3 KẾT QUẢ BÀN LUẬN
3.3.5 Hiệu quả trích ly
Tỉ lệ nguyên liệu : dung mơi : 1: 6 (g/ml)
Dung mơi : Ethanol 60o
Thời gian chiếu sĩng : 6 phút. Lượng dung mơi trong bình trích : 250 ml
Cơng suất lị : 800W
Quá trình trích ly được lặp lại nhiều lần cho đến khi dịch trích khơng tạo phản ứng
định tính đổi màu với thuốc thử FeCl3/ HCl. Trong thí nghiệm, quá trình trích ly
được lặp lại 5 lần.
Nhận xét: Sau 4 lần trích ly liên tiếp, dịch trích ở lần thứ 5 cho phản ứng định tính dương, nhưng kết quả phân tích cho nồng độ dịch trích rất thấp (trong cả phản ứng với Folin - ciocalteu, Prussian Blue và Vanillin – HCl), chứng tỏ hầu hết các polyphenol đã được trích ly. Dịch trích của 4 lần trích ly được sử dụng để đánh giá. Hiệu quả trích ly thu được trong thí nghiệm là 82.46 % cho lần trích đầu tiên (tính trên nồng độ tổng cộng ở các lần trích). Các lần trích ly tiếp theo hiệu qua thu được giảm xuống rõ rệt, 8.91 % cho lần 2, 6.55 % cho lần 3 và 2.08 % cho lần 4. Kết quả
thu được chứng tỏ hiệu quả trích ly rất cao của phương pháp trích ly bằng vi sĩng.
3.3.6 So sánh các phương pháp trích ly khác nhau
4 phương pháp trích ly khác nhau được thực hiện để so sánh hiệu quả, kết quả thể
hiện trong bảng sau: Bảng 3.8 So sánh hiệu quả trích ly của các phương pháp khác nhau Phương pháp trích ly Tổng catechin Hiệu quả (%) Trích ly cĩ hỗ trợ vi sĩng 16.90 (%chất khơ) 82.46% Trích ly thường 13.45 65.64 Trích ly cĩ hỗ trợ siêu âm 12.97 63.30 Ngâm trích 10.12 49.39
Nhận xét : kết quả thí nghiệm cho thấy với phương pháp vi sĩng, hiệu quả trích ly
đạt được là >80 % trong lần trích đầu tiên. Trong các phương pháp khác, hiệu quả
thu được đều thấp, phương pháp trích ly bằng gia nhiệt thường và phương pháp trích ly cĩ hỗ trợ của siêu âm đều cho hiệu quả khoảng 60 %, thấp nhất là phương pháp ngâm trích, hiệu quả đạt được chỉ là 50 % sau 24 giờ ngâm dung mơi ở nhiệt
độ thường.
Kết quả so sánh cho thấy phương pháp trích ly bằng vi sĩng tốt hơn rất nhiều trong quá trình trích ly polyphenol từ trà về cả thời gian (18 phút tổng cộng so với 60 phút phương pháp trích ly thường và trích ly cĩ hỗ trợ siêu âm) và hiệu quả trích ly
(phương pháp trích thường và siêu âm chỉ đạt hiệu quả bằng 80 % so với phương pháp vi sĩng, phương pháp ngâm chỉ cho hiệu quả khoảng 60 % so với phương pháp vi sĩng).
3.4 Tinh chế sơ bộ và đánh giá sản phẩm 3.4.1 Quá trình tinh chế
Dịch trích được thực hiện tinh chế sơ bộ bằng dung mơi và sấy tạo sản phẩm dạng bộ theo Sơ đồ 2.5. Hiệu suất tồn thể quá trình tinh chế tính theo hàm lượng polyphenol tổng vào khoảng trên 80% (Bảng 3.9).
Bảng 3.9 Hiệu suất tinh chế
Dung dịch Hàm lượng polyphenol tổng (phương pháp Folin-ciocalteu) Trước tinh chế 633 ppm (pha lỗng 25 lần)
Dịch nước cịn lại 113 ppm Hiệu suất quá trình 82.15%
Sau khi sấy khơ bằng phương pháp sấy thăng hoa, sản phẩm rắn cuối thu được dạng bột mịn, màu vàng nhạt (Hình 3.7).
Hình 3.7 Sản phẩm polyphenol trà
3.4.2 Tính chất sản phẩm
Bảng 3.10 Tính chất sản phẩm polyphenol thu được
Tính chất Phương pháp đo Kết quả Dạng Cảm quan Bột Màu Cảm quan Vàng nhạt Độ tan - Rất dễ tan Tính hút ẩm - Hút ẩm mạnh, dễ chảy Độẩm Bay hơi ẩm <5 %
Hàm lượng EGCG HPLC 35 % chất khơ
Hàm lượng catechin HPLC 50 % chất khơ
Hàm lượng catechin tổng Vanillin – HCl 70 % (CE) Hàm lượng polyphenol tổng Folin –Ciocalteu 95 % (CE)
Hàm lượng caffeine HPLC 3 % chất khơ
CE (catechin equivalent): tính quy về theo chất chuẩn catechin.
