3.3.4.1. đánh giá khả năng chịu pH thấp
Khả năng sống sót của vi khuẩn khi nuôi ủ với acid HCl ở pH khác nhau ựược kiểm tra băng dụng phương pháp cải tiến. Chủng vi khuẩn probiotic ựược nuôi lắc lỏng (220 vòng/phút, 30oC, 24h). Dịch nuôi các chủng vi khuẩn ựược lấy cùng thể tắch ựược ly tâm 2000 vòng/phút ựể thu tế bào vi khuẩn. Rửa tế bào với nước cất vô trùng bằng cách thêm nước cất vô trùng và ly tâm thu cặn. Cặn là tế bào vi khuẩn ựược ủ với acid HCl. Các chủng probiotic ựược tiến hành ựánh giá khả năng chịu pH thấp trong thắ nghiệm này với acid HCl pH thử nghiệm là 2.5, 2, 1.8, 1.5, 1.3, 1, 0.7, 0.3. Mẫu ựối chứng là mẫu vi khuẩn ựược tái huyền phù với nước cất vô trùng.
Sau 12 tiếng ủ với acid HCl, dịch nuôi ủ của vi khuẩn ựược cấy quệt trên môi trường LB agar ựể kiểm tra khả năng sống sót. Ở phương pháp truyền thống vi khuẩn ựược cấy trải trên ựĩa thạch LB agar, so sánh với ựĩa ựối chứng về các chỉ tiêu số lượng, kắch thước khuẩn lạc.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 27
Dựa vào khả năng mọc ựược của các chủng VSV trên môi trường có các nồng ựộ pH khác nhau ựể ựánh giá. Các chủng VSV mọc ựược trên môi trường có pH ≤ 2 ựược sử dụng ựể tiến hành ựánh giá các ựặc tắnh probiotic tiếp theo.
3.3.4.2. đánh giá khả năng chịu muối mật
Các chủng VSV sau khi ựược nuôi lỏng lắc 220 vòng/phút ở 37oC sau 24h ựến 36h ựược thu vào ống eppendolf (1.5 ml) và ựược tiến hành thắ nghiệm như sau: Ly tâm 1500 vòng/phút trong 5 phút, thu phần tủa tế bào. Bổ sung 1 ml nước cất vô trùng, ly tâm 1500 vòng/phút trong 5 phút và thu phần tủa tế bào. Tái huyền phù tế bào trong mỗi ống eppendolf trong dịch mật lợn và mật gà không pha loãng . Ủ ở nhiệt ựộ 37oC trong 12h tiến hành cấy quệt trên môi trường LB agar kiểm tra khả năng sống sót và so sánh tốc ựộ mọc với VK ựối chứng không ủ với muối mật.
3.3.4.3. đánh giá khả năng kháng các loại kháng sinh
Các chủng vi khuẩn ựược cấy quệt vào các ô trên các ựĩa môi trường LB agar có bổ sung kháng sinh ựể kiểm tra khả năng sống sót. Các bình chứa môi trường ựược ựể nguội, nhiệt ựộ bình chứa môi trường là 40 Ờ 45oC thì bổ sung các loại kháng sinh. Bao gồm: ampicillin, penicillin, kanamycin, chloramphenicol, gentamycin, tetracycline. Bổ sung kháng sinh với nồng ựộ trong bảng 3.3. Trên mỗi ựĩa có bổ sung kháng sinh, các vi khuẩn probiotic ựược cấy quệt ựể ựánh giá khả năng kháng kháng sinh. Nồng ựộ kháng sinh sử dụng ựược trình bày ở bảng 3.3
Bảng 3.3. Nồng ựộ kháng sinh sử dụng trong thắ nghiệm
Kháng sinh Nồng ựộ gốc Nồng ựộ sử dụng Ampicillin 50 mg/ml 50 ộg/ml Penicillin 50 mg/ml 50 ộg/ml Chloramphenicol 35 mg/ml 35 ộg/ml Gentamycin 10 mg/ml 10 ộg/ml Kanamycin 50 mg/ml 50 ộg/ml Streptomycin 100 mg/ml 100 ộg/ml
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 28
3.3.4.4. đánh giá khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh
Phương pháp khuếch tán ựĩa giấy ựược sử dụng ựể ựánh giá khả năng ựối kháng vi khuẩn gây bệnh của các chủng vi khuẩn probiotic. 03 chủng vi khuẩn gây bệnh ựường ruột thông thường ựược sử dụng ựể trong thắ nghiệm bao gồm: E. coli, Samonella typhimurium, Staphylococcus aureus. 12 chủng vi khuẩn probiotic, 2 chủng nấm men và 3 chủng vi khuẩn gây bệnh ựường ruột thông thường ựược nuôi lỏng lắc 220 vòng/phút, 37oC trong 24h ựến 36h ựến khi vi khuẩn bước vào pha cân bằng. Các bước thực hiện: Cấy trải vi khuẩn gây bệnh lên ựĩa thạch LB agar. đặt các mẩu giấy lọc vô trùng 6 Ờ 9 mẩu/ựĩa. Nhỏ 10 ộl dịch mỗi vi khuẩn probiotic lên mỗi mẩu giấy lọc ựã ựặt. Nuôi ủ 370C trong 24h ựến 48h. Khả năng ựối kháng ựược tắnh bằng kắch thước tán VSV kiểm ựịnh mọc quanh mẩu giấy lọc và vòng vô khuẩn bao quanh nếu có
Hoạt tắnh kháng kháng khuẩn ựược tắnh bằng: D Ờ d Trong ựó: D: ựường kắnh vòng vô khuẩn (mm) d: ựường kắnh mẫu giấy (mm), d = 6 mm
3.3.4.5. đánh giá khả năng bám dắnh in vitro
Thắ nghiệm ựược tiến hành theo phương pháp bám dắnh in vitro (Annika và cs, 1983), tiến hành thắ nghiệm như sau:
- Chuẩn bị vi khuẩn: vi khuẩn ựược cấy chuyển ắt nhất 3 lần trước khi thực hiện thắ nghiệm này (Fuller , 1978), vi khuẩn nuôi lỏng qua ựêm ựược ly tâm và huyền phù trong PBS, pha loãng vi khuẩn ựến nồng ựộ 1 Ờ 5 ừ108 cfu/ml.
- Chuẩn bị tế bào biểu mô: ựoạn ruột ileum, caeca ựược cắt dọc và ngâm trong dung dịch PBS 40C 30 phút. Sau ựó rửa lại 3 lần với dung dịch PBS. Dùng dao mổ cạo nhẹ biểu mô ruột ựể thu ựược tế bào biểu mô. Tế bào biểu mô ựược huyền phù trong PBS.
- Tiến hành thắ nghiệm kiểm tra khả năng bám dắnh của các chủng vi khuẩn probiotic: 1 ml dịch tế bào vi khuẩn trộn với 1 ml dịch tế bào biểu mô ủ 370C trong 30 phút. Dịch ngâm ủ ựược làm tiêu bản và nhuộm Gram sau ựó ựược soi dưới kắnh hiển vi ựộ phóng ựại 1000 ựể kiểm tra sự bám dắnh của VSV với tế bào biểu mô ruột.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 29
Hình 3.1. Cấu tạo giải phẫu ruột gà Chú thắch
Cloaca: lỗ huyệt Colon: ruột kết
Gizzard: cổ họng Crop: diều
Proventriculus: dạ dày tuyến Gall bladder: túi mật
Pancreas: lá lách Duodenum: tá tràng
Jejunum: ruột chay Ileum: hồi tràng
Oesophagus: thực quản MeckelỖs diverticulum: ruột thừa
Liver: gan Caeca: ruột tịt
Kidneys: thận
Chủng VSV ựược coi là có khả năng bám dắnh khi xuất hiện trong tiêu bản của tế bào biểu mô ruột và ngược lại
3.3.4.6. đánh giá khả năng sản sinh enzyme ngoại bào (áp dụng cho vi khuẩn)
Các chủng vi khuẩn probiotic phân lập ựược ựã ựược nuôi lắc trong các ống nghiệm chứa 5 ml môi trường LB lỏng (220 vòng/phút, 37oC) trong 48 giờ. Dịch nuôi cấy ựược thu vào các ống eppendolf. Sau ựó các ống eppendolf chứa dịch vi khuẩn ựược ly tâm lạnh 7000 vòng/phút 40C. Tế bào vi khuẩn bị lực ly tâm phá hủy cấu trúc tế bào phân tách dịch chứa enzyme tổng số và các thành phần tế bào. Phần dịch chứa enzyme ngoại bào ựược thu và bảo quản ở 40C. Phương pháp khuếch tán ựĩa thạch ựược sử dụng ựể kiểm ựịnh khả năng sản sinh enzyme ngoại bào. Sử dụng ựệm phosphate pha môi trường chứa các cơ chất (1%) ựể xác ựịnh sự có mặt của một số enzyme ngoại bào thông thường như: amylase, celullase và protease. Các cơ
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 30
chất ựược sử dụng tương ứng là tinh bột, cellulose và gelatin. Trên mỗi ựĩa thạch môi trường chứa cơ chất, sử dụng ống sắt hình trụ ựường kắnh 9 mm ựục các lỗ thạch. Sau ựó dịch chứa enzyme ngoại bào của mỗi chủng vi khuẩn probiotic ựược nhỏ và các lỗ thạch. đo vòng phân giải D-d (mm), D là ựường kắnh vòng ngoài, d là ựường kắnh lỗ nhỏ dịch.