thủy phân protein từ phụ phẩm cá tra bằng enzyme papain

Đề tài ứng dụng enzyme papain để thủy phân protein từ phụ phẩm cá Tra trên cơ sở khảo sát hai tham số động học V max , K m của enzyme papain; ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme/cơ chất E/S và th

KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Lớp: CB1108A1

Cần Thơ, 12/2014

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân Các số liệu, kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào trước đây

Cần Thơ, ngày 16 tháng 12 năm 2014

Ký tên

Thái Văn Trọng

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu, mặc dù gặp không ít khó khăn nhưng dưới sự giúp đỡ của thầy cô, anh chị và bạn bè đã giúp em hoàn thành được đề tài nghiên cứu của mình

Trước tiên, em xin chân thành cảm ơn thầy Nguyễn Công Hà, giảng viên Bộ môn Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại Học Cần Thơ đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báo để giúp em hoàn thành tốt đề tài luận văn này

Qua đây, em cũng xin chân thành cảm ơn quí thầy cô Trường Đại Học Cần Thơ, đặc biệt là các thầy cô trong Bộ môn Công nghệ thực phẩm đã truyền đạt những kiến thức và những kinh nghiệm thực tế trong suốt quá trình học tập và rèn luyện tại trường

Xin cảm ơn các anh chị cán bộ phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ thực phẩm và

Bộ môn Khoa học đất, các anh chị cao học và các bạn sinh viên khóa 37 luôn sẵn sàng hỗ trợ và giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Cuối cùng, em xin cảm ơn đến ba mẹ và gia đình, những người luôn bên em và mong những gì tốt đẹp nhất đến với em

Xin chân thành cảm ơn!

Cần Thơ, ngày 16 tháng 12 năm 2014

Sinh viên thực hiện

Thái Văn Trọng

TÓM TẮT

Hiện nay, hướng nghiên cứu sử dụng enzyme protease để thủy phân phụ phẩm từ các nhà máy chế biến thủy sản đang được quan tâm Đề tài ứng dụng enzyme papain để thủy phân protein từ phụ phẩm cá Tra trên cơ sở khảo sát hai tham số động học V max , K m của enzyme papain; ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme/cơ chất (E/S) và thời gian đến hiệu suất của quá trình thủy phân Giá trị pH và nhiệt độ được điều chỉnh tương ứng 7,5 và 55 o C cho hoạt động tối ưu của enzyme papain Kết quả thu được hai tham số động học V max và K m của enzyme papain trên cơ chất protein từ phụ phẩm cá Tra lần lượt là 0,262 μmol tyrosine/phút và 0,101 g protein/10 ml Hoạt động thủy phân cho hiệu quả nhất ở tỷ lệ E/S (mg/g) là 1/2,5 và hiệu suất thủy phân thu được sau 240 phút theo Tyr tp /Tyr t và theo phương pháp OPA tương ứng 29,186% và 7,53%

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

TÓM TẮT iii

MỤC LỤC iv

DANH SÁCH BẢNG vii

DANH SÁCH HÌNH viii

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 2

CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 TỔNG QUAN VỀ CÁ TRA 3

2.1.1 Giới thiệu, phân loại 3

2.1.2 Đặc điểm phân bố 3

2.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA ĐỘNG VẬT THỦY SẢN 4

2.2.1 Cấu trúc cơ thịt cá 4

2.2.2 Thành phần hóa học trong cơ thịt cá 4

2.2.2.1 Nước 4

2.2.2.2 Protein và thành phần trích ly chứa nitơ phi protein 5

2.2.2.3 Lipid 6

2.2.2.4 Glucid 7

2.2.2.5 Các vitamin và khoáng chất 7

2.3 SƠ LƯỢC VỀ NGUỒN PHỤ PHẨM CÁ TRA VÀ CÁC NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN 7

2.3.1 Sơ lược về nguồn phụ phẩm 7

2.3.2 Ứng dụng enzyme protease trong công nghệ thực phẩm 7

2.3.3 Các nghiên cứu về protein thủy phân 8

2.4 KHÁI QUÁT VỀ ENZYME 9

2.4.1 Khái niệm về enzyme 9

2.4.2 Tính đặc hiệu của enzyme 9

2.4.3 Trung tâm hoạt động 10

2.4.4 Động học phản ứng enzyme 11

2.4.5 Những yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động enzyme 14

2.4.5.1 Nồng độ cơ chất 14

2.4.5.2 Nồng độ enzyme 14

2.4.5.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ 14

2.4.5.4 Ảnh hưởng của pH 15

2.5 ENZYME PAPAIN (E.C.3.4.22.2) 15

2.5.1 Giới thiệu về enzyme papain 15

2.5.2 Đặc điểm chung 15

2.5.3 Cấu trúc không gian 16

2.5.4 Cấu trúc trung tâm hoạt động của papain 16

2.5.5 Hoạt tính enzyme và cơ chế tác dụng 16

2.5.6 Tính chất của papain 18

2.5.6.1 Chất hoạt hóa 18

2.5.6.2 Chất kìm hãm 18

2.5.6.3 Nhiệt độ môi trường 18

2.5.6.4 pH môi trường 19

2.5.6.5 Dung môi 19

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

3.1 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 20

3.1.1 Thời gian và địa điểm 20

3.1.2 Nguyên liệu 20

3.1.3 Thiết bị sử dụng 20

3.1.4 Hóa chất 20

3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

3.2.1 Chuẩn bị nguyên liệu 21

3.2.2 Tiến hành thí nghiệm 22

3.2.3 Phương pháp thí nghiệm 22

3.2.3.1 Xác định hàm lượng ẩm trong nguyên liệu 22

3.2.3.2 Xác định hàm lượng đạm tổng số 22

3.2.3.3 Xác định hàm lượng lipid 22

3.2.3.4 Xác định hàm lượng tyrosine sinh ra 22

3.2.3.5 Xác định hiệu suất đạm amin 23

3.2.4 Xử lý số liệu 23

3.3 NỘI DUNG BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM 23

3.3.1 Thí nghiệm 1: Xác định các tham số động học của enzyme papain trên cơ chất protein từ phụ phẩm cá Tra 23

3.3.2 Thí nghiệm 2: xác định tỷ lệ enzyme/cơ chất (E/S) cho hiệu quả thủy phân tối ưu 24

3.3.3 Thí nghiệm 3: Xác định thời gian thủy phân tối ưu cho tỷ lệ E/S thích hợp nhất 24

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26

4.1 XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC TRONG NGUYÊN LIỆU 26

4.2 ẢNH HƯỞNG CỦA ENZYME PAPAIN ĐẾN QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN PROTEIN TỪ PHỤ PHẨM CÁ TRA 26

4.2.1 Xác định các tham số động học Vmax, Km của enzyme papain trên cơ chất là protein từ phụ phẩm cá Tra 26

4.2.2 Khảo sát tỷ lệ enzyme/cơ chất (E/S) thích hợp cho quá trình thủy phân 29 4.2.3 Khảo sát thời gian thủy phân tối ưu 30

4.2.4 Kết quả chạy điện di 33

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 35

5.1 KẾT LUẬN 35

5.2 ĐỀ NGHỊ 35

TÀI LIỆU THAM KHẢO 36

PHẦN PHỤ LỤC ix

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 2.1 Thành phần dinh dưỡng của cá Tra trên 100 g thành phẩm ăn được 4Bảng 4.1 Thành phần hóa học của nguyên liệu thí nghiệm tính theo căn bản ướt 26Bảng 4.2 Hiệu suất Tyrtp/Tyrt và hiệu suất thủy phân theo phương pháp OPA khi tiến hành tăng tỉ lệ E/S với các hệ số 1; 1,5; 2; 2,5; 3 trong 30 phút 29

DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1 Cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) 3

Hình 2.2 Mô hình chìa khóa và ổ khóa của Fisher 10

Hình 2.3 Mô hình thuyết trung tâm hoạt động linh hoạt của Koshland 11

Hình 2.4 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đối với tốc độ xúc tác ban đầu 13

Hình 2.5 Sự phụ thuộc của enzyme vào nhiệt độ 14

Hình 2.6 Sự phụ thuộc của enzyme vào pH 15

Hình 2.7 Cấu trúc không gian của enzyme papain 16

Hình 2.8 Sự sắp xếp tương ứng của enzyme và chuỗi gồm 7 gốc amio acid của cơ chất 17

Hình 4.1: Đồ thị thể hiện phương trình động học Michaelis-Menten của enzyme papain trên cơ chất protein từ phụ phẩm cá Tra 27

Hình 4.2: Đồ thị thể hiện hiệu suất thủy phân Tyrtp/Tyrt và theo phương pháp OPA ở cặp tỷ lệ 1 mg/2,5 g theo thời gian khác nhau 31

Hình 4.3 Mật số hình thành pepide sau thủy phân của papain, bromelain và neutrase 33

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngành nuôi trồng và chế biến thủy sản ở nước ta nói chung và ở Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) nói riêng chiếm một vị trí quan trọng trong nền kinh tế quốc dân nhất là trong lĩnh vực nuôi trồng, chế biến và xuất khẩu cá Tra fillet Điều này cho thấy con cá Tra thực sự là một thế mạnh của vùng ĐBSCL và cùng với điều kiện tự nhiên rất thuận lợi nên sản lượng các ao nuôi không ngừng gia tăng, song song với đó là tình hình chế biến cá Tra xuất khẩu ở các nhà máy cũng tăng theo Năm 2013, diện tích nuôi đạt 5.910 ha; sản lượng cá thu hoạch đạt 1.255.500 tấn; kim ngạch xuất khẩu đạt 1,74 tỷ USD (Tổng Cục Thủy Sản, 2013) Theo Nguyễn Văn Mười (2013), ngành công nghiệp chế biến cá Tra fillet xuất khẩu gia tăng, các phụ phẩm được thải ra từ quá trình xử lý fillet như thịt vụn, xương, đầu cá, nội tạng, gây nhiều tác hại lớn cho môi trường hoặc được tận dụng một phần trong chế biến thức ăn gia súc và được bán với giá rất rẻ nên hiệu quả kinh tế không cao Bên cạnh đó, mục tiêu chiến lược cho chế biến thủy sản hiện nay và trong những năm tiếp theo là tăng cường nâng cao giá trị nguồn nguyên liệu thủy sản bằng các giải pháp nâng cao công nghệ, sử dụng thiết bị, cải tiến trình độ sản xuất các mặt hàng giá trị gia tăng từ thủy sản (Nguyễn Văn Mười, 2013) Chính vì thế, việc nghiên cứu, chế biến nguồn phụ phẩm từ các nhà máy chế biến cá Tra fillet xuất khẩu là rất cần thiết để thực hiện mục tiêu chiến lược trên

Hiện nay có rất ít nghiên cứu về bột protein thủy phân, đây là loại bột có giá trị dinh dưỡng cao có thể bổ sung vào trong thực phẩm Hàm lượng protein cao từ nguồn phụ phẩm cá Tra sau khi filet có thể được sử dụng để sản xuất loại bột này; không chỉ tận dụng được nguồn nguyên liệu tại chỗ, rẽ tiền mà còn tạo một sản phẩm giá trị gia tăng góp phần nâng cao vị thế con cá Tra ở vùng ĐBSCL Theo Abdulazeez

et al., (2013) thì để thủy phân protein có thể sử dụng phương pháp hóa học thông

thường là dùng dung môi hoặc hóa chất mạnh, việc sử dụng như vậy làm sản phẩm không phù hợp trong sản xuất thực phẩm, làm giảm giá trị dinh dưỡng, nghèo các tính chất chức năng và không được sử dụng trong thương mại Phương pháp thủy phân bằng enzyme cho hiệu quả cao và phù hợp để sản xuất các sản phẩm thủy

phân protein với các tính chất mong muốn Theo Ovissipour et al., (2010), sử dụng

enzyme để thủy phân protein là một phương pháp có thể cải thiện đặc tính hóa lý, tính chất chức năng, cảm quan và giá trị dinh dưỡng Trên thực tế, có rất nhiều loại protease và chế phẩm thương mại khác nhau được sử dụng để thủy phân protein như bromelain, neutrase, alcalase, protamex,… Trong đó papain là một trong số các enzyme được quan tâm

Phương pháp sử dụng enzyme cần phải có sự nghiên cứu chặt chẽ bởi enzyme nhạy cảm với các điều kiện như nhiệt độ, pH, nồng độ enzyme, nồng độ cơ chất, (Nguyễn Công Hà và Lê Nguyễn Đoan Duy, 2011) Do đó, để sản xuất được bột protein thủy phân có chất lượng cao đảm bảo tính kinh tế cũng như giá thành sản phẩm hạ thì việc nghiên cứu các điều kiện tối ưu cho enzyme hoạt động trong quá

trình thủy phân là rất quan trọng Chính vì thế mà đề tài “Thủy phân protein từ phụ

phẩm cá Tra bằng enzyme papain” được thực hiện

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Xác định động học enzyme papain trên cơ chất là protein từ phụ phẩm cá Tra (khung xương và đầu cá) sau khi fillet Trên cơ sở đó xác định tỷ lệ enzyme/cơ chất (E/S) và thời gian để hiệu suất thủy phân tối ưu nhất

CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 TỔNG QUAN VỀ CÁ TRA

2.1.1 Giới thiệu, phân loại

Theo Nguyễn Thanh Phương (2012), cá Tra có tên khoa học là Pangasianodon hypophthalmus và tên tiếng Anh là Striped catfish Cá Tra được phân loại như sau:

Bộ cá nheo: Siluriformes

Họ cá tra: Pangasiidae

Giống cá tra dầu : Pangasianodon

Loài cá tra : Pangasianodon hypophthalmus

Hình 2.1 Cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus)

(nguồn: www.de.wikipedia.org)

2.1.2 Đặc điểm phân bố

Theo Trương Thủ Khoa và Trần Thị Thu Hương (1993); Roberts và Vidthayanon (1991) thì cá tra là loài có giá trị kinh tế và được nuôi phổ biến ở khu vực châu Á, đặc biệt là Đông Nam Á như Thái Lan, Lào, Cam-pu-chia và Việt Nam Đồng bằng Nam Bộ có truyền thống nuôi cá tra và cá basa phổ biến trong ao, bè và hiện nay trở thành đối tượng xuất khẩu quan trọng trong nền kinh tế quốc dân (Bộ Thủy Sản, 2004)

Cá Tra là một trong những loài cá có giá trị kinh tế cao Đây là loài cá có kích thước lớn, dễ nuôi, tăng trọng nhanh Hiện nay cá Tra có nguồn gốc sinh sản nhân tạo đã được thả nuôi ổn định và là một trong những đối tượng nuôi trồng thủy sản phát triển với tốc độ nhanh tại các tỉnh ĐBSCL

2.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA ĐỘNG VẬT THỦY SẢN

2.2.1 Cấu trúc cơ thịt cá

Theo Trần Thị Thanh Hiền (1999), cấu trúc của thịt cá gần giống cấu trúc của các động vật khác gồm có mô cơ, mô liên kết, mô mỡ và mô xương; trong đó mô cơ được quan tâm hơn Căn cứ vào chức năng cấu tạo, vị trí các loại cơ người ta chia ra

ba nhóm: cơ vân ngang, cơ trơn, cơ tim Trong đó, cơ vân ngang được quan tâm nghiên cứu vì nó cấu tạo nên cơ thịt động vật và là phần có giá trị thực phẩm cao nhất Cơ vân ngang của cá thường có màu đỏ thẩm và màu nhạt cấu tạo nên phần thịt đỏ và thịt trắng của cá

2.2.2 Thành phần hóa học trong cơ thịt cá

Thành phần hóa học của động vật thủy sản bao gồm: nước, protein, lipid, glucid, muối khoáng và các vitamin Lượng glucid trong động vật thủy sản thường rất ít và tồn tại dưới dạng glycogen (Trần Thị Thanh Hiền, 1999) Theo Phan Thị Thanh Quế (2006), thành phần thức ăn, môi trường sống, kích cỡ cá và các đặc tính di truyền cũng ảnh hưởng đến thành phần hóa học, đặc biệt là ở cá nuôi

Nói chung, động vật thủy sản đều có các thành phần hóa học như đã đề cập, chỉ khác nhau về hàm lượng có trong cơ thịt Cũng như các loài cá khác, thịt cá Tra là nguồn protein động vật chất lượng cao, cung cấp nhiều protein, các chất khoáng quan trọng và có chứa nhiều loại vitamin cần thiết cho sức khỏe Các protein trong

cá nhìn chung dễ đồng hóa, dễ hấp thu hơn thịt và cung cấp đầy đủ các acid amin cần thiết (www.vinhhoan.com.vn)

Bảng 2.1 Thành phần dinh dưỡng của cá Tra trên 100 g thành phẩm ăn được

màng sợi cơ, trong tơ cơ và các màng ngăn Nước kết hợp liên kết với protein ở trạng thái keo đặc hoặc ở trạng thái hòa tan trong các muối vô cơ (Trần Thị Thanh Hiền, 1999)

2.2.2.2 Protein và thành phần trích ly chứa nitơ phi protein

Theo Lê Ngọc Tú et al., (2003), cơ thịt cá rất giống cơ thịt động vật máu nóng, chỉ

khác nhau chủ yếu ở những điểm sau:

 Hàm lượng mô liên kết trong cơ cá thấp hơn, các protein của chất đệm (khung mạng) chỉ chiếm 3-10% tổng lượng protein

 Các sợi cơ thịt cá ngắn hơn và được tổ chức thành những lớp mỏng

 Myosin chiếm 40% protein tổng số và rất khó tách ra khỏi actin Protein này rất nhạy với biến tính nhiệt và rất dễ bị thủy phân bởi protease hơn myosin ở động vật máu nóng

 Hiện tượng co cứng và chín của thịt cá diễn ra nhanh hơn Sau khi chết, pH giảm ít hơn từ 7 xuống 6,5-6,2, do đó rất không bền đối với vi sinh vật

Theo Phan Thị Thanh Quế (2006), protein của thịt cá có giá trị thực phẩm cao vì có tất cả những aicd amin cần thiết cho người Protein ngũ cốc thường thiếu lysine và các acid amin có chứa lưu huỳnh (methionine, cysteine), trong khi protein của cá là nguồn giàu các acid amin này Có thể chia protein của mô cơ cá thành ba nhóm:

Protein cấu trúc (protein tơ cơ)

Gồm các sợi myosin, actin, actomyosin, troponin và tropomyosin chiếm khoảng 75% tổng hàm lượng protein trong cá Các protein này có chức năng co rút đảm nhận các hoạt động của cơ, myosin và actin là các protein tham gia trực tiếp vào quá trình co duỗi cơ, chúng có khả năng hòa tan trong dung dịch muối trung tính có nồng độ ion khá cao (>0,5M) (Phan Thị Thanh Quế, 2006)

65-Protein chất cơ (protein tương cơ)

