CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3 NỘI DUNG BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM
3.3.1 Thí nghiệm 1: Xác định các tham số động học của enzyme papain trên cơ chất protein từ phụ phẩm cá Tra.
Mục đích: xác định hai tham số động học Vmax và Km của enzyme papain, từ đó ƣớc lƣợng đƣợc khoảng nồng độ cơ chất cho phản ứng tối ƣu.
Bố trí thí nghiệm:
Thí nghiệm một nhân tố với 3 lần lặp lại.
Nhiệt độ (T) và pH tối ưu của enzyme papain đã được xác định tương ứng T = 55 oC và pH = 7,5.
Thời gian thủy phân: 30 phút.
Cố định lƣợng enzyme sử dụng là 1 mg. Khối lƣợng enzyme đƣợc tính toán khi pha với dung dịch đệm phosphate pH 7,5. Khi đó, bổ sung 0,5 ml dung dịch enzyme vào hỗn hợp thủy phân có đƣợc lƣợng enzyme nhƣ yêu cầu (1 mg).
Lƣợng cơ chất thay đổi: 0,1 g; 0,2 g; 0,5 g; 0,8 g; 1 g; 1,5 g; 2g; 2,5 g; 3 g.
Tổng số nghiệm thức: 9 × 1 = 9 nghiệm thức.
Tổng số đơn vị thí nghiệm: 9 × 3 = 24 đơn vị thí nghiệm.
Tiến hành thí nghiệm:
Nguyên liệu sau khi rã đông đƣợc cân đúng khối lƣợng nhƣ đã bố trí, sau đó trộn đều với 10 ml dung dịch đệm phosphate pH 7,5. Enzyme cũng đƣợc pha với nồng độ nhƣ đã nêu. Enzyme và cơ chất đều đƣợc ủ 30 phút trên bể điều nhiệt ở nhiệt độ 55 oC trước khi cho thủy phân. Sau 30 phút, hút 0,5 ml dung dịch enzyme cho vào các bình phản ứng và tiến hành thủy phân trong 30 phút. Hỗn hợp sau thủy phân đƣợc lọc qua giấy lọc, sau đó xác định hàm lƣợng tyrosine trong dịch thủy phân.
Chỉ tiêu theo dõi:
Đo hàm lượng tyrosine sinh ra trong dịch thủy phân theo phương pháp Anson, từ đó xác định hai tham số động học Vmax và Km bằng phần mềm SAS 9.1.3 Portable.
Khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng - Đại Học Cần Thơ 24 Khối lƣợng cơ chất đƣợc qui về nồng độ protein để vẽ đồ thị cũng nhƣ đánh giá đúng giá trị Km của enzyme papain trên cơ chất prrotein từ phụ phẩm cá Tra.
3.3.2 Thí nghiệm 2: xác định tỷ lệ enzyme/cơ chất (E/S) cho hiệu quả thủy phân tối ƣu
Mục đích: thông thường, trong một phản ứng thủy phân, người ta luôn mong muốn thủy phân đƣợc nhiều cơ chất nhất mà hiệu suất vẫn tối ƣu và lƣợng enzyme sử dụng phải đảm bảo tính kinh tế. Do đó, mục đích của thí nghiệm là khảo sát độ đặc hay độ nhớt tối ƣu để phản ứng thủy phân là có lợi nhất.
Bố trí thí nghiệm:
Thí nghiệm 1 nhân tố với 3 lần lặp lại.
Nhiệt độ và pH tối ƣu cho enzyme papain: T = 55 oC, pH = 7,5.
Thời gian thủy phân là 30 phút.
Tỷ lệ E/S thay đổi: sau khi có đƣợc kết quả tối ƣu từ thí nghiệm 1, tiến hành tăng nồng độ enzyme và cơ chất theo các hệ số 1; 1,5; 2; 2,5; 3. Cụ thể:
Nhân tố A: 1 mg/X g Nhân tố B: 1,5 mg/1,5X g Nhân tố C: 2 mg/2X g Nhân tố D: 2,5 mg/2,5X g Nhân tố E: 3 mg/3X g
Trong đó: X là lƣợng cơ chất (g) tối ƣu từ thí nghiệm 1.
Tiến hành thí nghiệm:
Nguyên liệu sau khi rã đông đƣợc cân đúng khối lƣợng nhƣ bố trí, sau đó trộn đều với 10 ml dung dịch đệm phosphate pH 7,5. Khối lƣợng enzyme đƣợc tính toán khi pha với dung dịch đệm để khi hút 0,5 ml cho vào hỗn hợp thủy phân có đƣợc lƣợng enzyme mong muốn. Enzyme và cơ chất đều được ủ 30 phút ở 55 oC trước khi thủy phân. Sau thời gian ủ, tiến hành thủy phân trong 30 phút, hỗn hợp sau thủy phân đƣợc lọc qua giấy lọc và đem đo đạt các chỉ tiêu.
Chỉ tiêu theo dõi:
Đo hàm lượng tyrosine sinh ra theo phương pháp Anson từ đó xác định hiệu suất Tyrtp/Tyrt
Xác định hàm lượng đam amin sinh ra theo phương pháp OPA.
3.3.3 Thí nghiệm 3: Xác định thời gian thủy phân tối ƣu cho tỷ lệ E/S thích hợp nhất
Mục đích: xác định thời gian thủy phân tốt nhất cho tỷ lệ E/S tối ƣu từ thí nghiệm 2 Bố trí thí nghiệm:
Khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng - Đại Học Cần Thơ 25 Thí nghiệm 1 nhân tố với 3 lần lặp lại.
Nhiệt độ, pH tối ƣu cho enzyme papain: T = 55 oC, pH = 7,5.
Tỷ lệ E/S tối ƣu đƣợc chọn từ thí nghiệm 2 để khảo sát.
Thời gian thủy phân thay đổi: 30 phút, 60 phút, 90 phút, 120 phút, 180 phút và 240 phút.
Tiến hành thí nghiệm:
Cân đúng khối lƣợng cơ chất đã chọn ở thí nghiệm 2 trộn đều với 10 ml dung dịch đệm phosphate pH 7,5. Enzyme đƣợc tính toán và pha trong dung dịch đệm pH 7,5 để khi hút 0,5 ml dung dịch enzyme có đƣợc lƣợng enzyme mong muốn. Enzyme và cơ chất đều được ủ 30 phút ở 55 oC trước thủy phân. Thời gian khảo sát cho các nghiệm thức thay đổi từ 30-90 phút. Hỗn hợp sau thủy phân đƣợc lọc qua giấy lọc và đem đo đạc các chỉ tiêu.
Chỉ tiêu theo dõi:
Đo hàm lương tyrosine sinh ra trong dịch thủy phân từ đó tính hiệu suất Tyrtp/Tyrt ở các mốc thời gian khảo sát.
Đo hàm lượng đạm amin sinh ra theo phương pháp OPA ở các mốc thời gian khảo sát.
Khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng - Đại Học Cần Thơ 26 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN