3 KẾT QUẢ BÀN LUẬN
3.2 Lựa chọn và xử lý nguyên liệu
3.2.1 Điều kiện xử lý mất hoạt tính enzyme
- Lị vi sĩng : Panasonic - Chếđộ năng lượng : High
- Thời gian : 60 giây, 90 giây, 120 giây, 240 giây, 360 giây.
- Lượng mẫu : 200g trà tươi nguyên liệu /1lần, thực hiện trong hộp cĩ nắp đậy kín.
Trà sau khi xử lý được rải đều và được làm mát ở nhiệt độ phịng trong 30 phút, sau
đĩ xay nhỏ, quan sát mức độ biến đổi màu và thực hiện quá trình trích ly để đánh giá hiệu quả quá trình ức chế enzyme.
3.2.1.1 Quá trình biến đổi màu của lá trà sau khi xử lý enzyme
1 - Khơng xử lý sau 5 phút sau 10 phút sau 1 giờ
2 - Xử lý 60 giây sau 5 phút sau 1 giờ sau 4 giờ
3 - Xử lý 90 giây sau 12 giờ 4 – Xử lý 120 giây sau 12 giờ
5 - Xử lý 180 giây sau 12 giờ 6 –Xử lý 240 giây sau 12 giờ
Hình 3.3 Biến đổi màu của lá trà đã được xay nhuyễn sau các khoảng thời gian xử
lý khác nhau
Nhận xét: Lá trà nếu khơng được xử lý diệt men bị oxy hĩa và đổi màu nhanh trong khoảng thời gian ngắn. Sau 5 phút sau khi xay, nhằm phá vỡ cấu tế bào để enzyme cĩ thể tiếp xúc và oxy hĩa các catechin, lá trà đã chuyển bắt đầu chuyển sang màu nâu. Sau 10 phút lá trà hồn tồn chuyển sang màu nâu đậm và chuyển màu nâu đen sau 1 giờ.
Đối với lá trà đã trải qua quá trình làm mất hoạt tính enzyme bằng cách hấp trong lị vi sĩng, sự biến đổi màu thay đổi rõ rệt. Đối với trà đã được xử lý trong khoảng thời gian 60 giây, hiện tượng đổi màu xảy ra rất chậm, sau 5 phút sau khi xay, khơng quan sát thấy màu thay đổi. Tuy nhiên sau 1 giờ, trên mặt lớp trà xuất hiện các vết màu nâu nhỏ, các vết này xuất hiện nhiều hơn sau đĩ và lớp trà chuyển hồn tồn thành màu nâu sau 4 giờ. Hiện tượng biến đổi màu quan sát được như vậy chứng tỏ
quá trình ức chế enzyme đã khơng được thực hiện triệt để, enzyme polyphenol oxidase cịn lại vẫn cĩ khả năng oxi hĩa catechin.
Khi tiến hành xử lý mất hoạt tính trong 90 giây, hiện tượng đổi màu của lá trà sau khi xay hồn tồn biến mất. Trà sau khi xay khơng thay đổi màu sau 12 giờ quan sát, để mẫu liên tục sau 72 giờ, mẫu trà cĩ dấu hiệu khơ do mất nước nhưng vẫn khơng quan sát thấy sự biến đổi màu, như vậy chứng tỏ quá trình làm ức chế
enzyme đã được thực hiện hồn tất.
Khi tăng thời gian xử lý mất hoạt tính lên 120 giây, 180 giây và 240 giây, lá trà sau khi xử lý cĩ dấu hiệu hơi khơ ở mép lá, ở mức thời gian 180 và 240 giây, lá hơi ngả
vàng. Sau khi làm mát và xay, trà sau xử lý cũng khơng thể hiện quá trình biến đổi màu sau 12 giờ quan sát liên tục và sau 72 giờ lưu mẫu. Khi tăng thời gian xử lý, nguyên liệu trà cĩ dấu hiện bị mất ẩm, điều này là một điểm thuận lợi trong quy trình chế biến trà xanh cơng nghiệp vì sẽ làm giảm năng lượng và thời gian sấy ở
các cơng đoạn sau đĩ [22]. Tuy nhiên trong quá trình trích ly, độ ẩm nguyên liệu
đầu giảm dẫn đến khả năng giảm hiệu quả trích ly [50, 60], vì vậy khơng cần thiết phải kéo dài quá trình ức chế enzyme.
