NGHIÊN cứu TRÍCH LY POLYPHENOL từ TRÀ camellia sinensis (l )

Các sản phẩm polyphenol từ trà có giá trị thương mại cao và được sản xuất với quy mô công nghiệp tại các nước có vùng trồng trà tập trung lớn như Trung Quốc, Nhật Bản, Ấn Độ… Việt Nam là

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ và tên học viên : NGUYỄN HẢI HÀ

Ngày tháng năm sinh: 28/10/1981

Nơi sinh : Thanh Hoá

Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ HỮU CƠ MSHV : 00504105

I.TÊN ĐỀ TÀI

Nghiên cứu trích ly polyphenol từ trà

II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG

ƒ Khảo sát các phương pháp so màu dùng để đánh giá hàm lượng polyphenol tổng trong dịch trích trà

ƒ Khảo sát phương pháp xử lý ức chế enzyme có sử dụng vi sóng

ƒ Đánh giá lựa chọn giống trà nguyên liệu cho quá trình trích ly

ƒ Khảo sát quá trình trích ly polyphenol từ trà bằng phương pháp có hỗ trợ vi sóng

ƒ Tinh chế sơ bộ dịch trích, tạo chế phẩm dạng bột

ƒ Khảo sát một số tính chất về thành phần, hoạt tính kháng oxy hóa, kháng khuẩn của sản phẩm

III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ:

IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ:

V HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS PHẠM THÀNH QUÂN

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN BỘ MÔN QUẢN LÝ CHUYÊN NGÀNH

Nội dung và đề cương luận văn thạc sĩ đã được Hội Đồng Chuyên Ngành thông qua

Ngày tháng năm 2006

PHÒNG ĐÀO TẠO SAU ĐẠI HỌC KHOA QUẢN LÝ NGÀNH

Lời cảm ơn

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS Phạm Thành Quân, thầy hướng dẫn đã cho tôi ý tưởng, động lực và giúp đỡ tận tình trong nghiên cứu, xin cảm ơn các thầy cô trong hội đồng bảo vệ đã có những nhận xét quý báu cho các kết quả Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến chị Trương Ngọc Tuyền về những hỗ trợ nhiệt tình trong quá trình làm thí nghiệm, anh Huỳnh Văn Tiến về kết quả phân tích HPLC, chị Đặng Thị Thanh Bình với những ý kiến đóng góp và giúp tôi sửa chữa trong giai đoạn viết bài, và đến các thầy cô, anh chị trong bộ môn CN Hữu

cơ, đã hết lòng ủng hộ và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm luận văn

Xin cảm ơn các bạn sinh viên đã cùng tôi thực hiện đề tài

Cảm ơn gia đình, bạn bè đã động viên hỗ trợ tôi hoàn thành luận văn

Các kết quả đạt được từ thực nghiệm như sau:

1 Đánh giá bố phương pháp phân tích so màu, qua đó đề xuất sử dụng phương pháp Folin-ciocalteu cho quá trình phân tích hàm lượng polyphenol tổng trong dịch trích

2 Xác định điều kiện thực hiện bằng vi sóng quá trình ức chế enzyme polyphenol oxidase của lá trà trước trích ly

3 Khảo sát 5 giống trà tại vùng trà Bảo Lộc, Lâm Đồng và lựa chọn giống trà HAT có hàm lượng EGCG và catechin tổng cao làm nguyên liệu trích ly

4 Xác định các thông số cho quy trình trích ly polyphenol từ lá trà bằng phương pháp trích ly có hỗ trợ vi sóng quy mô phòng thí nghiệm

5 Thăm dò tinh chế sơ bộ dịch trích, tạo sản phẩm dạng bột có hàm lượng EGCG 35%, catechin tổng 70%, polyphenol tổng 95%

6 Khảo sát một số tính chất kháng oxy hóa, kháng khuẩn của sản phẩm Kết quả cho thấy sản phẩm có hoạt tính kháng oxy hóa mạnh hơn so với các chất đối chứng (vitamin C, trolox), có tiềm năng để nghiên cứu ứng dụng

The results were shown as below:

1 Four quantitative spectrometric methods were investigated and ciocalteu method was employed to monitor polyphenols content in the extract

Folin-2 A procedure for inactivating polyphenols oxidase enzyme in domestic microwave oven was established

3 HAT tea resource, with the highest amount of EGCG and total catechins, was selected as suitable material for extraction

4 Parameters were investigated for microwave-assisted extraction method

5 A simple solvent-based procedure was used to purify the extract

6 Antioxidant and antibacterial activities of polyphenols product were studied and compared with standard antioxidants Polyphenols product demonstrated

a strong antioxidant activity but weak antibacterial activity in experiments

 

MỤC LỤC TÓM TẮT I ABSTRACT II MỤC LỤC III DANH SÁCH CÁC HÌNH - SƠ ĐỒ - BẢNG – ĐỒ THỊ VI DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT X DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT X

MỞ ĐẦU XI

1 TỔNG QUAN 1

1.1 Giới thiệu chung về trà 1

1.1.1 Sinh thái học của trà 1

1.1.2 Phân bố trà 2

1.1.3 Thành phần hóa học của lá trà 3

1.2 Nhóm hợp chất catechin trong trà 8

1.2.1 Tính chất hóa lý 8

1.2.2 Sinh tổng hợp catechin trong lá trà 11

1.2.3 Biến đổi sinh học của hợp chất nhóm catechin trong lá trà và quá trình sản xuất sản phẩm trà truyền thống 13

1.3 Tác dụng sinh học của trà và của nhóm hợp chất catechin 15

1.3.1 Tác dụng dược lý của trà 15

1.3.2 Hoạt tính kháng oxy hóa của nhóm catechin 17

1.3.3 Ứng dụng khả năng kháng oxy hóa của trà và các chất trích ly từ trà 20

1.4 Trích ly polyphenol từ trà 20

1.4.1 Lựa chọn và chuẩn bị nguyên liệu 21

1.4.2 Phương pháp trích ly 23

1.4.3 Các phương pháp trích ly hiện đại 24

1.4.4 Phương pháp trích ly có hỗ trợ của vi sóng 25

2 PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM 30

2.1 Mục tiêu nghiên cứu 30

2.2 Sơ đồ tiến hành thực nghiệm 30

2.3 Phương pháp thực nghiệm 31

2.3.1 Phương pháp phân tích HPLC 31

2.3.2 Phương pháp so màu 31

2.3.3 Lựa chọn nguyên liệu 35

2.3.4 Phương pháp ức chế hoạt tính của enzyme 37

2.3.5 Xác định định tính thành phần các chất trong trà 38

2.3.6 Đánh giá hàm lượng catechin trong trà nguyên liệu 38

2.3.7 Đánh giá hàm lượng một số kim loại trong các mẫu trà 39

2.3.8 Đánh giá phương pháp trích ly có hỗ trợ bằng vi sóng 39

2.3.9 So sánh các phương pháp trích ly khác nhau 41

2.3.10 Quá trình tinh chế sơ bộ sản phẩm 42

2.3.11 Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa in vitro 43

2.3.12 Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa tiền in vivo – phương pháp MDA 44

2.3.13 Đánh giá khả năng kháng khuẩn của sản phẩm polyphenol 44

3 KẾT QUẢ - BÀN LUẬN 45

3.1 Phương pháp xác định hàm lượng polyphenol tổng 45

3.1.1 Phương pháp HPLC 45

3.1.2 Phương pháp so màu 47

3.1.3 Đánh giá các phương pháp 51

3.2 Lựa chọn và xử lý nguyên liệu 54

3.2.1 Điều kiện xử lý mất hoạt tính enzyme 54

3.2.2 Sơ bộ hóa thực vật trong trà 59

3.2.3 Hàm lượng catechin trong các mẫu trà nguyên liệu 60

3.2.4 Hàm lượng một số kim loại có trong mẫu nguyên liệu trà (Phương pháp AS) 63 3.3 Đánh giá phương pháp trích ly có hỗ trợ vi sóng 64