Gồm myoglobin, myoalbumin, globulin và các enzyme, chiếm khoảng 25-30% hàm lượng protein trong cá Các protein này hòa tan trong nước, trong dung dịch muối trung tính có nồng độ ion thấp (<0,15M) Hầu hết protein chất cơ bị đông tụ khi đun nóng trong nước ở nhiệt độ trên 50 o

C (Phan Thị Thanh Quế, 2006)

Protein mô liên kết

Bao gồm các sợi collagen, elastin Hàm lượng collagen ở cơ thịt cá thấp hơn động vật có vú, thường khoảng 1-10% tổng lượng protein và 0,2-2,2% trọng lượng của cơ thịt, có trong mạng lưới ngoại bào, không tan trong nước, dung dịch kiềm hoặc dung dịch muối có nồng độ cao (Phan Thị Thanh Quế, 2006)

Cũng theo Phan Thị Thanh Quế (2006), chất phi protein là thành phần hòa tan trong nước có khối lượng phân tử thấp Thành phần chính của các hợp chất này bao gồm các chất bay hơi (amoniac, amine, trimethylamin, dimethylamin), trimethylamineoxide (TMAO), dimethylamineoxide (DMAO), creatin, các acid amin tự do, nucleotide, urê,

Trimethylaminoxide (TMAO)

TMAO có chủ yếu trong các loài cá nước mặn và ít được tìm thấy trong các loài cá nước ngọt Hàm lượng TMAO trong cá khác nhau tùy theo loài, điều kiện sinh sống, kích cỡ Cá hoạt động bơi lội nhiều, kích cỡ lớn chứa nhiều TMAO hơn cá nhỏ, ít bơi lội trong nước

Acid amin tự do

Các acid amin tự do chiếm khoảng 0,5-2% trọng lượng cơ thịt, chúng góp phần tạo nên mùi vị thơm ngon đặc trưng của nguyên liệu

Urê

Urê có phổ biến trong tất cả cơ thịt cá, trong quá trình bảo quản, urê phân hủy thành

NH3 và CO2 dưới tác dụng của enzyme urease của vi sinh vật

Amoniac (NH 3 )

Trong cơ thịt cá tươi có một lượng nhỏ amoniac Khi sự hư hỏng tiến triển, pH của

cơ thịt chuyển sang môi trường kiềm do lượng amoniac tăng tạo nên mùi ươn thối của cá

Thành phần chất béo trong cá khác xa so với các loài động vật có vú khác Điểm khác nhau chủ yếu là chúng bao gồm các acid béo chưa bão hòa cao Chất béo trong

cá chứa nhiều acid béo chưa bão hòa do đó rất dễ bị oxi hóa, sinh ra các sản phẩm cấp thấp như aldehyde, ceton, (Phan Thị Thanh Quế, 2006)

2.2.2.4 Glucid

Hàm lượng glucid trong cơ thịt cá rất thấp, thường dưới 0,5%, tồn tại dưới dạng năng lương dự trữ glycogen Sau khi chết, glycogen trong cơ thịt chuyển thành acid lactic, làm giảm pH của cơ thịt, mất khả năng giữ nước của protein (Phan Thị Thanh Quế, 2006)

2.2.2.5 Các vitamin và khoáng chất

Theo Phan Thị Thanh Quế (2006), cá là nguồn cung cấp chính vitamin nhóm B (B1, B2 và B12), vitamin A và D có chủ yếu trong các loài cá béo Vitamin trong động vật thủy sản chủ yếu tập trung ở nội tạng đặc biệt là gan và một phần ở tuyến sinh dục (chủ yếu là nhóm A và D), một số khác phân bố trong cơ dưới dạng hợp chất đơn giản (Trần Thị Thanh Hiền, 1999)

Cũng theo Trần Thị Thanh Hiền (1999), nguồn khoáng quan trọng và chiếm số lượng nhiều trong động vật thủy sản là Ca, P, Fe, I, trong đó hàm lượng Fe chiếm khoảng 12% tổng lượng khoáng Chất khoáng của cá phân bố chủ yếu trong mô xương, thịt cá là nguồn giàu Fe, Cu, S, I, ngoài ra còn có Ni, Co, Pb, Zn (Phan Thị Thanh Quế, 2006)

2.3 SƠ LƯỢC VỀ NGUỒN PHỤ PHẨM CÁ TRA VÀ CÁC NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN

2.3.1 Sơ lược về nguồn phụ phẩm

Phụ phẩm từ cá Tra cũng rất giàu protein có thể được sử dụng để sản xuất bột cá, dầu bio-diesel, thức ăn chăn nuôi và có thể chế biến các mặt hàng giá trị gia tăng

như chả cá, surimi, cá viên, xúc xích Theo Tanuja et al., (2012), một số lượng lớn

phụ phẩm giàu protein (bao gồm đầu, khung xương, nội tạng, da và mô cơ) được loại bỏ mỗi năm từ các nhà máy chế biến thủy sản không được thu hồi hoặc chuyển thành các sản phẩm giá trị thấp như bột cá hoặc phân bón Do đó, thu hồi protein từ phần phụ phẩm và chuyển chúng thành các sản phẩm giá trị gia tăng không chỉ nâng cao giá trị kinh tế mà còn giảm thiểu tác hại đối với môi trường Hiện nay nguồn phụ phẩm từ các nhà máy chế biến thủy sản ở ĐBSCL là rất lớn hơn 1 triệu tấn/năm (VASEP, 2014), đó sẽ là nguồn nguyên liệu dồi dào nếu như các nghiên cứu được ứng dụng vào thực tiễn

2.3.2 Ứng dụng enzyme protease trong công nghệ thực phẩm

Quá trình thủy phân protein đóng vai trò quan trọng trong sản xuất nhiều loại thực phẩm Trong nhiều trường hợp, các tính chất thực phẩm của protein được cải thiện

nhờ thủy phân hạn chế hoặc sâu sắc bằng các enzyme protease Sự thủy phân hạn chế có tác dụng tăng khả năng nhũ hóa và tạo bọt của protein (do tăng tính hòa tan

và khả năng khuếch tán đến bề mặt phân chia Thủy phân hạn chế cũng được sử dụng để hòa tan các protein (do tạo được các polypeptide nhỏ hơn, háo nước hơn, phân tán dễ dàng hơn), hoặc cũng có thể làm đông tụ protein Nói chung thủy phân bằng protease làm tăng khả năng tiêu hóa của protein nên đặc biệt có lợi cho những người có hệ tiêu hóa kém Bên cạnh đó, các protease cũng được dùng để xử lý, tận dụng các phế liệu từ thịt hoặc các nguyên liệu có nguồn gốc protein (thịt vụn, xương, gelatin, ) để tạo ra các sản phẩm có giá trị kinh tế như dịch protein, các chất tăng vị, các chất cải thiện mùi, (Hoàng Kim Anh, 2008)

2.3.3 Các nghiên cứu về protein thủy phân

Ngành công nghiệp chế biến thủy sản đang phát triển mạnh không chỉ riêng Việt Nam mà còn ở các quốc gia khác Việc nghiên cứu nhằm tìm ra phương pháp làm

tăng giá trị từ nguồn phụ phẩm này đã được quan tâm rất nhiều Cao Xuân Thúy et al., (2014) tiến hành tối ưu hóa quá trình thủy phân phụ phẩm cá Tra bằng enzyme

Alcalase 2.4L thu được FPI (fish protein isoltae) có khả năng tạo bọt, nghiên cứu chỉ ra rằng khả năng tạo bọt của dung dịch sau thủy phân cao nhất đạt 94,92% ở tỷ

lệ enzyme 0,2% (v/w) trong thời gian 92 phút và nhiệt độ 64 oC Một nghiên cứu

khác của Cao Xuân Thúy et al., (2014) khi tiến hành thủy phân protein từ phụ phẩm

cá Tra thu được FPI (fish protein islolate) có những tính chất như khả năng tạo bọt, khả năng nhũ tương hóa không thua kém các sản phẩm thủy phân protein từ đậu

nành (SPI) và protein sữa (WPI) Tiếp nối thành công trên, Cao Xuân Thúy et al.,

(2014) tiến hành tối ưu hóa công nghệ lọc nano để thu được các FPI, sau đó nghiên cứu điều kiện thích hợp để tạo liên kết với ion Ca2+ tăng hoạt tính sinh học và được

sử dụng như một phụ gia bổ sung vào trong thực phẩm giúp nâng cao khả năng hấp thụ Ca2+ cho người sử dụng Nguyễn Phước Minh (2014), tiến hành so sánh khả năng thủy phân protein từ phụ phẩm cá Tra bằng hai enzyme bromelain và alcalase Kết quả thu được enzyme alcalase cho hàm lượng protein hòa tan và đạm amin cao

hơn nhiều so với bromelain Trần Thị Hồng Nghi et al., (2008), nghiên cứu ứng dụng hệ enzyme protease từ vi khuẩn Bacillus subtilis để thủy phân phụ phẩm cá

Tra và thử nghiệm sản xuất nước mắm từ dịch thủy phân Kết quả hàm lượng đạm tổng số đạt 16 g/l xếp hạng loại một theo yêu cầu chất lượng và kỹ thuật của sản xuất nước mắm

Tanuja et al., (2012) sử dụng hai enzyme papain và bromelain cho quá trình thủy

phân phụ phẩm cá Tra Sau đó, so sánh thành phần, tính chất chức năng và hoạt tính chống oxi hóa của dịch thủy phân bởi hai loại enzyme này Kết quả cho thấy, dịch đạm sau khi thủy phân bằng enzyme papain cho hàm lượng peptide hòa tan, chất khoáng, khả năng tạo bọt cao hơn so với bromelain Một nghiên cứu khác của

Tanuja et al., (2014) được tiến hành trên cơ thịt cá Tra (không phải phụ phẩm) với

mục đích nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ enzyme alcalase đến hiệu suất thủy phân, các tính chất chức năng và hoạt tính chống oxi hóa Nghiên cứu chỉ ra rằng các tính chất chức năng và hoạt tính chống oxi hóa tốt nhất ở nồng độ enzyme 0,5% (v/w)

2.4 KHÁI QUÁT VỀ ENZYME

2.4.1 Khái niệm về enzyme

Theo Nguyễn Công Hà và Lê Nguyễn Đoan Duy (2011), hầu hết các phản ứng trong tế bào đòi hỏi sự hiện diện của một enzyme cụ thể, chức năng chính của các enzyme trong một hệ thống sống là xúc tác cho việc tạo ra và phá vỡ các liên kết hóa học Do đó, giống như bất kỳ chất xúc tác khác, chúng làm gia tăng tốc độ phản ứng mà không tự làm thay đổi về mặt hóa học của bản thân nó Enzyme xúc tác phản ứng khác với các phản ứng hóa học như sau:

 Chất xúc tác enzyme mang tính đặc hiệu cao và xúc tác chỉ có một hoặc một

số nhỏ các phản ứng hóa học

 Tốc độ của phản ứng enzyme xúc tác thường là nhanh hơn nhiều so với các phản ứng tương tự khi được xúc tác bởi các chất xúc tác không phải sinh học

 Các điều kiện phản ứng như nhiệt độ, áp suất và pH cho các phản ứng enzyme là rất nhạy cảm

 Enzyme là các phân tử tương đối nhạy cảm và thường không ổn định do vậy cần phải thận trọng khi sử dụng

2.4.2 Tính đặc hiệu của enzyme

Cũng theo Nguyễn Công Hà và Lê Nguyễn Đoan Duy (2011), đặc tính quan trọng nhất của enzyme đó là tính đặc hiệu Tính đặc hiệu của enzyme là khả năng xúc tác

có chọn lọc, xúc tác cho sự chuyển hóa một hay một số chất nhất định theo một kiểu phản ứng nhất định Tính đặc hiệu của enzyme được biểu hiện như sau:

Đặc hiệu phản ứng: kiểu đặc hiệu này biểu hiện đối với cơ chất có mang một loại liên kết hóa học nhất định hay các enzyme chỉ có thể xúc tác cho một trong những kiểu phản ứng chuyển hóa cơ chất nhất định

Đặc hiệu cơ chất: mỗi cơ chất có một loại enzyme tương tác tương ứng, enzyme có thể phân biệt được những cơ chất mà nó sẽ tác dụng Khả năng này còn thấy rõ khi trong quá trình phản ứng tồn tại các dạng đồng phân

2.4.3 Trung tâm hoạt động

Theo Nguyễn Đức Lượng et al., (2004), không phải toàn bộ các phần của enzyme

tham gia vào hoạt động xúc tác, mà chỉ có những bộ phận rất đặc biệt mang tính đặc hiệu trong phân tử protein enzyme mới tham gia xúc tác phản ứng Bộ phận đặc hiệu này được gọi là trung tâm hoạt động của enzyme Trung tâm hoạt động của enzyme thường chứa các amino acid có nhóm hóa học hoạt động mạnh như serine, histidine, cysteine, lysine, arginine, glutamic acid, aspartic acid, trypthophan

