4.2 ẢNH HƯỞNG CỦA ENZYME PAPAIN ĐẾN QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN
4.2.1 Xác định các tham số động học V max , K m của enzyme papain trên cơ chất là protein từ phụ phẩm cá Tra
Động học enzyme liên quan mật thiết đến tốc độ phản ứng theo thời gian; mối quan hệ giữa enzyme và nồng độ cơ chất; tốc độ phản ứng cực đại Vmax; hằng số tốc độ
Khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng - Đại Học Cần Thơ 27 phản ứng Km và ảnh hưởng của các yếu tố vật lý, hóa học đến quá trình xúc tác (Nguyễn Công Hà và Lê Nguyễn Đoan Duy, 2011). Do đó, cùng một enzyme sẽ cho động học khác nhau đối với mỗi cơ chất khác nhau. Chính vì thế cần phải khảo sát động học enzyme papain trên cơ chất protein từ phụ phẩm cá Tra để tìm đƣợc Vmax và Km. Từ vận tốc cực đại Vmax và hằng số tốc độ phản ứng Km đƣợc thể hiện bằng đồ thị Michaelis-Menten có thể ƣớc lƣợng đƣợc khoảng nồng độ cơ chất mà tại đó enzyme đạt vận tốc phản ứng tối ƣu. Kết quả khảo sát động học enzyme papain trên phụ phẩm cá Tra đƣợc thể hiện bằng đồ thị hình 4.1.
Hình 4.1: Đồ thị thể hiện phương trình động học Michaelis-Menten của enzyme papain trên cơ chất protein từ phụ phẩm cá Tra
Đồ thị trên cho thấy phản ứng xúc tác quá trình thủy phân protein từ phụ phẩm cá Tra của enzyme papain tuân theo phương trình động học Michaelis-Menten với độ tin cậy R2 = 0,994. Điều này phản ánh mối quan hệ giữa hàm lƣợng tyrosine sinh ra trên một đơn vị thời gian theo sự gia tăng nồng độ cơ chất. Hàm lƣợng tyrosine sinh ra tăng nhanh trong khoảng nồng độ cơ chất từ 0,017 – 0,174 g protein/10 ml, chậm dần ở giai đoạn từ 0,174 – 0,435 g protein/10 ml. Theo Nguyễn Công Hà và Lê Nguyễn Đoan Duy (2011), tốc độ phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ cơ chất khi nồng độ cơ chất ở mức thấp. Do đó, trong khoảng nồng độ cơ chất từ 0,017 – 0,174 g protein/10 ml vận tốc phản ứng gần nhƣ phụ thuộc tuyến tính với nồng độ protein, theo đó vận tốc tăng từ 0,028 – 0,181 μmol tyrosine/phút. Khi nồng độ cơ chất từ 0,174 – 0,435 g protein/10 ml vận tốc phản ứng có xu hướng ổn định, điều này được cho là tốc độ phản ứng enzyme không phụ thuộc vào nồng độ cơ chất khi nồng cơ chất cao (Nguyễn Công Hà và Lê Nguyễn Đoan Duy, 2011). Nhƣ vậy khi nồng độ cơ chất tăng tới một giá trị nào đó, tốc độ ổn định của phản ứng đạt tới một giá trị
Khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng - Đại Học Cần Thơ 28 nhất định, tốc độ ấy gọi là tốc độ cực đại Vmax của phản ứng (Trần Đình Toại và Nguyễn Thị Vân Hải, 2005). Cũng theo Nguyễn Công Hà và Lê Nguyễn Đoan Duy (2011), khi nồng độ cơ chất phản ứng cao, cơ hội cơ chất gặp enzyme nhiều thì tốc độ phản ứng tăng. Tuy nhiên sự liên hệ này chỉ giới hạn đến một nồng độ nhất định, nếu tiếp tục tăng nồng độ cơ chất sẽ ức chế ngƣợc lại hoạt động xúc tác của enzyme. Điều này giải thích vì sao khi tốc độ phản ứng đạt cực đại thì enzyme ở trạng thái bão hòa cơ chất và lúc này phản ứng không tăng đƣợc nữa.