3.3.1 Ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu : dung môi 64

3.3.2 Ảnh hưởng của dung môi trích ly 65

3.3.3 Ảnh hưởng của thời gian chiếu sóng, nguyên liệu và công suất lò 68

3.3.4 Ảnh hưởng của chất kháng oxy hóa hỗ trợ 71

3.3.5 Hiệu quả trích ly 72

3.3.6 So sánh các phương pháp trích ly khác nhau 73

3.4 Tinh chế sơ bộ và đánh giá sản phẩm 74

3.4.1 Quá trình tinh chế 74

3.4.2 Tính chất sản phẩm 75

3.4.3 Đánh giá hoạt tính kháng oxi hóa in vitro của sản phẩm 76

3.4.4 Đánh giá hoạt tính kháng oxi hóa tiền in vivo của sản phẩm (phương pháp MDA) 78

3.4.5 Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của sản phẩm 79

4 KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ 81

5 TÀI LIỆU THAM KHẢO 83 PHỤ LỤC 1

PHỤ LỤC 2

DANH SÁCH CÁC HÌNH - SƠ ĐỒ - BẢNG – ĐỒ THỊ DANH SÁCH CÁC HÌNH 

Hình 1.1 Cây trà và búp trà 1

Hình 1.2 Cấu tạo khung cơ bản của hợp chất catechin và cách đánh số carbon 8

Hình 1.3 Công thức cấu tạo của các hợp chất catechin chính trong trà 9

Hình 1.4 Chu trình sinh tổng hợp tạo thành phenylpropan 11

Hình 1.5 Quá trình phản ứng kết hợp thành mạch cơ bản chalcone 12

Hình 1.6 Chu trình sinh tổng hợp hình thành các hợp chất catechin 12

Hình 1.7 Quá trình oxy hóa các hợp chất catechin trong trà 13

Hình 1.8 Biến đổi của catechin trong quá trình quét gốc tự do 19

Hình 1.9 Nguyên tắc gia nhiệt bằng phương pháp thường (a) và vi sóng (b) 28

Hình 1.10 Sơ đồ hệ thống trích ly có hộ trợ của vi sóng (a) trích ly với sinh hàn hoàn lưu trong lò monomode; (b) trích ly kín trong lò multimode .29

Hình 2.1 Màu tạo thành từ chất chuẩn và tác chất trong các phương pháp 35

Hình 2.2 Trà nguyên liệu sử dụng để trích ly polyphenol 37

Hình 2.3 Sơ đồ lắp ráp dụng cụ trích ly có hỗ trợ vi sóng 40

Hình 2.4 Sơ đồ trích ly bằng phương pháp gia nhiệt thường 41

Hình 3.1 Đường chuẩn C, EC, EGCG, ECG, caffeine 45

Hình 3.2 Phổ HPLC của chất chuẩn 46

Hình 3.3 Biến đổi màu của lá trà đã được xay nhuyễn sau các khoảng thời gian xử lý khác nhau 55

Hình 3.4 Màu dịch trích trà được xử lý trong các khoảng thời gian khác nhau 57

Hình 3.5 Phổ đồ HPLC của dịch trích trà 61

Hình 3.6 Màu của dịch trích thu được ở các dung môi khác nhau 67

Hình 3.9 Phổ đồ HPLC của sản phẩm polyphenol 75

DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ  Sơ đồ 1.1 Sơ đồ công nghệ của quá trình chế biến các sản phẩm trà 14

Sơ đồ 1.2 Sơ đồ quá trình trích ly 21

Sơ đồ 2.1 Sơ đồ tiến hành thực nghiệm 30

Sơ đồ 2.2 Sơ đồ tổng hợp diazotized từ sulfanilamide 34

Sơ đồ 2.3 Sơ đồ trích kiệt polyphenol bằng phương pháp vi sóng 38

Sơ đồ 2.4 Sơ đồ trích ly polyphenol từ trà 39

Sơ đồ 2.5 Sơ đồ tinh chế sản phẩm 42

DANH SÁCH CÁC BẢNG  Bảng 1.1 Số liệu về sản xuất trà của một số nước trên thế giới năm 2001 2

Bảng 1.2 Kế hoạch phát triển trà Việt Nam 3

Bảng 1.3 Thành phần hóa học của lá trà non 4

Bảng 1.4 Hàm lượng vitamin C trong lá trà 6

Bảng 1.5 Hàm lượng catechin trong từng bộ phận riêng biệt của búp trà 10

Bảng 1.6 Tần số vi sóng quy ước trong ứng dụng gia dụng, y tế, công nghiệp, nghiên cứu khoa học tại các khu vực khác nhau trên thế giới 26

Bảng 3.1 Độ lựa chọn của phương pháp 51

Bảng 3.2 Độ nhạy của phương pháp 52

Bảng 3.3 Đánh giá các phương pháp so màu trong phân tích định lượng catechin tổng 53

Bảng 3.4 Độ ẩm của nguyên liệu sau khi xử lý ức chế enzyme 57

Bảng 3.5 Xác định định tính các thành phần trong nguyên liệu trà 59

Bảng 3.6 Hàm lượng catechin trong các mẫu trà nguyên liệu 60

Bảng 3.7 Hàm lượng một số kim loại nặng có trong mẫu nguyên liệu trà 63

Bảng 3.8 So sánh hiệu quả trích ly của các phương pháp khác nhau 73

Bảng 3.9 Hiệu suất tinh chế 74

Bảng 3.10 Tính chất sản phẩm polyphenol thu được 75

Bảng 3.11 Giá trị EC50 trong thử nghiệm hoạt tính quét gốc tự do 77

Bảng 3.12 Giá trị EC50 trong thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hóa MDA 78

Bảng 3.13 Hoạt tính kháng khuẩn của sản phẩm trên một số chủng vi khuẩn 79

DANH SÁCH CÁC ĐỒ THỊ Đồ thị 3.1 Đường chuẩn trong phương pháp Folin-ciocalteu với các dung môi khác nhau 47

Đồ thị 3.2 Đường chuẩn trong phương pháp Prussian –Blue với các dung môi khác nhau 48

Đồ thị 3.3 Đường chuẩn trong phương pháp Vanillin – HCl với các dung môi khác nhau 49

Đồ thị 3.4 Đường chuẩn trong phương pháp Diazotized với các dung môi khác nhau 50

Đồ thị 3.5 Hiệu quả trích ly catechin theo thời gian xử lý diệt men khác nhau 58

Đồ thị 3.6 Phân bố hàm lượng catechin trong các nguyên liệu khác nhau 61

Đồ thị 3.7 Ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu : dung môi 64

Đồ thị 3.8 Ảnh hưởng của các dung môi khác nhau 66

Đồ thị 3.9 Ảnh hưởng của lượng nguyên liệu và dung môi trích ly 68

Đồ thị 3.10 Ảnh hưởng của công suất lò vi sóng lên hiệu quả trích ly 69

Đồ thị 3.11 Ảnh hưởng của chất kháng oxy hóa hỗ trợ 71

Đồ thị 3.12 So sánh hiệu quả trích ly trong các lần trích 72

Đồ thị 3.13 Đồ thị xác định EC50 của vitamin C 76

Đồ thị 3.14 Đồ thị xác định EC50 của sản phẩm polyphenol 76

Đồ thị 3.15 Đồ thị xác định EC50 của chất chuẩn (+)- catechin 77

Đồ thị 3.16 Đồ thị xác định EC50 của Trolox 78

Đồ thị 3.17 Đồ thị xác định EC50 của sản phẩm polyphenol 78

MỞ ĐẦU  

Trà là một loại thức uống lâu đời và được sử dụng rộng rãi trên thế giới Nhiều công trình đã chứng minh trà có tác dụng trong việc phòng ngừa và chữa trị nhiều loại bệnh khác nhau Ngày nay, các kết quả nghiên cứu khả quan đã đẩy mạnh việc sản xuất và sử dụng trà và các thành phần trích ly từ trà, đặc biệt là thành phần polyphenol, như một loại thực phẩm chức năng dùng phòng bệnh Do có tính chất kháng oxy hóa mạnh, polyphenol từ trà còn được sử dụng trong nhiều mục đích khác trong các ngành công nghệ như thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm

Chính vì vậy, việc sản xuất các sản phẩm polyphenol trích ly từ trà mang lại lợi nhuận cao hơn so với các sản phẩm trà truyền thống và đang là hướng ưu tiên của các nước trồng trà trên thế giới Các sản phẩm polyphenol từ trà có giá trị thương mại cao và được sản xuất với quy mô công nghiệp tại các nước có vùng trồng trà tập trung lớn như Trung Quốc, Nhật Bản, Ấn Độ…

Việt Nam là một trong những nước có diện tích và sản lượng trà lớn trên toàn cầu, giá trị xuất khẩu hàng năm khá cao Tuy nhiên quy mô ngành công nghiệp trà Việt Nam vẫn còn nhỏ bé, sản lượng chế biến thấp, chất lượng và công nghệ còn thua kém các nước sản xuất trà khác Việt Nam vẫn đang tập trung vào các sản phẩm trà truyền thống như trà đen, trà xanh, trà oolong, chưa chú trọng đến việc phát triển sản phẩm polyphenol từ trà

Hiên nay đã có đề tài nghiên cứu về khả năng sản xuất polyphenol từ trà tại Việt Nam, nhưng mới chỉ nghiên cứu trên nguyên liệu trà thành phẩm và sử dụng phương pháp trích ly cổ điển Vì vậy việc mở rộng nghiên cứu về đặc điểm nguyên liệu và các phương pháp trích ly mới là cần thiết, giúp ích một phần trong quá trình thúc đẩy sự phát triển của ngành trà Việt Nam

TỔNG QUAN

1 TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu chung về trà

1.1.1 Sinh thái học của trà  [3, 4, 8] 

Tên khoa học của trà: Camellia sinensis (L.) O.Kuntze

Trà được xếp trong phân loại thực vật như sau: ngành Hạt kín

Angiospermatophyta, lớp Ngọc lan (hai lá mầm) Magnoliopsida, phân lớp Sổ Dilleniidae, bộ Trà Theales, họ Trà Theaceae, chi Trà Camellia (Thea.) [4]

Hình 1.1   Cây trà và búp trà

Cây trà sinh trưởng trong điều kiện tự nhiên chỉ có một thân chính, chia làm 3 loại: thân gỗ, thân bụi, thân nhỡ (bán gỗ) Cành trà do mầm sinh dưỡng phát triển thành, trên cành chia ra nhiều đốt, chiều dài biến đổi nhiều từ 1 – 10cm Đốt trà càng dài

là biểu hiện của giống trà có năng suất cao Lá trà mọc cách trên cành, mỗi đốt có một lá, hình dạng và kích thước thay đổi tùy giống Lá trà có gân rất rõ, rìa lá có răng cưa Búp trà là giai đoạn non của một cành trà, được hình thành từ các mầm dinh dưỡng, gồm có tôm (phần lá non trên đỉnh chưa xòe) và 2 hoặc 3 lá non Kích thước của búp trà thay đổi tùy giống và kỹ thuật canh tác Cây trà sau khi sinh trưởng 2 – 3 tuổi bắt đầu ra hoa, mọc từ chồi sinh thực ở nách lá [8]

Trà là cây lâu năm, có chu kỳ sống rất lâu, có thể đạt 60 – 100 năm hoặc lâu hơn Tuổi thọ kinh tế tối đa của một cây trà thương mại vào khoảng 50 – 65 năm tùy thuộc điều kiện môi trường và phương pháp trồng trọt

Trà cho năng suất cao vào mùa mưa từ tháng 5 – 11, sau 10 – 15 ngày thì thu hoạch một lần Trà nguyên liệu sử dụng trong cộng nghiệp chế biến chủ yếu là 1 tôm và

2 – 3 lá non

1.1.2 Phân bố trà

1.1.2.1 Phân bố trà trên thế giới [3, 8]

Trà được trồng nhiều tại vành đai á nhiệt đới, khu vực có đặc điểm khí hậu ôn hòa,

ẩm ướt từ 30o vĩ bắc đến 49o vĩ nam Hiện nay, trà được trồng ở hơn 30 nước và được sử dụng ở hầu hết các nước trên thế giới Các nước sản xuất và xuất khẩu trà nhiều trên thế giới là Ấn Độ, Trung Quốc, Srilanca, Kenia, Thổ Nhĩ Kì, Indonesia, Nhật Bản,….Năm 1995 diện tích trồng trà toàn thế giới là 2,500,000 ha, sản lượng 2,590,000 tấn trà khô

Bảng 1.1 Số liệu về sản xuất trà của một số nước trên thế giới năm 2001[3] 

Quốc gia Diện tích

(ha)

Sản lượng

(tấn)

Năng suất

(kg/ha)

Xuất khẩu

(tấn)

Mức tiêu thụ

(g/người)

Trung quốc 1,130,000 685,000 598 227,934 325

Ấn Độ 438,000 835,000 1,840 191,863 650 Srilanca 196,000 294,880 1,453 239,000 1,300 Indonesia 158,000 196,000 1,453 101,105 600 Banladesh 49,000 52,033 975 15,402 - Kenia 120,000 260,000 2,066 239,000 800 Nhật Bản 51,000 88,000 1,725 62,526 1,050

Hiện nay, trà được sản xuất và chế biến thành nhiều loại sản phẩm khác nhau,

trong đó khoảng 76 – 78% là trà đen, 20 -22% là trà xanh, 2% là trà Oolong, còn

lại là các sản phẩm trà khác

1.1.2.2 Phân bố trà tại Việt Nam [3]

Ở nước ta, trà được trồng tại hơn 20 tỉnh, hình thành các vùng trồng trà tập trung :

vùng thượng du: Hà Tuyên, Hoàng Liên Sơn, Lai Châu ; vùng trung du: Vĩnh

Phúc, Bắc Thái, Yên Bái…; vùng Tây Nguyên: Gia Lai, Kom Tum, Lâm Đồng…

Trong những năm gần đây diện tích trồng trà và các cơ sở chế biến trà tăng lên

nhanh chóng Năm 1995, sản lượng trà cả nước đạt hơn 40,000 tấn, đến năm 2001,

cả nước có 100,000 ha đất trồng trà với hơn 200 cơ sở chế biến trà, sản lượng đạt

87,000 tấn khô, đứng thứ 8 trong 34 nước sản xuất trà thế giới; xuất khẩu 67,000

tấn sang 49 nước, đạt kim ngạch 78 triệu USD, đứng thứ 6 thế giới; tiêu dùng nội

địa 20,000 tấn, mức tiêu thụ đạt 256g/đầu người

Bảng 1.2    Kế hoạch phát triển trà Việt Nam [3]

Chỉ tiêu Năm 2000 Năm 2005 Năm 2010

Diện tích (ha) 81,692 104,000 104,000

Năng suất bình quân (tấn tươi/ha) 4,23 6,1 7,5

Sản lượng trà khô (tấn) 66,000 108,000 147,000 Sản lượng xuất khẩu (tấn) 42,000 78,000 110,000 Kim ngạch xuất khẩu (triệu USD) 60 120 200

Tuy nhiên, ngành trà Việt Nam vẫn tập trung vào các sản phẩm trà truyền thống như

trà đen, trà oolong, trà xanh, gần đây là các sản phẩm trà hoà tan ; chưa phát triển

các sản phẩm trích ly từ trà, vốn là những sản phẩm có giá trị thương mại cao, nên

chưa tận dụng hết ưu thế về vùng nguyên liệu và khả năng phát triển của ngành

1.1.3 Thành phần hóa học của lá trà

Trà là một loại thức uống truyền thống đã có lịch sử hàng ngàn năm, quá trình

nghiên cứu về trà trên thế giới đã được thực hiện từ rất lâu Hiện nay thành phần

hóa học của lá trà đã được mô tả tương đối đầy đủ Thành phần chủ yếu của lá trà

được mô tả trong Bảng 1.3

Bảng 1.3  Thành phần hóa học của lá trà non [8, 10, 42, 56, 60]

