Phát triển chế phẩm vi sinh vật probiotic kháng kháng sinh cho gà

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI    NGUYỄN NGỌC KIÊN PHÁT TRIỂN CHẾ PHẨM VI SINH VẬT PROBIOTIC KHÁNG KHÁNG SINH CHO GÀ LUẬN VĂN THẠC SĨ HÀ NỘI, 2013 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp ii BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI    NGUYỄN NGỌC KIÊN PHÁT TRIỂN CHẾ PHẨM VI SINH VẬT PROBIOTIC KHÁNG KHÁNG SINH CHO GÀ CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mà SỐ : 60.42.02.01 GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN : TS. ðẶNG XUÂN NGHIÊM HÀ NỘI, 2013 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp i LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa từng ñược ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin cam ñoan rằng, mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn ñã ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn này ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc. Tác giả Nguyễn Ngọc Kiên Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp ii LỜI CẢM ƠN ðể hoàn thành luận văn thạc sỹ của mình, ngoài sự nỗ lực của bản thân, tôi ñã nhận ñược rất nhiều sự quan tâm, giúp ñỡ tận tình của Nhà trường, các thầy cô giáo, gia ñình và các bạn ñồng nghiệp. Trước tiên tôi xin bày tỏ lòng kính trọng, biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới TS. ðặng Xuân Nghiêm ñã tận tình hướng dẫn và giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình học tập cũng như nghiên cứu. Tôi xin cảm ơn TS. Nguyễn Văn Giang và tất cả cán bộ phòng thí nghiệm bộ môn Công nghệ vi sinh, Khoa Công nghệ sinh học ñã tận tình chỉ bảo và tạo mọi ñiều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực tập. Qua ñây tôi cũng xin gửi lời cảm ơn ñến toàn thể các Phòng, Ban của khoa Công nghệ sinh học và toàn thể bạn bè, ñồng nghiệp cùng gia ñình và những người thân ñã giúp ñỡ, ñộng viên và tạo mọi ñiều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn này. TÔI XIN CHÂN THÀNH CẢM ƠN! Hà nội, ngày 15 tháng 9 năm 2013 Học viên Nguyễn Ngọc Kiên Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp iii MỤC LỤC Lời cam ñoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục bảng vi Danh mục hình vii Danh mục hình vii Danh mục các từ viết tắt viii CHƯƠNG 1: MỞ ðẦU 1 1.1. ðặt vấn ñề 1 1.2. Mục tiêu của ñề tài 2 CHƯƠNG 2 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1. Giới thiệu về probiotic 3 2.1.1. Lịch sử nghiên cứu về probiotic 3 2.1.2. Hệ VSV ñường ruột và tác ñộng của chúng ñến sức khỏe vật nuôi 5 2.1.3. ðịnh nghĩa và cơ chế tác ñộng của của vi sinh vật probiotic 7 2.1.4. Các ñặc tính probiotic của vi sinh vật 9 2.1.5. Yêu cầu an toàn ñối với các chủng vi sinh vật probiotic 11 2.2. Ảnh hưởng của probiotic ñối với gia cầm 12 2.2.1. Ảnh hưởng của Probiotic ñến sự tăng trưởng 12 2.2.2. Tác ñộng ñến hệ vi sinh vật ñường ruột 13 2.2.3. Ảnh hưởng ñến khả năng ñáp ứng miễn dịch 14 2.2.4. Ảnh hưởng ñến chất lượng thịt 14 2.3. Công thức chế phẩm probiotic 15 2.4. Tình hình nghiên cứu và sử dụng chế phẩm probiotic trên thế giới và ở Việt Nam 15 2.4.1. Tình hình nghiên cứu sản xuất và sử dụng các chế phẩm probiotic trên thế giới 15 2.4.2.Tình hình nghiên cứu sản xuất và sử dụng các chế phẩm probiotic ở Việt Nam 18 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp iv CHƯƠNG 3 : VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 3.1. Vật liệu nghiên cứu 21 3.1.1. ðịa ñiểm và thời gian nghiên cứu 21 3.1.2. Chủng vi sinh vật 21 3.1.3. Gà Lương Phượng: 21 3.1.4. Hóa chất và thiết bị sử dụng 21 3.1.5. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật 23 3.2. Nội dung nghiên cứu 24 3.2.1. Phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật có ñặc tính probiotic 24 3.2.2. Thử nghiệm vai trò của các vi sinh vật probiotic ñến khả năng sinh trưởng, hiệu quả sử dụng thức ăn trên gà Lương Phượng giai ñoạn 0 – 60 ngày tuổi 24 3.2.3. Thử nghiệm và ñánh giá vai trò của các vi sinh vật probiotic trong việc loại trừ các vi sinh gây bệnh ở gà Lương Phượng 24 3.3. Phương pháp nghiên cứu 25 3.3.1. Phương pháp phân lập vi sinh vật từ chế phẩm probiotic 25 3.3.2. Phương pháp ñịnh danh VSV probiotic, xác ñịnh ñặc ñiểm hình thái, sinh lý, sinh hoá của các chủng VSV probiotic 25 3.3.4. ðánh giá các ñặc tính probiotic 26 3.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp VSV probiotic ñến gà 30 3.4.1. ðánh giá ảnh hưởng của việc sử dụng vi sinh vật probiotic ñến tốc ñộ sinh trưởng, tăng trọng và tiêu tốn thức ăn của gà Lương Phượng 31 3.4.2. Ảnh hưởng của việc sử dụng vi sinh vật probiotic ñến khả năng loại bỏ các VSV gây bệnh , khả năng tồn tại của VSV probiotic trong ñường tiêu hóa trên gà Lương Phượng 32 3.4.3. Phương pháp xử lý số liệu 33 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 4.1. Phân lập các chủng vi sinh vật 34 4.1.1. Phân lập các chủng vi khuẩn probiotic từ các chế phẩm men tiêu hóa 34 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp v 4.1.2. Phân lập các chủng nấm men ñịnh hướng sử dụng cho gia cầm 35 4.2. ðặc ñiểm, ñịnh danh các chủng VSV probiotic 35 4.3 . Kiểm ñịnh các ñặc tính probiotic của các chủng VSV tuyển chọn 37 4.3.1. Kiểm ñịnh khả năng chịu pH thấp 37 4.3.2. ðánh giá khả năng chịu muối mật 40 4.3.3. ðánh giá khả năng kháng kháng sinh 41 4.3.4. Kiểm ñịnh khả năng ñối kháng các vi khuẩn gây bệnh 43 4.3.5. Nghiên cứu khả năng bám dính in vitro 45 4.4. Thử nghiệm hiệu lực của vi sinh vật probiotic trên gà Lương Phượng 48 4.4.1. Ảnh hưởng của việc bổ sung vi sinh vật probiotic ñến tốc ñộ sinh trưởng và hiệu suất sử dụng thức ăn của gà lương Phượng: 48 4.4.2. Ảnh hưởng của việc bổ sung vi sinh vật probiotic ñến việc loại trừ các vi 58 CHƯƠNG 5 : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 63 5.1. Kết luận 63 5.2. Kiến nghị 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO 64 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp vi DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Tóm tắt cơ chế tác ñộng chủ yếu của các chủng probiotic lên vật chủ Jans (2005) 15 Bảng 3.1: Hoá chất sử dụng 22 Bảng 3.2: Máy móc và thiết bị dùng trong ñề tài 22 Bảng 3.3. Nồng ñộ kháng sinh sử dụng trong thí nghiệm 27 Bảng 3.4. Khẩu phần thức ăn cơ sở (TĂCS) sử dụng nuôi gà thí nghiệm 30 Bảng 4.1. Chế phẩm men tiêu hóa (probiotic) sử dụng trong ñề tài 34 Bảng 4.2. ðặc ñiểm khuẩn lạc, hình thái tế bào của các chủng VSV 35 Bảng 4.3. ðịnh danh các chủng vi khuẩn ñã tuyển chọn 37 Bảng 4.4. Khả năng sống sót của VSV probiotic trong ñiều kiện pH thấp 38 Bảng 4.5. Bố trí các ô với các nồng ñộ pH khác nhau (cho ñĩa 1 với 2 chủng VSV probiotic là BLT7 và LTM8 và ñĩa 2 với 2 chủng VSV gây bệnh E. coli và Staphylococcus aureus) 39 Bảng 4.6. Khả năng kháng kháng sinh của các chủng VSV probiotic 42 Bảng 4.7. Khối lượng cơ thể gà qua các tuần tuổi 49 Bảng 4.8. Tốc ñộ sinh trưởng tuyệt ñối ( A) của ñàn gà thí nghiệm ( g/con/ngày) 52 Bảng 4.9.Tốc ñộ sinh trưởng tương ñối của ñàn gà thí nghiệm (R %) 53 Bảng 4.10. Lượng thức ăn thu nhận của ñàn gà thí nghiệm (g/con/ngày) 54 Bảng 4.11. Hiệu quá sử dụng thức ăn của ñàn gà thí nghiệm.( kg TA/ kgTT) 56 Bảng 4.12. Chi phí thức ăn cho 1 kg tăng trọng (ñồng ) (2012) 57 Bảng 4.13. Lượng vi khẩn E.coli kháng ampicilin phân lập từ phân gà (CFU/g) 59 Bảng 4.14. Lượng VK Staphylococcus kháng ampicilin phân lập từ phân gà (CFU/g) 60 Bảng 4.15. Lượng vi khuẩn Bacillus kháng ampicilin phân lập từ phân gà (CFU/g) 61 Bảng 4.16. Lượng nấm men kháng ampicilin phân lập từ phân gà (CFU/g) 62 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp vii DANH MỤC HÌNH Hình 2.1. Cơ chế tác ñộng của probiotic (Steiner, 2006) 8 Hình 3.1. Cấu tạo giải phẫu ruột gà 29 Hình 4.1. Hình ảnh khuẩn lạc của các chủng VSV probiotic 36 Hình 4.2. Hình ảnh tế bào của các chủng VSV ñược phân lập và tuyển chọn 36 Hình 4.3. Khả năng chịu pH thấp của 2 chủng vi khuẩn probiotic so với ñối chứng E. coli và Staphylococcus aureus (ñĩa 1 là chủng BLT7 và LTM8, ñĩa 2 là ñối chứng vi khuẩn gây bệnh với các nồng ñộ pH) 38 Hình 4.4. Khả năng chịu mật lợn của các chủng VSV probiotic 40 Hình 4.5 Hình ảnh khả năng kháng kháng sinh của các chủng nấm men (lần lượt các ñĩa A, B, C bổ sung kháng sinh streptomycin, gentamycin và chloramphenicol) 42 Hình 4.6.Khả năng ñối kháng các VK gây bệnh của các chủng VSV probiotic 44 Hình 4.7 Hình ảnh khả năng ñối kháng của các chủng VSV kiểm ñịnh (lần lượt các ñĩa A, B, C là các chủng VSV CLS3, BL6, LTM8, BLP9, EG11 và BLP12 trên các ñĩa vi khuẩn gây bệnh S. aureus E. coli và Samonella) 44 Hình 4.8. Hình ảnh sự bám dính của các chủng VSV với tế bào