Bảng 3.4 Độẩm của nguyên liệu sau khi xử lý ức chế enzyme Thời gian xử lý (giây) Tình trạng lá sau khi xử lý Độẩm nguyên liệu
(sau khi làm mát trong 30 phút) 0 60 90 120 180 240 Xanh, sắc tươi Xanh, sắc tươi, hơi ướt Xanh, sắc tươi, hơi ướt
Xanh, sắc tươi, ướt Xanh, hơi khơ Xanh vàng, hơi khơ, héo
78-82% 75 – 78% 70.5-77% 70-76% 69-74% 68-70%
Như vậy, thời gian xử lý mất hoạt tính enzyme 90 giây là vừa đủ để ức chế hồn tồn hoạt động của enzyme polyphenol oxidase, nguyên liệu sau khi xử lý cĩ thể
dùng để thực hiện quá trình trích ly polyphenol tiếp theo.
3.2.1.2 Hàm lượng catechin trong các mẫu trà ở các điều kiện ức chế enzyme khác nhau (phương pháp MAE)
- Tỷ lệ nguyên liệu : dung mơi : 1:6 (g/ml)
- Dung mơi : ethanol 60o
- Thời gian chiếu vi sĩng : 6 phút (tổng thời gian trích ly 18 phút) - Cơng suất lị vi sĩng : 800W ( lượng dung mơi 250ml)
Khơng xử lý 60 90 120 180 240 (giây)
(dịch trích được pha lỗng với tỉ lệ 1:10)
8.66 9.03 18.18 18.65 17.84 13.72 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 0 60 90 120 180 240 Thời gian xử lý (giây) %c ha át kho â
Đồ thị 3.5 Hiệu quả trích ly catechin theo thời gian xử lý diệt men khác nhau
Nhận xét: Kết quả phân tích cho thấy sự biến đổi của hàm lượng catechin thu
được khi sử dụng nguyên liệu được sử lý khác nhau cho quá trình trích ly. Nguyên liệu khơng được sử lý ức chế enzyme cho kết quả thấp nhất, điều này cũng phù hợp với các kết quả về mức độ biến đổi màu đã nêu trên. Khi xử lý 60 giây, kết quả
phân tích cho thấy hàm lượng thay đổi khơng đáng kể, chứng tỏ quá trình xử lý chưa triệt để, hoạt tính của enzyme vẫn cịn. Khi tăng thời gian xử lý mẫu, hàm lượng catechin thu được tăng rõ rệt, phản ánh kết quả ức chếđã được thực hiện tốt. Mẫu nguyên liệu được xử lý ở mức 90, 120, 180 giây cho hàm lượng tương tự nhau, cho thấy khơng cần thiết phải kéo dài thời gian xử lý mẫu. Trong bảng kết quả, khi thời gian xử lý mẫu tăng lên 240 giây, hàm lượng catechin thu được giảm, điều này cĩ thể do hiệu quả trích ly giảm do độ ẩm giảm. Kết quả này cũng được thể hiện qua màu của dịch trích thu được. Dịch trích trà khi khơng xử lý ức chế enzyme cĩ màu vàng đậm, ánh đỏ, thể hiện màu của các sản phẩm oxy hĩa từ catechin.
Kết luận Như vậy, thời gian xử lý ức chế enzyme phù hợp là 90 giây. Điều kiện này sẽđược sử dụng dể xử lý mẫu nguyên liệu trong các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.2 Sơ bộ hĩa thực vật trong trà
Kết quả xác định định tính các hợp chất trong trà được thể hiện trong bảng sau:
Bảng 3.5 Xác định định tính các thành phần trong nguyên liệu trà Hiện tượng Nhĩm hợp chất Thuốc thử I II III Antraglucosid KOH 10% - - - Flavonoid Shibata - - - Flavan-3-ol Vanillin - - +++ (màu hồng) Acid béo Nhỏ lên giấy lọc +
( cĩ vết loang) + - Alkaloid TT Mayer - + +++ (xuất hiện tủa) Carotenoid H2SO4đđ +++
(dd cĩ màu xanh dương
đậm)
+++ (màu xanh d+ ương nhạt hơn) Tinh dầu Bốc hơiỈ cắn -
( Khơng cĩ mùi thơm) - -
Phytosterol TT Liebermann +
(tách 3 lớp, lớp giữa màu xanh đen)
+ -
Tannin dd FeCl3 2% - (dd màu xanh +
đậm) +++ (dd màu xanh đen) Acid hữu cơ Na2CO3 - - - Đường khử TT Fehling - - - Anthocyanin HCl đđ - - - Saponin Lắc mạnh dung dịch TT Liebermann Phản ứng Pantan + dd HCl lỗng + dd NaOH lỗng - - - - - - - - + (cĩ bọt) + (cĩ vịng xanh lục) + (cĩ bọt, ít) + (cĩ bọt, ít) Acid Uronic Pha lỗng với
ethanol 90o - - -
Chú thích : (- ) thuốc thử âm tính; (+) cĩ mặt nhĩm chất cần xác định; (+++) thể hiện rất rõ (lượng chất cần xác định nhiều); I: Dịch trích kiệt bằng petroleum ether; II: Dịch trích kiệt bằng chloroform; III : Dịch trích kiệt bằng ethanol; TT : thuốc thử; dd : dung dịch.
-Thửđịnh tính Glucosid : Đối với dịch trích bột trà bằng ethanol 70o, xử lý với Chì acetate, lọc bỏ tủa và loại chì acetate dư bằng Na2SO4, lọc, cơ và hồ tan lại trong ethanol 90o. Thuốc thử Tolen và thuốc thử Thymol cho kết quả âm tính.
Nhận xét: Theo kết quả thu được, mẫu trà cho phản ứng định tính rõ ràng với H2SO4đđ (carotenoid) đối với dung dịch I và II, FeCl3 (tannin) đối với dung dịch II và III, Vanillin (flavan-3-ol) đối với dung dịch III, cho kết quả dương với thuốc thử
Liebermann (phytosterol, saponin). Như vậy cĩ thể kết luận sơ bộ, trong trà chứa nhiều hợp chất carotenoid (chủ yếu là chlorophyl), tannin, flavan-3-ol, alcaloid, steroid, phytosterol, saponin. Khi thử định tính saponin, thuốc thử Liebermann cho kết quả dương (vịng xanh lục), khi thử tạo bọt với dung dịch HCl lỗng và NaOH lỗng, cả hai phép thửđều cho kết quả dương tính, cĩ bọt tạo thành bền, tuy nhiên rất ít. Kết quả này phù hợp với các tài liệu đã cơng bố về thành phần các hợp chất trong trà [8, 42, 56, 60].
3.2.3 Hàm lượng catechin trong các mẫu trà nguyên liệu
Các mẫu trà được trích ly theo Sơđồ 2.3, thành phần catechin trong dịch trích được phân tích bằng phương pháp HPLC, kết quả thể hiện trong bảng sau:
Bảng 3.6 Hàm lượng catechin trong các mẫu trà nguyên liệu
Hàm lượng catechin (%chất khơ) STT Giống trà C EC EGCG ECG Tổng Caffein (% chất khơ) 1 LD97 0.87 1.78 9.11 2.56 14.32 2.8 2 PH1 0.39 0.93 12.85 1.92 16.09 3.3 3 HAT 0.19 1.52 16.30 2.48 20.49 3.2 4 LDP1 0.08 1.03 13.57 1.63 16.32 2.5 5 TB14 0.41 1.94 10.09 2.82 15.26 3.1
9.11 12.85 16.30 13.57 10.09 14.32 16.09 20.49 16.32 15.26 0 5 10 15 20 25 LD97 PH1 HAT LDP1 TB14 %c h ấ t k ho â C EC EGCG ECG Tổng
Đồ thị 3.6 Phân bố hàm lượng catechin trong các nguyên liệu khác nhau
Hình 3.5 Phổđồ HPLC của dịch trích trà
Nhận xét : Kết quả phân tích cho thấy hàm lượng catechin của một số giống trà
đang được trồng phổ biến tại Bảo Lộc, Lâm Đồng nằm trong khoảng từ 18 – 22% khối lượng khơ (số 18 – 22% chỉ thể hiện hàm lượng catechin của 4 catechin (EC, C, ECG, EGCG), nên chưa phản ánh đầy đủ hàm lượng catechin tổng của nguyên
liệu trà). Hàm lượng này cho thấy nguyên liệu trà tại khu vực này nằm trong khoảng trung bình của thế giới (cĩ hàm lượng tổng catechin trong khoảng 15 – 30% khối lượng khơ) [8, 11, 60]. Trong các loại trà kể trên, HAT cĩ hàm lượng catechin cao nhất, thích hợp làm nguyên liệu cho các quá trình nghiên cứu tiếp theo.
Theo phổ HPLC, cĩ tất cả 8 peak lớn (peak 6.634 là của caffeine), thể hiện ít nhất 7 loại catechin cĩ mặt trong dịch trích trà, các kết quả này cũng phù hợp với các kết quả đã cơng bố. Tuy nhiên do chỉ cĩ 4 chất chuẩn nên chưa nhận danh đầy đủ các thành phần catechin cĩ mặt trong trà, vì vậy hàm lượng catechin thực trong các nguyên liệu trà cao hơn số liệu nêu trong bảng trên.
Trong số 4 catechin được nhận diện trong các giống trà, C, EC, EGCG, ECG, kết quả cho thấy EGCG cĩ hàm lượng cao nhất, chiếm hơn 50 % tổng catechin đo được (EGCG chiếm đến 80% trong tổng 4 loại catechin ở ba giống trà HAT, PH1 và LPD1, khoảng 65% ở hai giống trà cịn lại). Kết quả này cho thấy thành phần chủ
yếu của nhĩm hợp chất catechin trong trà chủ yếu là các gallate (nếu tính tổng cộng EGCG và ECG, các gallate chiếm hơn 90% tổng 4 loại catechin của trà) và các thành phần gallate đặc trưng cho họ trà do chỉ tìm thấy trong trà. Kết quả tỉ lệ các gallate rất cao trong tổng catechin của trà do tổng hàm lượng catechin thực tế chưa
được định lượng đầy đủ, theo các nghiên cứu thì hàm lượng các gallate chiếm khoảng 60% tổng catechin của trà [8, 10, 60].
Các thành phần catechin và epicatechin chiếm tỉ lệ rất thấp, C chiếm ít hơn 1%, cho thấy thành phần catechin C và EC khơng phải là thành phần đặc trưng của trà, phù hợp với các kết quảđã cơng bố, khi nhiều nghiên cứu tìm thấy catechin C và EC cĩ tỉ lệ cao hơn ở các lồi thực vật khác [54].
Trong số 7 peak thể hiện các catechin, ngồi 4 peak đã được nhận danh, cịn 1 peak lớn ở vị trí thời gian lưu 5.775 phút, dựa vào đặc điểm thời gian lưu, độ phân cực peak này cĩ thể là EGC ((-)-epigallocatechin) [9, 10, 16]. Như vậy, nếu tính cả
chất chính thuộc nhĩm catechin được tìm thấy chủ yếu là EGCG, ECG, EGC, EC, và một số vết của các chất khác.
Hàm lượng caffein (peak 6.634) xác định được trong các nguyên liệu trà tương đối cao (2 – 3%), tương đương với các kết quảđã cơng bố [29, 37, 38, 41].
3.2.4 Hàm lượng một số kim loại cĩ trong mẫu nguyên liệu trà (Phương pháp AS) AS)
Bảng 3.7 Hàm lượng một số kim loại nặng cĩ trong mẫu nguyên liệu trà
-Hàm lượng kim loại tính theo ppm (trên nguyên liệu khơ)
Nhận xét: Kết quả xác định hàm lượng kim loại cho thấy kim loại trong các nguyên liệu trà ở mức trung bình so với các loại trà khác trên thế giới đã cơng bố [33]. Trong đĩ đáng chú ý là các kim loại như Cu, Fe do cĩ tác dụng xúc tác cho quá trình oxi hĩa nên cĩ thể gây ra hiện tượng thúc đẩy quá trình oxi hĩa các catechin trong quá trình trích ly và xử lý dịch trích từ trà, trong kết quả phân tích, hàm lượng các kim loại Cu, Fe tương đối thấp [34].