Thành phần % khối lượng chất khô

Flavonol và flavonol glucoside 3-4

Polyphenolic acid and depside 3-4

Leucoanthocyanin 2-3

Chlorophyll và các chất màu khác 0,5 - 0,6

Khoáng 5-6 Caffeine 3-4 Theobromine 0.2

1.1.3.1 Polyphenol [8, 42, 56]

Nhóm các hợp chất polyphenol là thành phần được quan tâm nhiều nhất trong lá trà Các hợp chất polyphenol của lá trà rất khác với các hợp chất polyphenol được tìm thấy trong các loại cây khác Các cấu tử chính chiếm đa số là các catechin (C, EC, EGCG, EGC, ECG…) Ngoài ra trong thành phần polyphenol của trà còn có một số chất khác với tỉ lệ thấp như các flavonol (quercetin, kaempferol, rutin…), các dẫn xuất glucoside như myricetin-3-glucoside, kaempferol-3-glucoside, myricetin-3–rhamnoglucoside, quercetin-3-rhamnoglucoside, kaempferol-3-rhamnodiglucoside

…, các leucoanthocyanin, các hợp chất polyflavonoid như theaflavin gallate, theaflavin-3’-gallate, theaflavin-3,3’-digallate ), thearubigin (procyanidine, procyanidine gallate…) Các dạng hợp chất như theaflavin, thearubigin chiếm tỉ lệ rất thấp trong búp trà và lá trà non nhưng tăng dần tỉ lệ trong các lá trà già hơn

(theaflavin-3-1.1.3.2 Caffeine [8, 32, 37]

Caffeine (1,3,7-trimethyl xanthine; 1,3,7-trimethyl-1H-purine -2,6 (3H,7H)-dione),

là một dẫn xuất tạo thành từ purine, caffeine chủ yếu được tổng hợp tại lá trà, chiếm khoảng từ 3 – 5% lượng chất khô trong lá trà, và hàm lượng này ít biến đổi trong quá trình phát triển của lá trà Điều đáng chú ý là hàm lượng caffeine trong lá trà cao hơn hàm lượng caffeine tương ứng trong hạt cà phê (chiếm khoảng 1,5% trọng lượng khô) Ngoài caffeine, trong lá lá trà còn có các dẫn xuất khác của methylxanthine như theobromine, theophylline với hàm lượng thấp hơn (<0.1%)

1.1.3.3 Acid amine [8, 10]

Các acid amine cơ bản trong lá trà bao gồm aspartic, arginine, glutamic, serine, glutamine, tyrosine, valine, phenylalanine, leucine, isoleucine and theanine (5-N-ethylglutamine)… Khoảng 50% acid amine trong lá trà tồn tại ở dạng tự do Trong

đó theanine chiếm hàm lượng cao nhất, khoảng 50-60% tổng hàm lượng acid amine

tự do, tiếp theo là aspartic acid và arginine Theanine là acid amine đặc trưng của cây trà, theanine chỉ có thể được tìm thấy ở các cây họ trà và một số ít các loài nấm

Khác với phần lớn các acid amine khác được tổng hợp tại lá trà, theanine được tổng hợp tại bộ rễ của cây trà và vận chuyển lên lá

1.1.3.4 Enzyme [8, 10, 56]

Trong búp trà có hầu hết các loại enzyme nhưng chủ yếu gồm 2 nhóm: nhóm enzyme thủy phân gồm amilase, invectase, glucozidase, protease…; nhóm enzyme oxy hóa khử gồm catalase, polyphenol oxidase và peroxidase…

Trong số các enzyme trong lá trà, enzyme polyphenol oxidase thu được nhiều sự quan tâm do vai trò quan trọng trong quá trình oxy hóa nhóm catechin của trà

Các gốc đường tự do có mặt trong lá trà bao gồm glucose, fructose, sucrose,

raffinose and stachyose Các đường polysaccharide gồm có galactose, arabinose,

galacturonic acid, rhamnose và ribose Các đường tự do là nguồn nguyên liệu chính để tổng hợp catechin trong lá trà Những nghiên cứu sử dụng glucose đánh dấu bằng C14 (đồng vị carbon 14) đã chỉ ra rằng glucose là một trong những tiền chất của polyphenol và acid amine (ngoại trừ theanine) trong lá trà

1.1.3.7 Các nhóm hợp chất khác [8, 10, 51]

Protein

Protein chiếm khoảng 15% khối lượng chất khô của lá trà tươi, thay đổi tuỳ theo giống trà, tuy nhiên ít biến đổi theo quá trình phát triển của lá trà

Chất béo và các acid béo tự do

Các hợp chất lipid, phospholipid và các acid béo chiếm khoảng 5-6 % trong lá trà, hàm lượng này biến đổi khá nhiều tuỳ theo từng giống trà khác nhau Các acid béo

tự do tìm thấy trong lá trà có linolenic, linoleic, oleic và palmitic…

Carotenoid

β-carotene, lutein, violaxanthine và neoxanthine được tìm thấy trong lá trà

Acid hữu cơ

Các acid như citric, tartaric, malic, oxalic, fumaric, caffeic, quinic, gallic, succinic, chlorogenic, neo-chlorogenic, p-coumarylquinic, ellagic acid… đã được nhận diện trong lá trà tươi

Kim loại

Các chất vô cơ chiếm khoảng 5-6% khối lượng khô của trà, chiếm nhiều nhất là nhôm, mangan, magie… Hàm lượng các chất vô cơ trong lá trà biến đổi khá nhiều tuỳ theo thổ nhưỡng vùng đất Một điều đáng lưu ý là các một phần các kim loại, đặc biệt là nhôm, tìm thấy trong trà dưới dạng phức chelate với các catechin [33]

Các chất dễ bay hơi (tinh dầu trà)

Thành phần tinh dầu trà chiếm tỉ lệ rất thấp trong tổng khối lượng của lá trà (<0.01%) Các thành phần đã được nhận diện trong tinh dầu trà bao gồm linalol, delta-cardinene, geraniol, nerolidol, alpha-terpineol, cis-jasmone, indole, beta- ionone, 1-octanal, indole-3-carbinol, beta-caryophyllene….[36]

67

2' 3' 4'

5'6'

Catechin của trà thuộc họ flavonoid, nhóm flavan-3-ol, phân tử có 15 carbon bao gồm hai vòng 6 carbon A và B được nối bởi 3 đơn vị carbon ở vị trí 2, 3, 4, hình thành một dị vòng C chứa một nguyên tử oxy Cấu trúc của catechin có chứa hai carbon bất đối ở vị trí 2 và 3, không chứa nối đôi ở vị trí 2,3 và nhóm 4-oxo [6]

 

Hình 1.2 Cấu tạo khung cơ bản của hợp chất catechin và cách đánh số carbon [6]

Trà được biết là có 6 loại hợp chất catechin chính và một số lượng nhỏ các dẫn xuất catechin khác Các catechin được chia thành 2 nhóm: nhóm catechin tự do bao gồm

C, GC, EC, EGC (vị trí carbon số 3 có chứa nhóm thế hydroxyl) và nhóm đã bị ester hóa hay nhóm galloyl catechin : ECG, EGCG (nhóm hydroxyl ở vị trí carbon

số 3 được thay bằng một nhóm gallate) Các hợp chất catechin trong lá trà đã được tách ra từng chất ở dạng tinh khiết, ở thể rắn chúng là những chất kết tinh không màu hình kim hoặc hình lăng trụ, có vị chát dịu hoặc hơi đắng, tác dụng với FeCl3

cho kết tủa xanh thẫm hoặc xanh nhạt tuỳ theo số lượng nhóm hydroxyl trong phân

tử Các catechin đều dễ tan trong nước nóng, rượu, acetone, ethyl acetate tạo dung dịch không màu, không tan trong các dung môi không phân cực hoặc ít phân cực như benzene hoặc chloroform

OH OH HO

OH

OH H H

O

OH OH HO

OH

OH H

H

OH

O

OH OH HO

OH

O H

H

O C

OH

OH

OH OH

O

OH OH

HO

OH

O H

H

O C

OH

OH H H

O

OH OH HO

OH

OH H

(T nc : Nhiệt độ nóng chảy, M : Khối lượng phân tử, [ α] D : góc quay cực)

Hình 1.3   Công thức cấu tạo của các hợp chất catechin chính trong trà [10]

Hàm lượng catechin trong búp trà cao nhất đạt đến khoảng 30% trọng lượng khô Trong các hợp chất catechin được tìm thấy trong trà, thành phần gallate chiếm đa số

(trên 80% tổng catechin) EGCG là thành phần đặc trưng của trà do chỉ được tìm thấy trong trà, EGCG có thể chiếm đến hơn 50% tổng khối lượng các hợp chất catechin và khoảng 10% tổng khối lượng khô của trà, tiếp theo là EGC và ECG (chiếm khoảng 10 - 20% tổng catechin) Các hợp chất catechin (C, EC, GC) còn lại

có hàm lượng thấp và không phải là thành phần đặc trưng của trà do còn được tìm thấy trong cacao, nho, táo, hành…, với mức độ phân bố rộng hơn Hàm lượng của các catechin trong lá trà luôn luôn thay đổi, phụ thuộc vào giống trà, thời kỳ sinh trưởng, bộ phận cây trà, vị trí các lá trên búp trà và các yếu tố khác về thổ nhưỡng, khí hậu, cách chăm bón… Trong quá trình phát triển của lá trà, dưới tác dụng của các enzyme, các catechin bị chuyển dần thành các hợp chất tannin và giảm dần hàm lượng trong lá trưởng thành

Bảng 1.5 Hàm lượng catechin trong từng bộ phận riêng biệt của búp trà [8]

152,27

0 47,84 577,93 132,27 910,31

206,42

0 45,16 431,14 103,09 786,11

232,36

0 45,16 431,14 103,09 701,82

222,08 68,79 65,65 292,93 87,98 737,40

Đơn vị : mg/g chế phẩm chiết bằng ethyl acetate

Hiện nay, các hợp chất catechin đã có được một cơ sở dữ liệu nghiên cứu khá chi tiết Tuy nhiên trong trà, ngoài catechin, các thành phần polyphenol cao phân tử khác như theaflavin, thearubigin, leucoanthocyanidin chưa được quan tâm nghiên cứu đầy đủ Các thành phần này chiếm tỉ lệ cao trong các lá trà trưởng thành hoặc trong các sản phẩm chế biến có lên men như trà đen và trà oolong [8, 10, 51, 60]

1.2.2 Sinh tổng hợp catechin trong lá trà [6, 10, 20, 56]

Hiện nay, cơ chế về quá trình sinh tổng hợp các catechin trong lá trà vẫn chưa được giải thích một cách đầy đủ, một phần do thành phần tương đối đặc biệt của các catechin trong lá trà Phần lớn các nghiên cứu vẫn dựa trên quá trình sinh tổng hợp của các nhóm hợp chất flavonoid trong các loài cây khác từ đó suy luận cho trà

Xét theo khung cơ bản gồm 3 vòng A, B, C (Hình 1.2), cấu trúc của họ flavonoid

được chia làm 2 phần :

- Phần C6 – C3 (Vòng B + 3C), xuất phát theo chu trình acid shikimic dẫn đến dẫn

chất phenylpropane

 

Hình 1.4  Chu trình sinh tổng hợp tạo thành phenylpropan [6]

- Phần C6 (vòng A) xuất phát từ 3 đơn vị acetate dẫn đến acid triacetic

COOH

P

C CH 2 COOH

HOOC CH2COCOOH

OH

+ H2O -H3PO4

-CO2+NH3

CH2NH

OH

H

C COOH

-NH3OH

CH=CH-COOH HC

Phospho enol pyruvic acid

3 - enol pyruvyl shikimate 5 - phosphate

Tyrosin Acid paracoumaric

Hình 1.5 Quá trình phản ứng kết hợp thành mạch cơ bản chalcone [6]

Trong trường hợp chalcone và các dẫn xuất của chalcone, mạch 3C không đóng

vòng Còn phần lớn các trường hợp khác, mạch 3C đóng vòng với vòng A tạo thành

vòng 6 dị thể chứa 1 nguyên tử oxy

Qua các kết quả nghiên cứu, sơ đồ sinh tổng hợp sau được đề nghị cho các hợp chất

5-dehydroshikimic acid

Shikimic acid

Phenyl byruvic acid

2,4,4’,6’- Pentahydroxychalcone

Tetrahydroxychalcone-2-

OH

H H

O

H H

OH

Chalcone

O HO

OH

OH

OH OH

O HO

OH

OR1

O O

O HO

OH

OH

OH OH

O HO

OH

OR2

O O OH

OH

O

O HO

OH

OR2

OH OH O OH

OR1OH

HO

+ catechin, gallocatechin Thearubigin

PPO

PPO: polyphenol oxidase

1.2.3 Biến đổi sinh học của hợp chất nhóm catechin trong lá trà và quá trình sản xuất sản phẩm trà truyền thống [8, 10, 51, 60]

Các quá trình biến đổi catechin trong trà đã được nghiên cứu kĩ trong các công trình

về trà, chủ yếu là về trà đen Đóng vai trò chính trong quá trình chuyển hóa này là enzyme polyphenol oxidase, được xác định thông qua hiện tượng oxy hóa không cần oxy cũng như hiện tượng bị đầu độc khi có mặt kali cyanide trong sản xuất trà đen Hiện nay, enzyme polyphenol oxidase đã được tách ra ở dạng tự do với thành phần cấu trúc chính là protein chứa nhân ion đồng [60] Enzyme trong lá trà được chứa trong các cấu trúc riêng của tế bào lá, trong quá trình phát triển của lá trà, enzyme sẽ chuyển hóa dần các hợp chất catechin thành các tannin bậc cao

Hình 1.7 Quá trình oxy hóa các hợp chất catechin trong trà [10]

Sơ đồ 1.1 Sơ đồ công nghệ của quá trình chế biến các sản phẩm trà [8]

Trong quá trình sản xuất trà đen, trước giai đoạn lên men lá trà bị vò dập, tế bào lá

bị phá vỡ, để tạo điều kiện cho enzyme tiếp xúc và oxi hóa thành phần catechin, sau thời gian lên men nhất định, lá trà được sấy, phân loại và đóng gói Do đặc điểm của quy trình chế biến nên hàm lượng của hầu hết các hợp chất catechin trong trà đen rất thấp, khoảng 2-3% hàm lượng chất khô, so với hàm lượng 20 -30% trong trà nguyên liệu ban đầu Màu vàng đỏ đặc trưng của nước trà đen do các sản phẩm oxy hóa như theaflavin và thearubigin gây ra

Ngược lại, trong quá trình sản xuất trà xanh, các enzyme trong lá trà bị làm mất hoạt tính bằng nhiệt hoặc hơi nước ngay khi bắt đầu chế biến nên không xảy ra quá

Trà tươi nguyên liệu

Vò Lên men hạn chế Lên men hoàn toàn

Sấy khô Diệt men, chấm dứt

quá trình lên men

trình oxy hóa các catechin Vì vậy, nếu thực hiện quy trình tốt, hàm lượng các hợp chất catechin trong sản phẩm trà xanh tương đương với trà nguyên liệu ban đầu

Trà oolong là một sản phẩm trung gian giữa trà xanh và trà đen, trà tươi sử dụng làm trà oolong vẫn trải qua quá trình lên men (quá trình oxi hóa catechin) như trà đen, nhưng quá trình lên men này không xảy ra hoàn toàn mà được kiểm soát theo mục đích tạo sản phẩm của người sản xuất Khi quá trình chuyển hóa catechin trong trà nguyên liệu đạt mức độ mong muốn, enzyme sẽ bị làm mất hoạt tính, quá trình oxi hóa dừng lại Vì vậy hàm lượng tổng catechin trong sản phẩm trà oolong nằm giữa so với trà xanh và trà đen Thông thường hàm lượng catechin trong trà oolong chiếm khoảng 10-12% chất khô, tức là khoảng 50% so với trà nguyên liệu ban đầu

1.3 Tác dụng sinh học của trà và của nhóm hợp chất catechin

1.3.1 Tác dụng dược lý của trà [18, 27, 28, 30, 32, 36, 51]

Trà đã được sử dụng như là một phương thuốc trong y học phương đông từ rất lâu Tuy nhiên các hiểu biết về cơ chế tác động của trà mới được bắt đầu nghiên cứu mạnh mẽ trong thế kì 20 Trước đây, các tác dụng của trà được cho rằng là do tác động của thành phần caffeine và vitamin C Bắt đầu từ khoảng thập niên 70 của thế

kỉ 20, việc nghiên cứu chi tiết về trà đã chỉ ra rằng những tác dụng về mặt dược lý của trà là do sự có mặt rất nhiều của các nhóm hợp chất catechin trong trà Nhiều công trình đã công bố về tác dụng của trà và các chất trích ly từ trà lên nhiều bệnh khác nhau như các bệnh ung thư, bệnh về đường tim mạch, bệnh tiểu đường, bệnh Alzheimer, bệnh Parkison, bệnh béo phì, bệnh sỏi thận, bệnh về đường tiêu hóa, bệnh răng miệng…; ngoài ra, trà còn có tác dụng giảm hàm lượng cholesterol, làm giảm sự nhiễm độc do kim loại, do phóng xạ…

Tác dụng ngăn chặn và chữa trị bệnh ung thư của trà và các hợp chất catechin được

nghiên cứu mạnh mẽ nhất Khi tiến hành nghiên cứu in vivo, nhiều công trình công

bố đã cho thấy trà và các chất trích ly từ trà như EGCG, EGC, ECG của trà có khả năng tương tác, ngăn chặn và hạn chế quá trình khơi mào, hình thành và phát triển

của tế bào ung thư Trong giai đoạn khơi mào, các hợp chất catechin trung hoà các tác nhân bị kích hoạt bởi cytochrome P450 enzyme, các tác nhân này có khả năng tương tác làm thay đổi cấu trúc của ADN; ngăn chặn sự tạo thành nitrosamine, một nhóm các hợp chất phát sinh từ khói thuốc lá, các amine dị vòng trong thịt, cá nấu

chín, các tác nhân được cho là có thể gây ung thư Các thử nghiệm in vivo cho thấy

khả năng tương tác trực tiếp và tăng cường hiệu quả của EGCG, EC vào hệ thống bảo vệ bằng enzyme của tế bào, hạn chế sự hình thành của các tác nhân gây biến đổi trong tế bào

Trong giai đoạn bắt đầu của tế bào ung thư, EGCG có khả năng ức chế AP-1, một chất dẫn truyền khơi mào cho sự phát triển của tế bào ung thư da; thể hiện khả năng ngăn chặn protein kinase, enzyme kích hoạt tế bào trong giai đoạn phát triển của tế bào ung thư, ức chế hoạt động của telomerase, làm giảm thời gian sống của tế bào ung thư

Khi quá trình ung thư đã diễn ra, EGCG có thể can thiệp, ức chế hoạt động của urokinase, enzyme đóng vai trò quan trọng trong quá trình phát triển và biến đổi của

tế bào ung thư, phá huỷ các dạng biến đổi đặc thù của tế bào gây ra do adevirus, hay ngăn chặn quá trình tổng hợp ADN trong tế bào ung thư hepatoma, leukemia, và ung thư phổi…

Các kết quả nghiên cứu in vivo, và các kết quả nghiên cứu trên động vật như chuột,

thỏ đều cho kết quả rất tốt về khả năng ngăn chặn ung thư của trà và các chất catechin, tuy nhiên kết quả nghiên cứu trên người vẫn chưa cho thấy hiệu quả tương

tự Một số công trình công bố catechin và trà có khả năng ngăn chặn ung thư ở người như ung thư vòm họng, ung thư đường tiêu hóa, làm giảm khối u ung thư vú [51]…tuy nhiên kết quả cũng mới mang tính cục bộ, chưa đạt được sự thống nhất cao

1.3.2 Hoạt tính kháng oxy hóa của nhóm catechin [18, 21, 32, 36, 42, 51]

1.4.2.1 Quá trình oxy hóa và nguyên nhân gây bệnh do mất cân bằng oxy hóa

Theo các nghiên cứu đã được công bố, các bệnh như ung thư, tim mạch, lão hóa …

có liên hệ rất gần với các quy luật về quá trình oxy hóa trong tế bào sống Các quá trình oxy hóa, diễn ra dưới tác dụng của các gốc tự do, trong tế bào là cần thiết để tạo ra năng lượng hoặc trong các quá trình tổng hợp nucleic acid, protein, hormon Gốc tự do là những hợp chất hoạt động mạnh, được tạo ra trong cơ thể trong quá trình trao đổi chất hay được đưa vào từ bên ngoài do vi sinh vật hay vi rút Các gốc

tự do được tạo thành gồm các gốc có hoạt tính cao như hydroxyl zOH, ion sắt (Fe2+O), Cu(OH)2, những gốc tự do hoạt tính trung bình và yếu như superoxide anion O2z, peroxyl (ROOz), hydrogen peroxide H2O2, singlet oxy (O1), nitric oxide (NOz), peroxynitrite (ONOO-), alkoxyl (ROz)… Gốc tự do trong tế bào sinh ra trong quá trình sinh dưỡng được kiểm soát chặt chẽ thông qua quá trình kháng oxy hóa nội tại bằng các hợp chất như glutathione, vitamin E, vitamin C và enzyme superoxide dismutase, ngoài ra cơ thể còn có các tế bào như neutrophil, monocyte, B-cell… có khả năng chống lại các yếu tố oxy hóa ngoại lai xâm nhập

Tuy nhiên, trong tế bào có thể xuất hiện hiện tượng các gốc tự do được tạo ra quá nhiều do mất cân bằng trong hoạt động hoặc do các yếu tố bên ngoài như các chất độc, do nhiễm vi sinh vật, do ozone, bức xạ UV, nhiễm phóng xạ, do thuốc lá Các gốc tự do dư thừa, khi cơ thể thiếu các yếu tố bảo vệ để ngăn chặn, có khả năng tương tác, phá hủy màng lipid không bão hoà của tế bào, làm giảm khả năng bảo vệ

tế bào, dẫn đến sự xâm nhập của các tác nhân gây bệnh từ bên ngoài; oxi hóa các nucleic base làm thay đổi cấu trúc ADN, dẫn đến các quá trình đột biến, phát sinh các khối u, ung thư; làm hỏng cấu trúc các protein mang nhóm SH (các protein này đóng vai trò rất quan trọng như là chất mang hoặc chất hoạt hóa enzyme trong quá trình hô hấp), gây ra các bệnh nghiêm trọng về đường hô hấp…

Các gốc tự do dư thừa là nguồn gốc phát sinh các bệnh nguy hiểm nên các nghiên cứu đều hướng tới việc khảo sát khả năng kháng oxy hóa, quét gốc tự do trong quá

trình tìm kiếm các hợp chất trong thiên nhiên có khả năng ngăn chặn hoặc chữa bệnh

1.4.2.2 Tính kháng oxy hóa của nhóm hợp chất catechin [5, 13, 21, 24, 28, 34,

41, 49, 51, 53, 55]

Công thức hóa học của các flavonoid với sự có mặt của các hydrogen phenolic thể hiện khả năng kháng oxy hóa mạnh Công thức cấu tạo catechin với nhiều nhóm hydroxyl (5 nhóm ở các catechin, 6 ở các gallocatechin, 8 ở các catechin gallate và

9 ở các gallocatechin gallate) đảm bảo khả kháng oxy hóa rất mạnh của nhóm hợp chất catechin

Khi thực hiện khảo sát khả năng khảo sát trên các gốc tự do tổng hợp như DPPH, ABTS…, các catechin thể hiện hoạt tính vượt trội so với các chất kháng oxy hóa đối chứng như vitamin C, vitamin E, trolox (các catechin thể hiện hoạt tính mạnh hơn

từ 3 đến 6 lần) Hoạt tính kháng oxy hóa của nhóm catechin thể hiện một sự khác biệt về mối tương quan cấu trúc so với các hợp chất khác họ flavonoid Khi so sánh với hợp chất flavonoid có hoạt tính quét gốc tự do mạnh nhất trong môi trường phân cực quercetin (do đặc điểm cấu trúc của quercetin có nhóm 4-oxo và nối đôi tại vị trí carbon số 2 và 3 cho phép hình thành sự liên hợp giữa vòng A và vòng B giúp

giải toả điện tử tự do, 3 nhóm hydroxyl 3,5,7 và hai nhóm ortho-hydroxyl trên vòng

B [5, 13, 49]), các hợp chất C và EC, do trong công thức thiếu sự liên hợp giữa vòng A và vòng B, có hoạt tính quét gốc tự do kém hơn, nhưng các gallate catechin như EGCG và ECG có hoạt tính trội hơn Sự khác biệt về khả năng của EGCG và ECG được giải thích dựa trên số lượng lớn các nhóm hydroxyl trong công thức, cho phép tiếp nhận electron dễ dàng hơn [13]

Hoạt tính kháng oxi hóa của các catechin trong trà, tính theo tỷ lệ mol, trong thử nghiệm chống lại sự hình thành các gốc tự do DPPH trong dung dịch nước được xếp theo trật tự giảm dần như sau: epicatechin gallate ≈ epigallocatechin gallte > epigallocatechin > gallic acid > epicatechin ≈ catechin [49] Với hàm lượng

O OH

OH OH HO

OH

O OH

OH O HO

OH

O OH

OH O HO

OH H

O O

COOH HO

OH

O O

O OH

O

O OH

OH O HO

OH

O

HO

R.RH

2H.

MeOH 3H.

catechin tổng chiếm khoảng 30% khối lượng khô, trà và dịch trích trà cũng thể hiện tính kháng oxy hóa rất mạnh trong các thử nghiệm, kết quả tính toán cho thấy thành phần catechin đóng góp khoảng 70-80% khả năng kháng oxy hóa của trà [49, 51]

Hình 1.8    Biến đổi của catechin trong quá trình quét gốc tự do [49]

Khi tiến hành thử nghiệm khả năng kháng oxy hóa trong môi trường lipid như chống oxy hóa lipid màng tế bào (LDL), chống oxy hóa các acid béo, hay quét các

gốc tự do superoxyl, hydroxyl… trong môi trường lipid ở các thử nghiệm in vitro và

in vivo, các hợp chất catechin đều thể hiện khả năng phản ứng rất mạnh, mạnh hơn

nhiều so với trolox, vitamin E,C và cả quercetin [17, 19, 26, 28, 39] Do đặc điểm gần với môi trường trong cơ thể sống, các thử nghiệm kháng oxy hóa trong môi trường lipid mô tả đầy đủ hơn triển vọng ứng dụng dược lý của các hợp chất Đối với khả năng ức chế quá trình peroxide lipid, các catechin của trà được xếp theo trật tự sau: EGCG > ECG > EGC > EC; khả năng quét gốc tự do sinh ra trong quá

trình peroxide lipid thì ECG > EGCG > EC > EGC; khả năng quét gốc tự do zOH giảm theo trật tự ECG > EC > EGCG >> EGC [21, 41, 49, 53, 55]

Các kết quả khả quan nói trên đã mở ra nhiều hướng nghiên cứu về tác dụng cụ thể của các hợp chất catechin lên các bệnh ở người và khả năng sử dụng trong quá trình ngăn ngừa và chữa trị bệnh

1.3.3 Ứng dụng khả năng kháng oxy hóa của trà và các chất trích ly từ trà [2,

42, 43, 45]

Ứng dụng được quan tâm mạnh mẽ nhất hiện nay của nhóm các hợp chất catechin

là về khả năng dược lý Nhưng ngoài ra, khả năng ngăn chặn có hiệu quả các quá trình oxy hóa, đặc biệt là quá trình oxy hóa lipid, nhóm chất này còn được quan tâm

sử dụng trong các sản phẩm thuộc các lĩnh vực khác như mỹ phẩm và thực phẩm Trong các lĩnh vực này, do đặc điểm xuất phát từ thiên nhiên, an toàn, trà và các chất từ trà đang được sử dụng chủ yếu như một phụ gia chống oxy hóa nhằm thay thế các phụ gia tổng hợp thường dùng khác như BHT, BHA… Trong mỹ phẩm, trà

và các chất từ trà được bổ sung vào các sản phẩm như chăm sóc cá nhân (kem đánh răng, kem dưỡng da, sữa tắm…), các sản phẩm tẩy rửa (nước rửa chén, sữa tắm, dầu gội…), sản phẩm tẩy mùi, diệt khuẩn nhẹ…Trong thực phẩm, ngoài khả năng kháng oxy hóa trong các sản phẩm như bánh kẹo , trà còn được sử dụng như một dạng thực phẩm chức năng nhằm tăng cường khả năng phòng bệnh của cơ thể

1.4 Trích ly polyphenol từ trà

Do đặc điểm về hàm lượng polyphenol trong trà, nên các quá trình trích ly polyphenol từ trà thường được hiểu là trích ly nhằm thu sản phẩm là nhóm các hợp chất catechin Hiện nay, sản phẩm catechin từ trà đã được sản xuất ở quy mô công nghiệp ở các nước như Trung Quốc, Nhật Bản, Ấn Độ…, sản lượng chế biến hàng năm rất lớn [42, 43] Nhìn chung, quy trình trích ly từ trà để tạo thành sản phẩm thô hay dịch trích cũng tương đối đơn giản, không đòi hỏi nhiều thiết bị phức tạp Hiện

nay, trong công nghiệp vẫn sử dụng các phương pháp trích ly dung môi thông dụng

để thu sản phẩm thô ban đầu Sơ đồ của quá trình được mô tả trong sơ đồ sau

Sơ đồ 1.2 Sơ đồ quá trình trích ly [50]

1.4.1 Lựa chọn và chuẩn bị nguyên liệu [8, 11, 22, 25, 29, 37, 50]

Nguyên liệu trà dùng để trích ly catechin có thể dùng trà tươi, trà xanh bán thành phẩm hoặc trà xanh thành phẩm, trà oolong Nếu dùng sản phẩm trà bán thành phẩm hoặc thành phẩm cần phải sử dụng loại trà đã trải qua quá trình ức chế enzyme để đảm bảo hàm lượng catechin Việc sử dụng trà xanh hoặc trà oolong làm nguyên liệu bị hạn chế do giá thành cao và chất lượng không ổn định Việc lựa chọn nguyên liệu ảnh hưởng rất lớn đến kết quả trích ly polyphenol từ trà do đặc điểm phân bố hàm lượng catechin không đồng đều, phụ thuộc rất nhiều vào giống trà, thổ nhưỡng, thời điểm thu hái, cách bảo quản trước khi sử dụng