Trong trung tâm hoạt động của enzyme còn sự hiện diện của các ion kim loại có vai trò xúc tác lớn Ngoài nhóm các gốc amino acid, ion kim loại, các nhà khoa học cho thấy các nhóm chức của coenzyme cũng được coi như một thành phần cấu tạo của

trung tâm hoạt động của enzyme (Nguyễn Đức Lượng et al., 2004)

Hoạt động xúc tác của trung tâm hoạt động enzyme

Một số các tương tác vật lý và hóa học xảy ra tại trung tâm hoạt động xúc tác cho phản ứng nhất định nào đó của enzyme (Nguyễn Công Hà và Lê Nguyễn Đoan

Duy, 2011) Theo Nguyễn Đức Lượng et al., (2004), hoạt động xúc tác của trung

tâm hoạt động có liên quan đến cơ chất Các cơ chất tiến gần tới trung tâm hoạt động tạo phức enzyme – cơ chất, về mặt nhiệt động học, phức enzyme – cơ chất làm giảm năng lượng hoạt hóa làm phản ứng xảy ra dễ dàng (Trần Đình Toại và Nguyễn Thị Vân Hải, 2005)

Năm 1894, Fisher giả thuyết rằng enzyme hoạt động theo kiểu chìa khóa và ổ khóa, đối với từng loại cơ chất coi là chìa khóa thì chỉ vừa một loại enzyme nào đấy (tức ổ khóa) (Trần Đình Toại và Nguyễn Thị Vân Hải, 2005)

Hình 2.2 Mô hình chìa khóa và ổ khóa của Fisher

(www.blogscientificamerican.com)

Thuyết trung tâm hoạt động linh hoạt của Koshland được nhiều nhà khoa học chấp nhận hơn Chính cơ chất là tác nhân tác động làm thay đổi cấu trúc không gian của trung tâm hoạt động của enzyme Tác động cảm ứng này của cơ chất làm cho các gốc amino acid, các nhóm chức của trung tâm hoạt động di chuyển, định hướng một

cách thích hợp, chính xác để gắn với cơ chất và thực hiện quá trình xúc tác (Nguyễn

là cung cấp thông tin về cơ chế cơ bản và những tham số khác của enzyme đặc trưng cho tính chất của enzyme

Các phương trình tốc độ phản ứng phát triển từ các nghiên cứu động học có thể được áp dụng trong tính toán thời gian phản ứng, năng xuất và điều kiện kinh tế tối

ưu Điều này rất quan trọng trong thiết kế bình phản ứng cho enzyme đó một cách hiệu quả (Nguyễn Công Hà và Lê Nguyễn Đoan Duy, 2011)

Phương trình động học Michaelis-Menten

Theo Nguyễn Đức Lượng et al., (2004), hai nhà khoa học Leonom Michaelis và

Maud Menten đã đưa ra mô hình động học để giải thích phản ứng được xúc tác bởi enzyme và lập phương trình phản ánh quan hệ giữa vận tốc phản ứng với nồng độ

cơ chất Theo mô hình này, enzyme và cơ chất sẽ kết hợp với nhau, tạo nên phức hợp enzyme – cơ chất (ES) Phức hợp ES sẽ lại được chuyển hóa tiếp tục để tạo thành sản phẩm (P) và giải phóng enzyme (E)

Mô hình được mô tả như sau:

Trong đó: K1, K2, K3, K4 là những hằng số vận tốc của các phản ứng tương ứng; K4

là hằng số vận tốc phản ứng tạo ES từ P và E nhỏ nhất Trong mô hình trên, phản ứng chuyển hóa từ ES P + E là phản ứng quan trọng nhất, quyết định toàn bộ quá trình chuyển hóa S P

Vận tốc phản ứng ES P + E tỷ lệ với nồng độ ES Khi nồng độ ES càng cao thì vận tốc phản ứng càng cao: V K2[ES] (1.2) Giả sử nồng độ enzyme ban đầu được ký hiệu là [E0]; nồng độ phức hợp enzyme-cơ chất là [ES]; nồng độ enzyme tự do khi phản ứng đạt cân bằng là [E] Ta có:

[E][E0][ES] (1.3) Nếu giả sử nồng độ cơ chất ban đầu (cũng là nồng độ cơ chất ở trạng thái cân bằng của phản ứng) thì sẽ thấy rằng nồng độ cơ chất thường lớn rất nhiều lần so với enzyme

Ở giai đoạn đầu của phản ứng, nếu nồng độ cơ chất thấp thì tốc độ phản ứng enzyme sẽ phụ thuộc tuyến tính với nồng độ cơ chất Có thể tính được vận tốc phản ứng trong trường hợp như sau:

Vận tốc phản ứng thuận: V1K1[ES][S] (1.4) Vận tốc phản ứng nghịch: V2 K2[ES][S] (1.5) Vận tốc phản ứng tạo ra sản phẩm: V3 K3[ES][S]

Trong giai đoạn cân bằng, sự phân ly ES sẽ cân bằng với sự tạo ra ES Khi đó vận tốc phản ứng sẽ là: V1 V2V3 (1.6) Thay các giá trị V vào (1.6):

K1([E0][ES])[S](K2 K3)[ES] (1.7)

Từ đó:

] [

] [

] ][

[ ]

[

3 2 1

0 1

K K S K

S E K ES

] ][

[ ]

S K

S E ES

] ][

[ 0

1 0

S K

S E K V

m

 (1.10)

Khi nồng độ cơ chất đủ lớn sao cho tất cả nồng độ enzyme đều tham gia phản ứng

để tạo ra phức hợp enzyme-cơ chất, ta có: [ES][E0] (1.11) Theo lý thuyết, phản ứng sẽ tạo ra được vận tốc cực đại

Vmax K3[E0] (1.12)

Từ đó, có thể thiết lập được cân bằng:

][

][max 0

S K

S V V

] [ 2

max max

S K

S V V

V

V 

Từ phương trình trên, đồ thị phản ánh ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến vận tốc ban đầu của phản ứng như sau:

Hình 2.4 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đối với tốc độ xúc tác ban đầu

(nguồn: Nguyễn Đức Lượng et al., 2004)

Theo Nguyễn Công Hà và Lê Nguyễn Đoan Duy (2011), để tìm được tốc độ cực đại

và Km, giữ số lượng enzyme là hằng số và cho giá trị nồng độ cơ chất tăng dần Tốc

độ phản ứng sẽ gia tăng và đạt đến cực đại Vmax Sau điểm này, nếu gia tăng nồng

độ cơ chất sẽ không còn gia tăng tốc độ phản ứng nữa

Km là nồng độ cơ chất mà ở đó vận tốc đầu phản ứng bằng một nửa vận tốc cực đại

Vì vậy đơn vị đo Km cũng là đơn vị đo nồng độ cơ chất như mol, g, % (nếu chưa biết khối lượng phân tử cơ chất, ví dụ như tinh bột, protein, ) Vmax thay đổi theo nồng độ enzyme có mặt còn trị số Km thì không phụ thuộc nồng độ enzyme mà là đặc trưng cho từng enzyme với mỗi cơ chất Km bé, ái lực của enzyme với cơ chất lớn và ngược lại Vì vậy, việc xác định trị số Km có ý nghĩa quan trọng trong nghiên cứu enzyme (Phạm Thị Trân Châu và Phan Tuấn Nghĩa, 2007)

μM/phút

V0 = Vmax

½ Vmax

2.4.5 Những yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động enzyme

2.4.5.1 Nồng độ cơ chất

Theo Nguyễn Công Hà và Lê Nguyễn Đoan Duy (2011), khi nồng độ cơ chất phản ứng tăng, cơ hội cơ chất gặp được enzyme nhiều thì tốc độ phản ứng tăng theo Tuy nhiên, sự liên hệ này chỉ giới hạn đến một nồng độ nhất định nào đó Nếu tiếp tục tăng nồng độ cơ chất sẽ ức chế ngược lại hoạt động xúc tác của enzyme

2.4.5.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Theo Nguyễn Đức Lượng et al., (2011), nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến phản ứng

enzyme, tốc độ phản ứng enzyme không phải lúc nào cũng tỉ lệ thuận với nhiệt độ phản ứng Tốc độ phản ứng chỉ tăng đến một giới hạn nhiệt độ nhất định, vượt quá nhiệt độ đó, tốc độ phản ứng enzyme sẽ giảm và sẽ dẫn đến mức triệt tiêu Khi nhiệt

độ tăng, sự biến tính nhiệt phá hủy các hoạt động của các phân tử enzyme, điều này

là do sự mở ra của chuỗi protein sau khi bị mất các liên kết yếu như liên kết hydro,

vì thế vận tốc phản ứng bị giảm (Nguyễn Công Hà và Lê Nguyễn Đoan Duy, 2011)

Hình 2.5 Sự phụ thuộc của enzyme vào nhiệt độ

(nguồn: www.namrata.co)

2.4.5.4 Ảnh hưởng của pH

pH môi trường thường ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, enzyme và đặc biệt ảnh hưởng đến độ bền của enzyme, chính vì thế pH có ảnh hưởng rất mạnh đến

phản ứng của enzyme (Nguyễn Đức Lượng et al., 2004) Giá trị pH thấp hay cao

ngoài điểm tối ưu sẽ dẫn đến kết quả giảm hoạt tính của hầu hết enzyme một phần hay hoàn toàn

Hình 2.6 Sự phụ thuộc của enzyme vào pH

(nguồn:www.bbc.co.uk)

2.5 ENZYME PAPAIN (E.C.3.4.22.2)

2.5.1 Giới thiệu về enzyme papain

Papain là enzyme cystein protease được trích ly từ nhựa cây đu đủ Papain được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau như: công nghiệp thực phẩm, dược phẩm, công nghệ hóa chất, (Nguyễn Phú Thọ và Dương Thị Hương Giang, 2011)

Trong công nghiệp thực phẩm, papain được sử dụng để làm mềm thịt, cá trước khi đóng hộp; làm tăng giá trị cảm quan thực phẩm Trong sản xuất bia, papain được sử dụng để ngăn chặn hiện tượng vẫn đục của bia trong giai đoạn ổn định sản phẩm Ngoài ra, có thể sử dụng papain vào trong quá trình sản xuất nước mắm để rút ngắn thời gian lên men (Nguyễn Phú Thọ và Dương Thị Hương Giang, 2011)

2.5.2 Đặc điểm chung

Theo Nguyễn Đức Lượng et al., (2004), papain là một endoprotease có chứa 16,1%

N và 1,2% S, là một protease thiol gồm 212 amino acid, trọng lượng phân tử là

23.350 Da Theo Lê Ngọc Tú et al., (2000) thì hàm lượng N trong papain là 15,5%,

trọng lượng phân tử là 20.700 Da, được cấu tạo từ 212 acid amin và không chứa methionine

Phân tử lượng là một mạch polypeptide với đầu N là isoleusine, đầu C là asparagine, có 6 gốc cysteine tạo thành ba cầu disulfua ở các vị trí 22-63, 56-95, 153-200, không có chức năng sinh học chỉ làm tăng tính chất bền vững của cấu trúc

và một nhóm –SH tự do ở vị trí 25 (Lê Ngọc Tú et al., 2000; Nguyễn Đức Lượng et al., 2004)

2.5.3 Cấu trúc không gian

Theo Nguyễn Đức Lượng et al., (2004), phân tử papain có dạng cầu với kích thước:

36×48×36 Ao, mạch chính bị gấp thành hai phần riêng biệt bởi một khe Trung tâm hoạt động nằm tại bề mặt của khe này, nhóm sulfhydryl hoạt động của cysteine 25 nằm bên trái khe và nhóm histidine 159 nằm bên phải khe, phần xoắn α chiếm 20% toàn bộ các amino acid có trong phân tử

Hình 2.7 Cấu trúc không gian của enzyme papain

(nguồn: Kamphuis, 1984)

2.5.4 Cấu trúc trung tâm hoạt động của papain

Tâm hoạt động của papain gồm có nhóm –SH của cysteine 25 và nitrogen bậc 3 của histidine 159 Bên cạnh đó, nhóm imidazole của His 159 cũng liên kết với Asp 175 bởi liên kết hydrogen Vùng trung tâm hoạt động của papain chứa mạch polypeptide với các amino acid là Lys-Asp-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Ser-Cys (Nguyễn Đức Lượng

et al., 2004) Theo Lê Ngọc Tú et al., (2000), chuỗi polypeptide của trung tâm hoạt

