TÓM TẮT Mục đích của nghiên cứu này là nhằm khảo sát sự đa dạng di truyền của các chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên các tra nuôi ở Đồng bằng sông Cửu Long.
Trang 1TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN
DƯƠNG THANH QUY
KHẢO SÁT SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA
VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri GÂY BỆNH TRÊN
CÁ TRA (Pangasianondon hypophthalmus)
Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN
2014
Trang 2TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN
DƯƠNG THANH QUY
KHẢO SÁT SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA
VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri GÂY BỆNH TRÊN
CÁ TRA (Pangasianondon hypophthalmus)
Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN
Cán bộ hướng dẫn PGs Ts Từ Thanh Dung
2014
Trang 3KHẢO SÁT SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA VI KHUẨN Edwardsiella
ictaluri GÂY BỆNH TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypopthalmus) Ở ĐỒNG
BẰNG SÔNG CỬU LONG
Dương Thanh Quy 1 và Từ Thanh Dung 2 (1) Lớp nuôi trồng thủy sản k37, khoa thủy sản, trường Đại học Cần Thơ (2) Bộ môn Bệnh học thủy sản, khoa Thủy sản, trường Đại học Cần Thơ
Email: quy112899@student.ctu.edu.vn
ABTRAST
This study was carried out to assess phylogenetic diversity of Edwarsiella ictaluri
isolates collected from striped catfish intensively farmed in the Mekong Delta, Vietnam A total of 14 bacterial isolates were isolated and identified from diseased catfish by using PCR technique based on the upstream region of fimbrial gene
cluster The results determined that they were E ictaluri positive with specific DNA
band for the upstream region of fimbrial gene appeared at 470 bp Ten isolates were chosen to sequence, the nucleotide blast result showed that these strains had high
homology/identity (96-100%) compared with reference strains of Edwardsiella
ictaluri on Genbank (NCBI) These strains were used for analyzing phylogenetic
diversity The result indicated that Tien Giang and Tra Vinh strains had close relationship and had hight similarity other in Can Tho, An Giang, Vinh Long, and Dong Thap provinces However, the study found that there are no genetic
differences between Edwardsiella ictaluri strains in two differently ecological areas
of brackish and fresh water in the Mekong Delta
Title: Analysis of phylogenetic diversity of Edwarsiella ictaluri from striped catfish
(Pangasianodon hypopthalmus) farmed in the Mekong Delta
Keywords: catfish, Edwarsiella ictaluri, Pangasianodon hypophthalmus,
phylogenetic diversity, Mekong Delta
TÓM TẮT
Mục đích của nghiên cứu này là nhằm khảo sát sự đa dạng di truyền của các chủng
vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên các tra nuôi ở Đồng bằng
sông Cửu Long Tổng số 14 chủng vi khuẩn được phân lập và định danh bằng Kỹ thuật PCR dựa trên vùng “upstream” của gen bám dính Kết quả cho thấy các chủng
vi khuẩn phân lập đều cho phản ứng dương tính khi các DNA đều xuất hiện vạch
470 bp Mười chủng vi khuẩn phân lập đại diện cho 6 tỉnh An Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ, Vĩnh Long, Tiền Giang, Trà Vinh được chọn giải trình tự vùng “upstream” của gen bám dính, kết quả cho mức tương đồng cao (96-99%) với các chủng trên ngân hàng GenBank (NCBI) Phân tích sự đa dạng di truyền của 10 chủng vi khuẩn được giải trình tự, kết quả cho thấy các chủng phân lập có đặc điểm di truyền giống nhau, các chủng từ Tiền Giang, Trà Vinh tuy có vị trí giáp biển nhưng kết quả cho thấy không có sự khác biệt di truyền nhiều với các chủng ở Cần Thơ, An Giang, Vĩnh Long, Đồng Tháp Kết quả của đề tài còn là tiền đề nghiên cứu ứng dụng vắc-xin phòng ngừa bệnh do loài vi khuẩn gây bệnh này gây ra
I GIỚITHIỆU
Ngành công nghiệp cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) đã và đang phát triển
trong nhiều năm qua và trở thành mặt hàng xuất khẩu mũi nhọn của Việt Nam nói chung và Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) nói riêng Tuy nhiên, trong những năm qua, mật độ thâm canh hóa không ngừng tăng dẫn đến tình trạng ô nhiễm môi
Trang 4trường, tạo điều kiện cho dịch bệnh phát triển và gây thiệt hại nghiêm trọng cho người nuôi Trong đó bệnh gây thiệt hại lớn nhất cho nghề nuôi cá tra ở ĐBSCL là
bệnh gan thận mủ do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri (E ictaluri) gây ra (Crumlish et
al., 2002) Ngoài ra, vi khuẩn gây bệnh này còn được xác nhận ở Mỹ (Hawke et al.,
1986), Thái Lan (Kasornchndra et al., 1987), Indonesia (Yuasa et al., 2003) và Thổ Nhĩ Kì (Keskin et al., 2004)
Vi khuẩn E ictaluri có thể coi là tác nhân đặc thù gây bệnh chủ yếu trên cá da trơn nuôi công nghiệp ở nhiều nước trên thế giới Vi khuẩn E ictaluri là vi khuẩn Gram
âm, hình que, không sinh bào tử, yếm khí tùy tiện, phản ứng Oxidase âm tính,
Catalase dương tính (Plum, 1999; CrumLish et al., 2002; Từ Thanh Dung và ctv,
2004) Bệnh do vi khuẩn này gây ra đã và đang gây thiệt hại lớn cho người nuôi cá tra ở ĐBSCL Bên cạnh đó, thuốc kháng sinh là biện pháp chữa bệnh phổ biến, gây
ra hiện tượng kháng thuốc vi khuẩn này và vi khuẩn môi trường xung quanh (Từ Thanh Dung, 2010), tình trạng sử dụng kháng sinh tràn lan, không kiểm soát ngày càng làm cho tình hình dịch bệnh diễn biến phức tạp và gây khó khăn cho ngành
xuất khẩu cá tra Năm 20l0, theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thiện Nam và ctv, hầu hết vi khuẩn E ictaluri kháng với streptomycin, chloramphenocol (95%),
florfenicol, enrofloxacin (77,5%), doxycycline (67,5%) và 97,5% chủng vi khuẩn biểu hiện sự đa kháng thuốc (kháng từ 3 loại kháng sinh) Hơn nữa, theo kết quả
kháng sinh đồ của Phạm Thanh Hương (2010), cho thấy vi khuẩn E ictaluri cũng
kháng với các loại kháng sinh streptomycin (84,1%), enrofloxacin (74,5%); kháng hoàn toàn với flumequin, trimethoprim + sunfamethoxazol; nghiên cứu cũng phát
hiện có 96% chủng vi khuẩn E.ictalluri biểu hiện sự đa kháng