STT Mẫu Al Ca Cu Fe 1 PH1 163±10 3802±152 12.6±1.1 57.2±5.1 2 LDP1 251±15 4881±222 11.4±1.2 156.8±11.3 3 LD97 262±12 4272±258 13.1±1.2 72.3±4.1 4 HAT 302±18 5598±265 13.6±1.2 59.9±5.4 5 TB14 129±11 3662±189 12.0±0.9 58.4±5.6 STT Mẫu Mg Mn Pb Zn 1 PH1 658±32 152±11 1.1±0.1 15.8±1.2 2 LDP1 675±32 212±18 1.2±0.1 14.1±1.1 3 LD97 670±41 144±12 3.5±0.2 12.6±1.2 4 HAT 703±51 206±14 4.4±0.2 17.0±1.4 5 TB14 648±36 188±15 0.9±0.1 13.1±1.3
16.31 19.36 18.46 19.10 18.10 21.05 20.63 0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 1:04 1:06 1:07 1:08 1:09 1:10 1:12
Tỉ lệ nguyên liệu : dung môi (g/ml)
% ch
ất
k
ho
â
Kết quả cũng cho thấy mức phân bố tương đối đồng đều của các kim loại trong các giống trà khác nhau, khơng xuất hiện trường hợp cá biệt. Điều này cĩ thể do các giống trà đều được trồng trong một khu vực, chịu cùng yếu tố thổ nhưỡng nên khơng thể cĩ sự khác biệt quá lớn về hàm lượng kim loại.
3.3 Đánh giá phương pháp trích ly cĩ hỗ trợ vi sĩng
Các thí nghiệm đề đánh giá phương pháp trích ly cĩ hỗ trợ vi sĩng được tiến hành theo Sơđồ 2.4, kết quả thể hiện trong các phần sau.
3.3.1 Ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu : dung mơi
Tỉ lệ nguyên liệu : dung mơi : Thay đổi từ 1:4 đến 1:12 (g/ml),
Dung mơi : Ethanol 60o,
Thời gian chiếu sĩng : 6 phút, Lượng dung mơi trong bình trích : 250 ml, Cơng suất lị vi sĩng : 800W.
Nhận xét : Khi tăng lượng dung mơi sử dụng, hiệu quả trích ly tăng, điều này thể
hiện rõ nhất khi tăng tỉ lệ nguyên liệu dung mơi từ 1:4 lên 1: 6. Sau đĩ, khi tăng tỉ lệ
này, hiệu quả trích ly khơng cĩ sự biến đổi rõ rệt, kết quả cĩ tăng nhẹ khi tỉ lệ sử
dụng trong thí nghiệm là 1:10 và 1:12. Trong quá trình trích ly bằng dung mơi, lượng dung mơi sử dụng (tính theo lượng nguyên liệu) cần phải đủ để thiết lập cân bằng nồng độ chất cần trích phía trong và phía ngồi tế bào, cĩ nghĩa là tỉ lệ dung mơi càng lớn thì thì hiệu quả trích càng cao. Tuy nhiên khi tăng tỉ lệ dung mơi lên quá cao thì dẫn đến các yếu tố bất lợi như tiêu tốn lượng lớn dung mơi, nồng độ
dịch trích thu được thấp, cần nhiều cơng và năng lượng để tách loại dung mơi trong các bước sau. Trong thí nghiệm. khi tăng tỉ lệ nguyên liệu : dung mơi từ 1: 6 lên 1:10 hiệu quả thu được tăng khơng đáng kể (lượng dung mơi tăng 67%, hiệu quả
tăng 8.7%), hơn nữa, xu hướng tăng khơng được thể hiện ổn định. Như vậy, tỉ lệ
nguyên liệu : dung mơi = 1:6 (g/ml) là phù hợp, tỉ lệ này thấp hơn so với các tỉ lệ
thường dùng ở phương pháp trích ly thường (từ 1:10 đến 1:30) [2, 29, 37, 38, 50], cho phép giảm bớt lượng dung mơi sử dụng. Tỉ lệ 1:6 cũng tương đương với tỉ lệ
1:25 trong tài liệu [29] khi xét đến yếu tố độ ẩm (trong [29], tác giả sử dụng trà xanh thành phẩm cĩ độ ẩm khoảng 7%). Phương pháp vi sĩng cĩ tỉ lệ nguyên liệu : dung mơi thấp hơn cĩ thể do tác động vi sĩng phá vỡ tế bào thực vật (do dung mơi bên trong tế bào hĩa hơi đột ngột, tăng áp suất phá vỡ thành tế bào), giải phĩng chất