Giá trị Vmax và Km của enzyme papain từ kết quả thực nghiệm và đƣợc xác định bằng phần mềm SAS 9.1.3 Portable tương ứng là 0,262 μmol tyrosine/phút và 0,101 g protein/10 ml. Giá trị Km của enzyme papain trên protein từ phụ phẩm cá Tra có phần cao hơn so với kết quả nghiên cứu của Tạ Hùng Cường (2014) khi tiến hành khảo sát động học enzyme papain trên cơ chất protein từ thịt dè cá Tra là 0,092 g protein/10 ml. Sự chênh lệch này không nhiều, hàm lƣợng lipid từ nguồn phụ phẩm cao hơn so với thịt dè vì phần phụ phẩm bao gồm cả phần mỡ bụng nơi chứa hàm lƣợng lipid rất cao. Mặt khác, hàm lƣợng protein từ phụ phẩm là 17,36% thấp hơn so với thịt dè là 18,1%. Chính hàm lƣợng lipid cao và protein có phần thấp hơn dẫn đến tương tác giữa enzyme và cơ chất bị hạn chế một phần. Điều này cũng giải thích vì sao giá trị Vmax của enzyme papain trên protein từ phụ phẩm thấp hơn so với thịt dố là 0,345 àmol tyrosine/phỳt theo nhƣ kết quả nghiờn cứu của Tạ Hựng Cường (2014).
Km không phụ thuộc nồng độ enzyme mà là đặc trƣng cho từng enzyme với mỗi cơ chất (Phạm Thị Trân Châu và Phan Tuấn Nghĩa, 2007). Km nhỏ chỉ ra rằng, enzyme cần một lƣợng nhỏ cơ chất để đạt đến trạng thái bão hòa và ngƣợc lại (Nguyễn Công Hà và Lê Nguyễn Đoan Duy, 2011). Tạ Hùng Cường (2014) chỉ ra rằng vận tốc phản ứng cực đại Vmax và hằng số tốc độ phản ứng Km của enzyme papain trên cơ chất casein và thịt dè cá Tra là rất khác nhau. Cụ thể, trên cơ chất casein độ nhạy của papain cao hơn nhiều biểu thị bằng giá trị Km là 0,022 g/10 ml so với 0,095 g protein/10 ml từ thịt dè. Vận tốc phản ứng sẽ nhanh chóng đạt cực đại ở nồng độ cơ chất thấp do hoạt tính xúc tác của enzyme papain không bị ảnh hưởng bởi các yếu tố khác có trong thành phần nguyên liệu nhƣ protein chuẩn casein. Điều này cũng đƣợc chứng minh bởi Corzo et al., (2012) khi tiến hành nghiên cứu điều kiện hoạt động tối ƣu của enzyme bromelain từ khóm trên 5 cơ chất khác nhau. Kết quả hằng số tốc độ phản ứng Km trên azoalbumin, azocasein, sodium caseinate, casein và haemoglobin lần lƣợt là 0,026; 0,037; 0,088; 0,138 và 0,165, nghiên cứu chỉ ra rằng enzyme bromelain cho độ nhạy cao đối với các cơ chất chuẩn. Trên cơ chất protein từ thịt dè và phụ phẩm, hoạt tính xúc tác của enzyme papain bị ảnh hưởng bởi các thành phần khác có trong nguyên liệu, điều này cần có những nghiên cứu sâu hơn.
Khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng - Đại Học Cần Thơ 29 Từ đồ thị Michaelis-Menten hình 4.1, giá trị Vmax, Km của enzyme papain trên cơ chất protein từ phụ phẩm cá Tra có thể ƣớc lƣợng đƣợc nồng độ mà enzyme cho phản ứng tối ưu đó là 0,435 g protein/10 ml tương ứng 2,5 g nguyên liệu phụ phẩm đem thủy phân. Kết quả này đƣợc chọn cho khảo sát thí nghiệm tiếp theo.