Trước tình hình đó, để giảm thiệt hại của bệnh do vi khuẩn này gây ra thì việc sử dụng vắc-xin để phòng ngừa bệnh là điều cần thiết Để thực hiện được điều đó, trước hết cần phải khảo sát sự đa dạng di truyền của các chủng vi khuẩn gây bệnh nguy hiểm này Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về sự đa dạng di truyền của vi khuẩn
E ictaluri Nghiên cứu của Sakai et al (2009), áp dụng biện pháp khuếch đại chiều
dài đoạn gen đa hình của các chủng vi khuẩn E ictaluri (Amplified- Fragment
Length Polymorphism, AFLP), kết quả cho thấy, có sự khác biệt di truyền chủng vi khuẩn phân lập từ Mỹ so với các chủng phân lập từ Nhật Bản và Indonesia, các vi
khuẩn E ictaluri phân lập cùng một thủy vực tại Indonesia cũng có sự khác biệt về
di truyền do khác nhau về thời gian phân lập, các chủng phân lập ở Mỹ cũng có sự khác biệt di truyền do khác biệt về sinh thái thủy vực Ở ĐBSCL có các tỉnh nuôi thâm canh cá tra nằm trong vùng sinh thái nước ngọt, lợ Vấn đề đặt ra là vùng sinh thái nước ngọt và lợ nuôi cá tra ở ĐBSCL có ảnh hưởng tới tính đa dạng di truyền
của vi khuẩn E ictaluri hay không? Và vi khuẩn gây bệnh trên cá tra ở các tỉnh khác
nhau có khác nhau hay không? Xuất phát từ thực tế trên, đề tài “Khảo sát sự đa
dạng di truyền của vi khuẩn Edwarsiella ictaluri gây bệnh trên cá tra nuôi
(Pangasianodon hypophthalmus) ở Đồng bằng sông Cửu Long” được thực hiện
với mục tiêu: phân lập, định danh và khảo sát sự đa dạng di truyền một số chủng vi
khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá tra nuôi thâm canh ở một
số tỉnh ĐBSCL
Trang 5II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Phân lập và định danh vi khuẩn E ictaluri theo phương pháp truyền thống
Đề tài đã thu 25 mẫu cá tra bệnh được thu ở một số ao có dấu hiệu bệnh gan thận mủ
ở một số tỉnh ở ĐBSCL như Vĩnh Long, Đồng Tháp, An Giang, Tiền Giang, Trà
Vinh, Cần Thơ trong năm 2014 và vi khuẩn E ictaluri được phân lập từ các ao khác
nhau dựa theo tài liệu của Frerich and Millar (1993) Tách ròng trên trên môi trường Trypton soy agar (TSA) và ủ ở 28oC trong 48h Sau đó tiến hành trữ vi khuẩn trong môi trường Brain heart in broth (BHIB) có bổ sung 20% glycerol bảo quản ở -80oC cho đến khi sử dụng Các đặc điểm hình thái và sinh hóa cơ bản của vi khuẩn được kiểm tra như màu sắc khuẩn lạc, tính di động, nhuộm Gram, phản ứng Oxidase/Catalase và phản ứng O/F theo cẩm nang của Cowan và Steel (Barrow và Feltham, 1993) và tài liệu hướng dẫn của Buller (2004)
2.2 Tiến hành phản ứng Polymerase chain reaction (PCR) xác định E ictaluri
Ly trích DNA
Các chủng vi khuẩn sau khi được nuôi tăng sinh trong môi trường BHIB được ly
trích DNA dựa theo tài liệu của Moore et al (2004) Các bước thực hiện gồm: hút 2
ml dung dịch nuôi cấy cho vào tube 2,2 ml, ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ phần dung dịch phía trên Cho vào tube 300 µl Lysis buffer (Tris [pH 8.0] 1
