4.2 ẢNH HƯỞNG CỦA ENZYME PAPAIN ĐẾN QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN
4.2.3 Khảo sát thời gian thủy phân tối ƣu
Từ cặp tỷ lệ E/S là 1/2,5 đƣợc chọn ở thí nghiệm 2, tiến hành khảo sát ở các mốc thời gian khác nhau 30 phút, 60 phút, 90 phút, 120 phút, 180 phút, 240 phút để tìm đƣợc thời gian cho quá trình thủy phân của enzyme papain là tối ƣu nhất. Kết quả đƣợc thể hiện bằng đồ thị hình 4.2.
Khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng - Đại Học Cần Thơ 31
Hình 4.2: Đồ thị thể hiện hiệu suất thủy phân Tyrtp/Tyrt và theo phương pháp OPA ở cặp tỷ lệ 1 mg/2,5 g theo thời gian khác nhau.
Đồ thị hình 4.2 cho thấy, thời gian thủy phân càng dài thì các acid amin cũng nhƣ các peptide có khối lƣợng phân tử thấp sinh ra càng nhiều, đƣợc thể hiện qua giá trị hiệu suất Tyrtp/Tyrt và OPA. Hiệu suất Tyrtp/Tyrt trong khoảng 30 phút đầu của quá trình thủy phân ở tỷ lệ 1/2,5 là 4,909% và tăng lên 15,796% ở 90 phút. Kết quả chạy điện di (mục 4.2.4) cho thấy hiệu suất Tyrtp/Tyrt ở 30 phút và 90 phút có sự khác biệt đáng kể. Trong khoảng 30 phút đầu tiên của quá trình thủy phân, các acid amin hình thành rất ít, sản phẩm chủ yếu là các peptide phân tử lƣợng cao. Do đó, hiệu suất Tyrtp/Tyrt và OPA tăng không đáng kể. Tuy nhiên, sau 90 phút thủy phân thì sự khác biệt trở nên rõ rệt hơn, hiệu suất Tyrtp/Tyrt và OPA tăng lên đáng kể tương ứng 15,796% và 3,84%. Theo Nguyễn Đức Lƣợng et al., (2004), tính đặc hiệu cơ chất của enzyme papain rất rộng, papain có khả năng phân hủy hầu hết các liên kết peptide trừ các liên kết với proline và với glutamic acid có nhóm carboxyl tự do, chính vì thế sản phẩm sau 90 phút thủy phân trên gel điện di là các acid amin và các peptide có trọng lƣợng phân tử thấp.
Hiệu suất Tyrtp/Tyrt và OPA trong các khoảng thời gian thủy phân tiếp theo từ 120-240 phút đều tăng lên đáng kể, đạt cao nhất ở 240 phút so với các mốc còn lại tương ứng 29,186% và 7,53% và chưa có dấu hiệu ổn định. Theo kết quả nghiên cứu của Tạ Hùng Cường (2014), tỷ lệ E/S 2,5/0,905 (mg/g protein) trên cơ chất thịt dè cá Tra đối với enzyme bromelain cho hiệu suất Tyrtp/Tyrt tăng nhanh trong khoảng thời gian đầu của quá trình thủy phân, tuy nhiên trong khoảng thời gian từ
Khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng - Đại Học Cần Thơ 32 120-240 phút hiệu suất tăng lên không đáng kể. So với enzyme bromelain, papain thể hiện hoạt tính xúc tác chậm hơn trong 30 phút đầu của quá trình thủy phân. Tuy nhiên, khoảng thời gian về sau, khả năng phân cắt tăng lên đáng kể thể hiện qua hiệu suất Tyrtp/Tyrt và OPA tăng lên rất nhanh. So với các protease có nguồn gốc động vật và vi sinh vật khác, papain có khả năng thủy phân sâu hơn, vì vậy nó đƣợc dùng để thủy phân tiếp các liên kết peptide còn lại sau khi đã thủy phân bằng trypsin và chymotrypsin (Lê Ngọc Tú et al., 2000; Trần Đình Toại và Trần Trung Hiếu, 2003; Nguyễn Đức Lƣợng et al., 2004). Điều này giải thích vì sau trong khoảng thời gian từ 90-240 phút hiệu suất Tyrtp/Tyrt và OPA tăng nhanh hơn so với enzyme bromelain và vẫn còn tiếp tục tăng đƣợc nữa.
Theo kết quả thống kê (phụ lục bảng B.12) về ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất Tyrtp/Tyrt ở tỷ lệ 1/2,5 cho thấy hiệu suất Tyrtp/Tyrt cao nhất đạt 29,186% và khác biệt so với các mốc còn lại ở mức ý nghĩa 5%. Tạ Hùng Cường (2014) cũng cho kết quả hiệu suất Tyrtp/Tyrt đạt cao nhất ở 240 phút ở tỷ lệ 1/0,272 (mg/g protein) từ thịt dè cá Tra đối với enzyme papain, tuy nhiên hiệu suất Tyrtp/Tyrt đạt 41,803% cao hơn so với kết quả nghiên cứu. Điều này do hoạt tính của enzyme đối với mỗi cơ chất khác nhau thì khác nhau, mỗi phần khác nhau trên cùng một loài cá cũng sẽ cho hiệu lực xúc tác của enzyme đối với cơ chất đó khác nhau. Kết quả được chứng minh bởi Nguyễn Thị Mỹ Hương et al., (2010) khi tiến hành thủy phân protein từ phụ phẩm cá ngừ vây vàng bằng enzyme protamex thu đƣợc độ thủy phân (degree of hydrolysis) của ba phần đầu, đuôi và nội tạng lần lƣợt là 32,3%; 22,2%
và 17% sau 12 giờ thủy phân.
Độ thủy phân biểu thị sự cắt đứt liên kết peptide trong quá trình thủy phân (Benjakul và Morrissey, 1997). Nó đƣợc xem nhƣ một thông số theo dõi khả năng thủy phân protein và là một nhân tố quan trọng liên quan trực tiếp đến hiệu suất của quá trình (Guerard, 2002). Do đó, hiệu suất Tyrtp/Tyrt cũng biểu thị mức độ phá vỡ liên kết peptide tại vị trí có tyrosine dưới tác dụng xúc tác của enzyme papain. Một nghiên cứu khác của Nguyễn Thị Mỹ Hương (2012) trên protein từ đầu cá ngừ vây vàng, độ thủy phân thu đƣợc sau 6 giờ thủy phân là 30,1% bằng enzyme protamex, trong khi hiệu suất Tyrtp/Tyrt của enzyme papain trên phụ phẩm cá Tra là 29,186%
sau 4 giờ thủy phân (240 phút). Abdulazzez et al., (2013) đã tiến hành thủy phân protein từ cá vua (Scomberomorus commerson) bằng enzyme papain ở các tỷ lệ enzyme/cơ chất tương ứng 1/100, 2/100, 4/200 (v/w) thu được độ thủy phân lần lượt là 22,2%; 23,6% và 24,7% sau 6 giờ thủy phân.
Kết quả thống kê (phụ lục bảng B.16) về ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất OPA cho thấy hiệu suất cao nhất ở 240 phút tương ứng 7,53% và khác biệt so với các mốc còn lại ở mức ý nghĩa 5%. Kết hợp với hiệu suất Tyrtp/Tyrt có thể kết luận
Khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng - Đại Học Cần Thơ 33 rằng enzyme papain ở tỷ lệ 1/2,5 cho hiệu suất thủy phân tăng theo thời gian phản ứng và đạt giá trị cao nhất ở 240 phút trong phạm vi của thí nghiệm.