động của enzyme papain là Pro-Val-Lys-Asp-Gly-Gly-Ser-Cys-Gly-Ser-Cys-Tryp

2.5.5 Hoạt tính enzyme và cơ chế tác dụng

Theo Lê Ngọc Tú et al., (2000); Nguyễn Đức Lượng et al., (2004), papain thủy

phân protein thành các polypeptide và các amino acid, nó đóng vai trò vừa như endopeptidase vừa như exopeptidase

Các endopeptidase thủy phân protein chủ yếu thành peptide:

liên kết với proline với các glultamic acid có nhóm carboxyl tự do (Lê Ngọc Tú et al., 2000; Trần Đình Toại và Trần Trung Hiếu, 2003; Nguyễn Đức Lượng et al., 2004) Theo Nguyễn Đức Lượng et al., (2004), khả năng thủy phân cơ chất của

papain còn tùy thuộc vào trạng thái của cơ chất, nếu cơ chất bị biến tính thì papain

có khả năng thủy phân sâu hơn

Theo Lê Ngọc Tú et al., (2000); Nguyễn Đức Lượng et al., (2004), enzyme có thể

nhận biết một chuỗi gồm 7 amino acid trên cơ chất peptide của mình Enzyme sẽ ưu tiên cắt liên kết peptide trên một chuỗi có phenylalanin ở vị trí P2 như hình sau:

Hình 2.8 Sự sắp xếp tương ứng của enzyme và chuỗi gồm 7 gốc amio acid của cơ chất

(nguồn: Nguyễn Đức Lượng et al., 2004)

Các peptide kiểu như X-Phe-Y-Z (X, Y, Z là các gốc amino acid) thì sẽ được cắt tại

vị trí giữa Y và Z Các peptide kiểu như X-Phe-Y có phenylalanine nằm ở vị trí thứ hai trước đầu tận cùng thì không được thủy phân bởi papain Không những thế, các peptide này còn có tác dụng như chất kìm hãm cạnh tranh của papain (Nguyễn Đức

2.5.6 Tính chất của papain

2.5.6.1 Chất hoạt hóa

Papain cần nhóm sulfhydryl tự do để thể hiện hoạt tính xúc tác, do trung tâm hoạt động của papain bao gồm nhóm cysteine 25 và nitrogen bậc 3 của histidine 159 có tính khử nên các chất đóng vai trò hoạt hóa papain là các chất có tính khử như: cysteine, glutation acid, hydrocyanic, hydrogensulfite, sodiumthiosulfate, Khi có mặt các chất này thì nhóm –SH ở trung tâm hoạt động của papain được phục hồi và

làm tăng hoạt tính papain (Nguyễn Đức Lượng et al., 2004)

2.5.6.2 Chất kìm hãm

Theo Trần Đình Toại và Trần Trung Hiếu (2003), các chất ức chế papain là các chất

có tính oxi hóa như: oxygen, ozon, hydroperoxide, iotaxetate, iotaxetamit, p-chlomercuribenzoat, N-(N-axetyl-1-phenylalanyl), cystamin, amino axetonitril và các hợp chất disunfua khác

Theo Nguyễn Đức Lượng et al., (2004), papain bị bất hoạt thuận nghịch bởi không

khí, cysteine nồng độ thấp, các ion kim loại nặng (Cd+

, Cu2+, Zn2+, Hg2+, Pb2+,

Fe2+) Các tác nhân aldehyde như phenyl hydrazine, hydroxylamine cũng ức chế papain Papain tác dụng với chloromethyl cetone của phenylalanine và lysine thì mất hoàn toàn hoạt tính Carboxyl-L-glutamic acid ức chế không cạnh tranh ở pH 3,9 - 4,5

2.5.6.3 Nhiệt độ môi trường

Papain chịu được nhiệt độ tương đối cao Ở dạng nhựa khô papain không bị biến tính trong 3 giờ ở 100 oC Còn ở dạng dung dịch papain bị mất hoạt tính sau 30 phút

ở 82,5 oC và nếu tăng nhiệt độ cao hơn (>100 oC) thì nó sẽ bị mất hoạt tính hoàn toàn kể cả khi thêm lượng lớn chất hoạt hóa vào dung dịch, điều này là do cấu trúc của trung tâm hoạt động enzyme papain bị phá hủy ở nhiệt độ cao (Nguyễn Đức

Lượng et al., 2004)

Đáng chú ý khi đã được tinh sạch và ở trạng thái tinh thể thì papain có độ bền nhiệt thấp hơn papain ở trong mủ nhựa bởi lẽ trong mủ nhựa còn chứa các protein khác

có tác dụng bảo vệ nó (Lê Ngọc Tú et al., 2000) Papain trong dung dịch NaCl giữ ở

4 oC bền trong nhiều tháng Trong dung dịch dẫn xuất thủy ngân, papain cũng không mất hoạt tính trong nhiều tháng trong khi enzyme mất hoạt tính của nó mỗi ngày 1 – 2% do sự tự phân hoặc oxi hóa Khi thủy phân các protein khác nhau thì tùy thuộc vào cơ chất mà nhiệt độ phản ứng thích hợp cho papain cũng khác nhau

(Nguyễn Đức Lượng et al., 2004)

(Nguyễn Đức Lƣợng et al., 2004)

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU

3.1.1 Thời gian và địa điểm

Thời gian: từ 8/8/2014 đến 12/12/2014

Địa điểm: đề tài được thực hiện tại các phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ thực phẩm, Bộ môn Khoa học đất, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại Học Cần Thơ

Máy đo ẩm MA35-Sartorius35

Tủ đông Panasonic MDF-U334-PE (Nhật Bản)

Cân phân tích OHYO JL200 (Nhật Bản)

Tủ sấy Lab Companion

Máy xay thịt CRUZO

Hệ thống Kjeldahl, hệ thống Soxhlet

Máy đo pH TOA HM-12P (Nhật Bản)

Máy đo quang phổ MULTISKAN SPECTRUM

Bể điều nhiệt Memmert (Đức)

Một số dụng cụ khác ở phòng thí nghiệm

3.1.4 Hóa chất

Xác định đạm tổng

NaOH 30% (Trung Quốc)

Hỗn hợp chất xúc tác (K2SO4:CuSO4:Se) (Trung Quốc)

H2SO4 đậm đặc, H2SO4 0,1N, H3BO3 2% (Trung Quốc)

Xác định hàm lượng lipid

Ether dầu hỏa 30-60 (Trung Quốc)

Xác định hàm lượng tyrosine