M, EDTA [pH 8.0], NaCl 5 M, SDS 10%, H2O), cho viên bi sắt vào tube và lắc đều bằng máy lắc, hút thêm 700 µl Lysis bufer cho vào tube, ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút, lấy 700 µl dung dịch phía trên chuyển sang tube mới Cho 700 µl Ethanol 95% vào dung dịch, ly tâm 13000 vòng/phút, bỏ phần dung dịch phía trên (chỉ lấy kết tủa) Rửa kết tủa bằng 500 µl Ethanol 70%, ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút Bỏ phần dung dịch phía trên, sấy khô trong chân không trong 10 phút Hòa tan kết tủa trong 100 µl TE 0,1X (Tris pH8 1 M, EDTA 0,5 M, H20) Trữ mẫu ở -20oC trong quá trình sử dụng
Tiến hành phản ứng PCR
Sau khi ly trích, tiến hành thực hiện phản ứng PCR khuếch đại đoạn DNA nằm trong vùng “upstream” của gen bám dính có kích thước 470 bp, phản ứng PCR được thực
hiện dựa theo qui trình của Sakai et al., (2009(b)) với cặp mồi có trình tự: Edi_F: 5’-CAGATGAGCGGATTTCACAG-3’ ;Edi_R5’-GCGCAATTAACATAGAGCC-3’
Thành phần của phản ứng PCR gồm 2,5 µl dung dịch đệm Buffer 1X (Tris HCl 100
mM và KCl 500 mM), 2 µl MgCl2 1,5 mM, 4 µl dNTPs (deoxyribonucleotide triphosphate) 200 µM, 1 µl primer (EdiF) 0,4 µM, 1 µl Primer (EdiR) 0,4 µM, 0,25
µl Taq DNA polymerase 2,5 UI, 2 µl 20 ng DNA, thêm nước cho đến 25 µl Chu
trình nhiệt của phản ứng PCR được thực hiện theo Sakai et al (2009(b)) bao gồm:
Biến tính ban đầu trong 3 phút ở 94oC, sau đó thực hiện khuếch đại 30 chu kì gồm các giai đoạn biến tính ở 94oC trong 30 giây, gắn mồi 65oC trong 30 giây, kéo dài ở
72oC trong 1 phút, và giai đoạn kéo dài ổn đinh sản phẩm được thực hiện trong 5 phút ở 72oC
Điện di sản phẩm PCR và giải trình tự
Sản phẩm PCR sau phản ứng được trộn với 2-3 µl dung dịch Loading Buffer trước
khi chạy điện di bằng gel agarose 1,5% Sau đó, chọn 10 chủng vi khuẩn E ictaluri
đại diện cho 6 tỉnh được gởi sang công ty Macrogen, Hàn Quốc để giải trình tự (website: http://dna.macrogen.com/ (các chủng được đánh dấu (*) ở Bảng 1))
Trang 62.3 Phân tích đa dạng di truyền
Kết quả của các mẫu sau giải trình tự được xếp hàng (alignment) bằng phần mềm ClustalW (DNA Data Bank of Japan; http: Clustalw.ddbj.nig.ac.jp/top-j.html) Cây
phả hệ (Phylogenetic tree) được xây dựng bằng phần mềm Mega 6 (Tamura et
al.,2013) bằng thuật toán Neighbor-joining với giá trị bootstrap 1000 lần lặp lại
III KẾT QUẢ
3.1 Phân lập vi khuẩn
Đề tài đã thu được 25 mẫu cá tra từ 6 ao có dấu hiệu bệnh gan thận mủ với các dấu hiệu bên ngoài như xuất huyết, mắt hơi lồi, xuất hiện nhiều đốm trắng đục có kích
cỡ 1-3 mm trên gan, thận và tỳ tạng và đã phân lập được 14 chủng vi khuẩn Nguồn gốc của các chủng vi khuẩn phân lập được trình bày ở Bảng 1
Bảng 1 Các chủng vi khuẩn E ictaluri phân lập từ cá tra bệnh gan thận mủ ở
ĐBSCL
Stt Địa phương Số mẫu
thu thập
Các chủng phân lập Thời gian
Ghi chú: kí hiệu đầu tiên là số thứ tự chủng phân lập, kí hiệu tiếp theo là tên vi khuẩn và năm phân lập, kí hiệu tiếp theo tên viết tắt của tỉnh; * là các chủng được chọn giải trình tự khảo sát sự đa dạng
di truyền.
3.2 Kiểm tra các chỉ tiêu hình thái, sinh lý, sinh hóa
Vi khuẩn E ictaluri được phân trên môi trường TSA trong 48h và ủở 28oC trong tủ
ấm Kết quả cho thấy khuẩn lạc có màu trắng đục, nhỏ, không nhân và rìa có dạng không đồng nhất (Hình 1A) Kết quả kiểm tra tính di động của vi khuẩn trên kính hiển vi với vật kính 100X cho thấy, vi khuẩn có khả năng di động Kết quả nhuộm Gram cho thấy tất, cả các chủng vi khuẩn đều không bắt màu tím xanh của thuốc nhuộm Crystal Violet mà bắt màu đỏ của Fushin Qua đó cho thấy các chủngvi khuẩn phân lập được đều là Gram âm (Hình 1B)
Trang 7Hình 1.Kết quả phân lập vi khuẩn E ictaluri trên môi trường TSA trong 48h và
nhuộm Gram vi khuẩn
A: Hình thái khuẩn lạc trên môi trường TSA
B: Kết quả nhuộm Gram vi khuẩn E ictaluri được chụp dưới kính hiển vi 100X
Khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn phân lập trên môi trường TSA trong 48h được thử nghiệm để kiểm tra sự hiện diện của enzym catalase và cytochrome oxidase Khi thử nghiệm catalase (H2O2, 3%) tất cả các chủng vi khuẩn đều cho hiện tượng sủi bọt khí, điều này chứng tỏ vi khuẩn có hệ enzyme catalase để phân giải H2O2 thành nước
và oxi hay nói cách khác là các chủng vi khuẩn dương tính với Catalase Khi thử nghiệm Oxidase bằng cách cho vi khuẩn tiếp xúc với giấy lọc có tẩm thuốc thử Tetramethyl- p- phenylendiamin dihydrochlorid, các chủng vi khuẩn cho kết quả âm tính vì không làm đổi màu giấy lọc từ trắng sang tím Khuẩn lạc các chủng vi khuẩn phân lập cũng được kiểm tra khả năng oxi hóa và lên men đường glucose (O-F test)
1 ống được phủ 0,5-1 ml parafin tạo điều kiện yếm khi để kiểm tra khả năng lên men (F), ống còn lại tạo điều kiện hiếu khí để kiểm tra khả năng oxi hóa (O), kết quả cho thấy tất cả các chủng vi khuẩn đều làm đổi màu 2 ống nghiệm chứa môi trường O/F
từ màu xanh sang màu vàng
3.3 Kết quả xác định vi khuẩn E ictaluri dựa vào vùng “upstream” của gen
bám dính bằng PCR
Vi khuẩn phân lập được định danh bằng kỹ thuật PCR khuếch đại vùng “upstream” của gen bám dính với cặp mồi đặc hiệu Edi_F và Edi_R Kết quả sau phản ứng PCR của 14 chủng vi khuẩn phân lập đều xuất hiện band ADN 470 bp (Hình 2) Kết quả này cho thấy 14 chủng vi khuẩn phân lập được định danh bằng kỹ thuật PCR đều là
vi khuẩn E ictaluri gây bệnh gan thận mủ
Trang 8Hình 2 Kết quả chạy điện di sản phẩm PCR dựa trên vùng “upstream”của gen bám
dính của vi khuẩn E ictaluri (Chú giải : 1_17ED4(CT); 2_21ED4(AG);
3_20ED4(AG); 4_51ED4(TV); 5_3ED4(TV); 6_2ED4(TV)
Kết quả giải trình tự của 10 chủng vi khuẩn E ictaluri phân lập nhận được từ công
ty Macrogen, Hàn Quốc Sử dụng chương trình BLASTN để so sánh mức độ đồng hình của trình tự các chủng vi khuẩn phân lập với trình tự của các chủng vi khuẩn trên ngân hàng gen trên trang NCBI BLAST Kết quả thu được cho thấy 100% các
chủng vi khuẩn phân lập đều thuộc loài Edwardsiella ictaluri Trình tự “upstream”
của gen bám dính của các chủng vi khuẩn phân lập có tỉ lệ tương đồng cao với với trình tự vùng “upstream” của gen bám dính của các chủng trên ngân hàng dữ liệu NCBI là 96-99%.(Bảng 2)
Hình 3 Kết quả so sánh tính tương đồng của chủng 13ED4 so với vi khuẩn E
ictaluri trên ngân hàng dữ liệu NCBI
500bp
L
470bp
Trang 9Hình 4 Kết quả so sánh tính tương đồng của chủng 42ED4 so với vi khuẩn E
ictaluri trên ngân hàng dữ liệu NCBI
Kết quả giải trình các chủng vi khuẩn phân lập được so sánh với trình tự các chủng
trên ngân hang gen (Bảng 2), kết quả cho thấy trình tự nucleotide vùng upstream
gen bám dính của 10 chủng phân lập có mức tương đồng khá cao (96-99%) với trình
tự nucleotide vùng upstream gen bám dính các chủng trên ngân hàng dữ liệu (NCBI) Trình tự các chủng phân lập 2ED4(TV), 13ED4(TG), 12ED4(DT) có mức tương đồng thấp nhất 96%, các chủng phân lập còn lại có mức tương đồng 99% với các dòng trên ngân hàng dữ liệu
Bảng 2 Kết quả xác định tính tương đồng trình tự “upstream” của gen bám dính của
10 chủng vi khuẩn so với các chủng trên ngân hàng GenBank
Số
TT
Chủng
vi khuẩn
phân lập
Số nucleotide
Vi khuẩn tương đồng trên ngân
hàng dữ liệu
Số truy cập Tỉ lệ
tương đồng
3.4 Kết quả phân tích đa dạng di truyền
Cây phả hệ được xây dựng bằng phần mềm Mega 6 thể hiện mối quan hệ giữa 10 chủng vi khuẩn phân lập đại diện cho 6 tỉnh giải trình tự và 8 chủng trên ngân hàng
dữ liệu NCBI (Hình 3) Cây phả hệ chia thành 2 nhánh (cluster) lớn: nhánh lớn A gồm 1 chủng12ED4(DT) và nhánh lớn B có 9 chủng phân bố ở 6 tỉnh Nhánh B lớn chia thành nhánh nhỏ B1 gồm 2ED4(TV) và B2 gồm 8 chủng còn lại, nhánh B2 chia thành 2 nhánh nhỏ là B21 gồm 1 chủng 13ED4(TG) và nhánh B22 gồm 7 chủng phân
bố ở 5 tỉnh
Trang 10Nhánh B22 chia thành 2 nhánh nhỏ là B221 gồm 1 chủng là 3ED4(TV) và B222 gồm 6 chủng còn lại phân bố ở 5 tỉnh Trong nhánh B222, chủng 51ED4(TV) và 42ED4(VL) lần lượt tạo thành 2 nhóm riêng với 4 chủng còn lại gồm 11ED4(DT), 17ED4(CT), 20ED4(AG), 21ED4(AG) và 4 chủng này có mối quan hệ gần nhất với các chủng trên ngân hàng dữ liệu NCBI Các chủng phân lập có mức tương đồng thấp (96%) với các chủng trên ngân hàng dữ liệu NCBI 13ED4(TG), 2ED4(TV), 12ED(DT) có mối quan hệ xa với các chủng trên ngân hàng dữ liệu NCBI so với các chủng còn lại có mức tương đồng (98-99%) thể hiện trên cây phả hệ
Chủng 12ED4(DT) tuy được phân lập từ tỉnh nước ngọt quanh năm nhưng lại có quan hệ gần với các chủng phân lập từ các tỉnh có những tháng nước lợ như Trà Vinh, Tiền Giang và có quan hệ xa với các chủng phân lập từ Vĩnh Long, Cần Thơ,
An Giang và Đồng Tháp (11ED4(DT))
Hình 5 Mối quan hệ tiến hóa (cây phả hệ) của các chủngvi khuẩn
E ictaluri được phân lập tại 6 tỉnh ĐBSCL và các chủng được so sánh trên ngân
hàng gen (Bi) (Phương pháp Neighbor- joining, số lần giản đồ thiết lập: 1000 lần)
B 2
B 21
A
B 1
B 222
B
B 221
B 22
B i