Trà tươi nguyên liệu

Trong thành phần của trà, búp trà và lá non có hàm lượng catechin cao nhất Trong quá trình phát triển, dưới tác dụng của enzyme polyphenol oxidase, các catechin sẽ chuyển dần về các dạng hợp chất tannin có phân tử lớn, nên trong các lá già, hàm lượng catechin rất thấp và không có ý nghĩa trong việc trích ly catechin Vì vậy trà tươi, nguyên liệu của quá trình chế biến sản phẩm trà, được sử dụng trong quá trích

ly

Trong lá trà tươi, hợp chất catechin được tổng hợp và nằm trong tế bào lá, và được giữ không tiếp xúc với enzyme polyphenol oxidase Khi có tác dụng cơ học như vò, xay nghiền… làm vỡ cấu trúc tế bào và giải phóng các enzyme, enzyme sẽ tiếp xúc

và oxy hóa nhanh chóng các catechin, vì vậy trước khi thực hiện quá trình trích ly cần phải có giai đoạn làm mất hoạt tính enzyme Hiện nay, trong công nghiệp chế biến trà nói chung, hai phương pháp làm mất hoạt tính enzyme thường được sử dụng là hấp bằng hơi nước và xử lý nhiệt [8, 25]

Trong phương pháp hấp bằng hơi nước, lá trà sau khi hái sẽ được đưa vào một thiết

bị dạng thùng quay, hơi nước ở khoảng 100oC được xục vào và đảo liên tục, quá trình diệt men hoàn thành sau 2-3 phút Trong phương pháp này, lá trà thường bị hấp thu một lượng quá nhiều nước nên hàm lượng ẩm cao, nên trong quy trình chế biến cần quá trình sấy kéo dài sau đó

Trong phương pháp diệt men bằng nhiệt, lá trà được cho vào thùng sấy nóng hoặc chảo sao, nhiệt độ bề mặt truyền nhiệt khoảng 120-140oC, lá trà được đảo đều Quá trình diệt men kết thúc sau khoảng 4-6 phút, quá trình diệt men bằng nhiệt thường được kết hợp với quá trình sấy sơ bộ bằng cách kéo dài thời gian sấy Phương pháp diệt men bằng nhiệt có điểm hạn chế là nhiệt độ bề mặt quá cao, gây biến tính sản phẩm ở vị trí tiếp xúc, nhiệt độ khối vật liệu không đều và chất lượng sản phẩm thấp [8] Phương pháp này cũng khó chuyển đổi để hoạt động liên tục nên chỉ đựơc áp dụng trong các cơ sở sản xuất quy mô nhỏ Hiện nay đã có nghiên cứu sử dụng năng lượng vi sóng để thực hiện quá trình ức chế enzyme trong sản xuất trà xanh, mặc dù

kết quả mới chỉ ở quy mô phòng thí nghiệm những cho thấy những điểm khả quan

để nghiên cứu mở rộng [22]

Sau khi diệt men, lá trà sẽ được xay nhỏ để tăng diệt tích tiếp xúc và đem trích ly Quá trình xay cắt có thể được thực hiện bằng các máy cắt nguyên liệu thông thường

1.4.2 Phương pháp trích ly [2, 37, 38, 44, 45, 50, 59, 61]

Quá trình trích ly catechin từ trà hiện nay chủ yếu áp dụng phương pháp trích ly bằng dung môi Nguyên tắc của trích ly bằng dung môi là dựa sự thẩm thấu dung môi vào tế bào, chất cần trích ly hoà tan vào dung môi và khuếch tán ra khỏi tế bào Quá trình trích ly kết thúc khi chất cần trích đạt nồng độ cân bằng trong và ngoài tế bào Quá trình trích ly bằng dung môi có ưu điểm là thiết bị đơn giản, có thể xử lý một lượng rất lớn nguyên liệu và có thể thực hiện quy trình liên tục Các yếu tố chính cần lưu ý trong khi thực hiện quá trình trích ly bằng dung môi:

- Lựa chọn dung môi trích ly: dung môi trích ly là các dung môi hoà tan dược hợp

chất cần trích ly Các polyphenol là các hợp chất phân cực, nên chủ yếu sử dụng dung môi phân cực như nước, ethanol, methanol, aceton, ethyl acetate…Phần lớn các tài liệu công bố đều sử dụng dung dịch ethanol hoặc methanol có nồng độ từ 40-

70 % (v/v), hoặc acteon 50 %, khi dùng dưới hoặc trên nồng độ này hiệu quả trích

ly thường thấp Tuy nhiên cũng có một số tài liệu công bố việc sử dụng nước hoặc dung dịch acid loãng để thực hiện trích ly [38, 50, 61]

-Kích thước vật liệu: quá trình trích ly xảy ra chủ yếu do thẩm thấu và khuếch tán

nên kích thước vật liệu càng nhỏ, diện tích tiếp xúc càng lớn và hiệu quả trích ly càng cao

-Nhiệt độ: nhiệt độ cao làm tăng vận tốc và hiệu quả quá trình, tuy nhiên cần lưu ý

để lựa chọn nhiệt độ phù hợp tránh làm oxi hóa catechin cần tách Trong toàn bộ quá trình trích ly, nhiệt độ không nên vượt quá 80oC, một số quy trình thực hiện ở nhiệt độ thấp 5-10oC, 40-50oC, thậm chí 100oC [38, 59]

-Tỷ lệ nguyên liệu : dung môi : tỷ lệ nguyên liệu : dung môi càng nhỏ thì hiệu quả

quá trình trích càng cao Tỷ lệ thường được sử dụng là 1:20 đến 1:30 cho nguyên liệu là trà khô, 1:10 đến 1:20 cho nguyên liệu là trà tươi, tuy nhiên sử dụng nhiều dung môi sẽ gây khó khăn cho các giai đoạn tiếp theo [37, 38, 50, 61]

-Khuấy trộn: khuấy trộn giúp tăng cường hiệu quả trích ly, do tăng cường quá trình

truyền khối

- pH: catechin rất không bền ở pH base, bền ở pH acid Khi thực hiện trích ly ở pH

thấp sẽ tránh được hiện tượng oxi hóa polyphenol và tăng hiệu quả trích ly Tuy nhiên, cũng có nghiên cứu cho rằng ảnh hưởng của pH không làm ảnh hưởng nhiều đến hiệu quả trích ly, chỉ cần đảm bảo trích ly ở pH trung tính hoặc thấp hơn [50]

- Sử dụng chất kháng oxy hóa hỗ trợ: Việc sử dụng các chất kháng oxy hóa bổ sung

như acid arcosbic, acid citric, acid … được cho rằng làm tăng hiệu quả trích ly cũng như làm giảm sự oxy hóa của catechin [44, 45, 61] Nhưng cơ chế quá trình chưa rõ ràng và điều này đạt được sự thống nhất, có ý kiến cho rằng, các catechin từ trà sẽ

bị oxy hóa trước các chất kháng oxy hóa cho vào [61], đồng thời việc bổ sung thêm chất khác sẽ tạo thành tạp chất không mong muốn trong sản phẩm

- Thời gian: quá trình trích ly catechin trong trà được thực hiện trong thời gian rất

khác nhau Một số quy trình chỉ thực hiện quá trình trích ly dưới 30 phút, trong khoảng từ 30 – 60 phút, hoặc kéo dài hơn 100 phút Mặc dù hiệu quả trích ly thường tăng theo thời gian, nhưng việc kéo dài thời gian trích ly lại có điểm bất lợi

về mặt năng lượng [2, 38, 45]

Nhìn chung các quá trình trích ly dung môi thông thường có hiệu quả trích ly không cao, thời gian thực hiện dài, tiêu tốn nhiều dung môi Việc thay đổi các yếu tố liên quan chưa thực sự cải thiện đáng kể cho hiệu quả quá trình

1.4.3 Các phương pháp trích ly hiện đại [17, 29, 30, 35, 39, 59, 61]

Để tăng hiệu quả của quá trình trích ly, các nghiên cứu đã được đưa ra để cải thiện phương pháp trích ly bằng dung môi bằng cách áp dụng các biện pháp hỗ trợ như vi