16S rRNA khảo sát sự đa dạng vi khuẩn này hiện di n trên vùng nuôi cá tra khác nhau hoặc trên nhiều loại cá khác để tìm hiểu thêm sự đa dạng và phong phú của vi khuần này Cần nghiên cứu ứng dụng các giải pháp phòng và trị bệnh vi khuẩn khác như vắcxin... biến đổi di truyền và góp phần vào sự đa dạng di truyền của vi khuẩn E ictaluri ở ĐBSCL V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 4.1 Kết luận Để tài đã phân lập và định danh được 14 chủng vi khuẩn E ictaluri Các chủng có mức tương đồng khá cao và có mức độ tương đồng cao với các chủng trên ngân hàng gen (96-99%) Kết quả khảo sát sự đa dạng di truyền cho thấy không có sự khác biệt nhiều về giữa các chủng vi khuẩn E ictaluri. .. các huyện có vùng đất phù sa và các huyện có vùng đất nhiễm phèn của tỉnh Đồng Tháp 9 Trong nghiên cứu này, vi khuẩn E ictaluri được khảo sát sự đa dạng di truyền dựa trên vùng “upstream” của gen bám dính Nghiên cứu của Sakai et al (2009) cũng dựa trên trình tự vùng gen “upstream” của gen bám dính để đánh giá sự đa dạng dạng di truyền của các chủng vi khuẩn E ictaluri gây bệnh có thời gian phân lập khác... không có sự khác biệt giữa các chủng vi khuẩn E ictaluri Nghiên cứu đa dạng di truyền gần đây của Bartie et al., (2012) dựa trên kỹ thuật phân tích macrorestriction của 59 chủng vi khuẩn E ictaluri phân lập từ Mỹ, Vi t Nam và Indonesia cho thấy có sự khác biệt di truyền giữa các chủng vi khuẩn này với các chủng vi khuẩn phân lập từ Mỹ xếp vào một cụm trên cây phả hệ, trong khi các chủng vi khuẩn phân... khác biệt di truyền của 65 dòng vi khuẩn acid lactic từ các vùng sinh thái nước ngọt, mặn, lợ ở ĐBSCL Điều này khẳng định, các vùng sinh thái khác nhau có ảnh hưởng tới quan hệ các dòng vi khuẩn acid lactic Ngoài ra, dựa trên vi c vùng gen 16S rDNA, kết quả nghiên cứu Nguyễn Thị Pha và Nguyễn Hữu Hiệp (2012) cho thấy sự khác biệt di truyền của các dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm tại các huyện... Second Edition 101: 3-18 Nguyễn Thị Pha và Nguyễn Hữu Hiệp, 2012 Khảo sát vùng gen 16S rDNA của một số dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm ở đất vùng rễ cây lúa ở tỉnh Đồng Tháp Tạp chí khoa học 2012 :23a, 184- 192 11 Nguyễn Thiện Nam, Phạm Thanh Hương, Trần Duy Phương, Từ Thanh Dung, 2010 Nghiên cứu sự đa kháng thuốc của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus). .. Trần Ngọc Được và ctv, 2013 Khảo sát tính đa dạng sinh học vi khuẩn acid lactic phân lập tử cơm mẻ ở ba vùng sinh thái của Đông bằng Sông Cửu Long Tạp chí khoa học, Đại học Cần Thơ Phần B: Nông nghiệp, Thủy sản và Công nghệ sinh học 25(2013), 58-66 Trần Thị Thanh Huyền, Nguyễn Thị Trung, Trương Nam Hải, 2011 Phát hiện vi khuẩn Edwarsiella Ictaluri gây bệnh trên cá tra Vi t Nam bằng Kỹ thuật PCR Tạp chí... Thơ 2010: 14b, 200-210 Phạm Thanh Hương, 2010 Nghiên cứu sự kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và Aeromonas hydophila gây bệnh trên cá tra (Pangasianodon hypopthalmus) ở Đồng Bằng Sông Cửu Long Luận văn tốt nghiệp Cao học, khoa Thủy sản, trường Đại học Cần Thơ Plumb, J A., (1999) Health maintenance and principal microbial diseases of cultured fishes Iowa state Press, U.S A Sakai,... biệt với các chủng được phân lập từ các vùng nước ngọt quanh năm như Vĩnh Long, Cần Thơ, An Giang, Đồng Tháp, chứng tỏ vùng sinh thái ảnh hưởng di truyền của loài vi khuẩn này Chủng 12ED4 được phân lập từ Đồng Tháp có mối quan hệ gần gũi với các chủng phân lập từ Trà Vinh, Tiền Giang và khác biệt nhiều nhất với các dòng phân phân lập từ các tỉnh An Giang, Cần Thơ, Vĩnh Long, Đồng Tháp, có thể do sự biến... 2011) Do đó, vi c phát hiện vi khuẩn này bằng kỹ thuật PCR rất nhanh chóng và đặc hiệu, ứng dụng kỹ thuật này cho phép người nuôi chuẩn đoán và phát hiện kịp thời cá tra bị nhiễm bệnh Trong nghiên cứu này, đề tài đã định danh 14 chủng vi khuẩn phân bằng kỹ thuật PCR khuếch đại vùng “upstream” của gen bám dính bằng cặp mồi đặc hiệu Edi_F và Edi_R theo phương pháp của Sakai et al (2009), kết quả của đề tài . của nghiên cứu này là nhằm khảo sát sự đa dạng di truyền của các chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên các tra nuôi ở Đồng bằng sông Cửu Long. Tổng số 14 chủng vi khuẩn. DƯƠNG THANH QUY KHẢO SÁT SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri GÂY BỆNH TRÊN CÁ TRA (Pangasianondon hypophthalmus) Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG LUẬN VĂN. DƯƠNG THANH QUY KHẢO SÁT SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri GÂY BỆNH TRÊN CÁ TRA (Pangasianondon hypophthalmus) Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG LUẬN VĂN