biểu mô ruột ( Lần lượt các hình 1,2 là các chủng EG11 BLP12 và hình 3,4,5 là chủng SCBG1 ñược nhuộm Gram) 46 Hình 4.9. Hoạt tính enzyme ngoại bào của 12 chủng vi khuẩn ñã phân lập 47 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp viii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT B. subtilis : Bacillus subtilis CFU : Colony-Forming Unit CV : Coefficient of Variation DNA : Deoxyribo Nucleic Acid ðC : ðối chứng EU : European Union E.coli : Escherichia coli FAO : Food and Agriculture Organization GMO : Genetically Modified Organism GMP : Good Manufacturing Practices HQSDTA : Hiệu quả sử dụng thức ăn L. acidophilus : Lactobacillus acidophilus LB : Luria-Bertani MRS : DE MAN, ROGOSA, SHARPE RNA : Ribonucleic Acid OD : Optical density PBS : Phosphate buffered saline SCAN : Scientific Committee on Animal Nutrition S. cerevisiae : Saccharomyces cerevisiae SE : Standard error Spp./Sp. : Species TĂCS : Thức ăn cơ sở TT : Tăng trọng TA : Thức ăn VK : Vi khuẩn VSV : Vi sinh vật WHO : World Health Organization YPD : Yeast Peptone Dextrose [...]... : Phát tri n ch ph m vi sinh v t probiotic kháng kháng sinh cho gà 1.2 M c tiêu c a ñ tài a Phân l p và tuy n ch n các ch ng vi sinh v t có ñ c tính probiotic thu c các chi Lactobacillus, Bacillus và n m men Saccharomyces cerevisiae và tuy n ch n các ch ng có kh năng kháng kháng sinh b ðánh giá ñư c nh hư ng c a VSV probiotic kháng kháng sinh ñ i v i s tăng trư ng, hi u qu s d ng th c ăn trên gà. .. ng ñ i v i các ch ng vi sinh v t probiotic kháng kháng sinh Kh năng kháng kháng sinh giúp các sinh v t này t n t i trong các ñi u ki n môi trư ng chăn nuôi có b sung các lo i kháng sinh Nh ñó chúng v n có th ti p t c t n t i và phát tri n Kh năng kháng các lo i kháng sinh còn giúp v t ch gi m tác ñ ng không mong mu n c a các lo i kháng sinh mang l i Các lo i kháng sinh ph bi n như : ampicillin, gentamycin…... 3.2.1 Phân l p và tuy n ch n các ch ng vi sinh v t có ñ c tính probiotic 3.2.2 Th nghi m vai trò c a các vi sinh v t probiotic ñ n kh năng sinh trư ng, hi u qu s d ng th c ăn trên gà Lương Phư ng giai ño n 0 – 60 ngày tu i 3.2.3 Th nghi m và ñánh giá vai trò c a các vi sinh v t probiotic trong vi c lo i tr các vi sinh gây b nh gà Lương Phư ng H c vi n Nông nghi p Vi t Nam – Lu n văn th c s Khoa h c Nông... làm gi m ch t lư ng th t gà Nghiêm tr ng hơn sau th i gian dài s d ng t n dư kháng sinh trong th t gà r t cao ði u ñáng ng i là n u ăn ph i gà có dư lư ng kháng sinh nói chung và cloramphenicol nói riêng thì s có nguy cơ xu t hi n vi khu n kháng kháng sinh ngư i Trong dinh dư ng ñ ng v t, vi c tăng cư ng s c kho h th ng tiêu hoá c a v t nuôi thông qua nh ng tác ñ ng t i h vi sinh v t (VSV) ñư ng ru... gà Lương Phư ng giai ño n 0 – 60 ngày tu i c ðánh giá ñư c nh hư ng c a VSV probiotic kháng kháng sinh ñ n kh năng lo i tr các VSV gây b nh và kh năng ñáp ng mi n d ch trên gà Lương Phư ng H c vi n Nông nghi p Vi t Nam – Lu n văn th c s Khoa h c Nông nghi p 2 CHƯƠNG 2 : T NG QUAN TÀI LI U 2.1.Gi i thi u v probiotic 2.1.1 L ch s nghiên c u v probiotic Vi c s d ng vi sinh v t (VSV) s ng nh m tăng cư ng... kháng kháng sinh ñang ngày càng gia tăng trong nhi u loài vi khu n gây b nh cho ngư i và gia súc ñang là m i quan tâm lo l ng c a toàn xã h i Kháng v i kháng sinh ñư c phân lo i g m kháng t nhiên (instrinsic resistance) và kháng thu nh n (acquired resistance) ð vư t qua nh ng thách th c ñó, ñã có r t nhi u nh ng nghiên c u nh m tìm ra tác nhân ñ thay th kháng sinh nhưng an toàn v i v t nuôi Probiotic. .. 2005) 2.1.3 ð nh nghĩa và cơ ch tác ñ ng c a c a vi sinh v t probiotic 2.1.3.1 ð nh nghĩa probiotic ð nh nghĩa v probiotics ñã ñư c phát tri n nhi u theo th i gian Theo ngôn ng Hy L p, probiotic có nghĩa là “vì s s ng” Lilly và Stillwell (1965) ñã mô t probiotics như m t h n h p ñư c t o thành b i sinh v t thúc ñ y s phát tri n c a sinh v t khác Thu t ng probiotic ñư c Parker ñ ngh s d ng l n ñ u tiên... con ngư i cũng như v t nuôi Probiotic ñã cung c p ti m năng to l n ñ tr thành m t ch ph m thay th cho thu c kháng sinh. ði u này cho th y r ng probiotic có th ñư c s d ng thành công như các công c dinh dư ng gây b nh, c i thi n h mi n d ch và tăng ch t lư ng th t gia c m (Kabir và cs., 2005) Do v y, vi c nghiên c u ñ phát tri n và ng d ng các ch ng probiotic kháng kháng sinhtrong chăn nuôi là m t v... ñã cho th y probiotic có kh năng kích thích kh năng ñáp ng mi n d ch c a gà Kabir và cs (2004) ñánh giá tác ñ ng d ch c a gà th t và h cho r ng vi c s d ng probiotic c a probiotic v ñáp ng mi n có kh năng t o ra kháng th cao hơn các loài gia c m th c nghi m so v i ñ i ch ng Khaksefidi và Ghoorchi (2006) báo cáo r ng kháng th trong nhóm b sung probiotic v i lư ng 50mg/ kg là cao hơn sau 5 và 10 ngày... nghiên c u nhi u hơn n a ñ ngày càng nâng cao ñư c hi u qu , tính an toàn Nó ñư c xem là m t chi n lư c phát tri n b n v ng và an toàn Tuy nhiên, ñ có ñư c m t ch ph m probiotic th a mãn t t c nh ng yêu c u ñ t ra và có th ñư c s d ng c khi gà ph i u ng kháng sinh ñ ñi u tr b nh thì vi c nghiên c u ñ c ñi m c a ch ng VSV probiotic kháng kháng sinh ng d ng trong s n xu t ch ph m probiotic là r t quan tr . NGUYỄN NGỌC KIÊN PHÁT TRIỂN CHẾ PHẨM VI SINH VẬT PROBIOTIC KHÁNG KHÁNG SINH CHO GÀ CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mà SỐ : 60.42.02.01 GIÁO VI N HƯỚNG DẪN : TS. ðẶNG. NGUYỄN NGỌC KIÊN PHÁT TRIỂN CHẾ PHẨM VI SINH VẬT PROBIOTIC KHÁNG KHÁNG SINH CHO GÀ LUẬN VĂN THẠC SĨ HÀ NỘI, 2013 Học vi n Nông nghiệp Vi t Nam – Luận văn thạc. 2.1.4.3. Khả năng kháng các loại kháng sinh ðây là ñặc tính vô cùng quan trọng ñối với các chủng vi sinh vật probiotic kháng kháng sinh. Khả năng kháng kháng sinh giúp các sinh vật này tồn tại