Hình 3.8 Phổđồ HPLC của sản phẩm polyphenol
Trên phổ đồ HPLC cho thấy thành phần catechin và số lượng các peak cũng tương tự như phổ HPLC của dịch trích trà, chứng tỏ phương pháp tính chế sơ bộ được sử
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0 1 2 3 4 5 C(ppm) A 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0 1 2 3 4 5 C(ppm) A
cao. Sản phẩm này cĩ thể sử dụng trực tiếp trong các ứng dụng khác hoặc sử dụng làm nguyên liệu cho các quá trình tinh chế tiếp theo.
3.4.3 Đánh giá hoạt tính kháng oxi hĩa in vitro của sản phẩm
Phương pháp xác định hoạt tính kháng oxy hố in vitro sử dụng gốc tự do DPPH (Phần 2.3.11) được sử dụng đểđánh giá sản phẩm polyphenol thu được từ quy trình tinh chế (Sơđồ 2.5) Đồ thị 3.13 Đồ thị xác định EC50 của vitamin C Đồ thị 3.14 Đồ thị xác định EC50 của sản phẩm polyphenol O HO O OH HO HO Vitamin C
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0 1 2 3 4 C(ppm) A
Đồ thị 3.15 Đồ thị xác định EC50 của chất chuẩn (+)- catechin
Bảng 3.11 Giá trị EC50 trong thử nghiệm hoạt tính quét gốc tự do
STT Mẫu Nồng độ dung dịch EC50 (ppm) EC50 (μM) Mg A/1mg DPPH 1 Polyphenol 260 ppm 1.95 4.26 (*) 0.079 2 (+) - Catechin 236 ppm 1.30 4.48 0.053 3 Vitamin C 272 ppm 2.08 11.82 0.085
(*) Tính tương đương EGCG (M = 458 đvc)
Nhận xét : Kết quả thí nghiệm cho thấy sản phẩm cĩ hoạt tính quét gốc tự do cao hơn so với dung dịch vitamin C ở cùng nồng độ (giá trị EC50 đo được thấp hơn, tỉ
lệ quét gốc tự do 0.079 mg polyphenol/1 mg DPPH so với 0.085 mg vitamin C/1 mg DPPH). So sánh với hoạt tính kháng oxy hố của chất chuẩn (+)- catechin (0.053 mg/1 mg DPPH), hoạt tính kháng oxy hĩa của sản phẩm polyphenol thấp hơn cĩ thể do cịn chứa tạp chất. Trong các nghiên cứu đã cơng bố khác, các chất catechin ở dạng đơn cấu tử hoặc dạng hỗn hợp trích ly từ trà đều cĩ hoạt tính quét gốc tự do cao hơn hẳn so với các chất kháng oxy hĩa đối chứng khác nhu vitamin C, vitamin E, trolox [21, 24, 41, 49, 53, 55].
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0 0.5 1 1.5 2 2.5 C(μM) % Trolox O CH3 HO H3C CH3 CH3 OH O 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0 5 10 15 20 25 30 C(ppm) %
3.4.4 Đánh giá hoạt tính kháng oxi hĩa tiền in vivo của sản phẩm (phương pháp MDA) pháp MDA) Đồ thị 3.16 Đồ thị xác định EC50 của Trolox Đồ thị 3.17 Đồ thị xác định EC50 của sản phẩm polyphenol
Bảng 3.12 Giá trị EC50 trong thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hĩa MDA
STT Mẫu EC50 (ppm) EC50 (μM)
1 Polyphenol 0.784 1.7 (*)
2 Trolox 0.5 2.0
(*) Tính tương đương EGCG (M = 458 đvc)
Nhận xét: Tương tự như kết quả thí nghiệm khảo sát khả năng quét gốc tự do DPPH, thí nghiệm khả năng ức chế oxy hĩa lipid MDA cũng cho thấy sản phẩm cĩ khả năng phản ứng cao hơn so với chất đối chứng là Trolox.
Trong thí nghiệm khả năng ngăn chặn quá trình oxi hĩa lipid, chất kháng oxy hĩa thể hiện khả năng ngăn chặn sự hình thành các gốc tự do từ quá trình oxy hĩa các acid béo như zOH, zOOH, zOR. Các gốc tự do này cĩ hoạt tính cao hơn so với gốc tự DPPH và cĩ kích thước tương đối nhỏ. Kết quả thí nghiệm cũng cho thấy nồng
độ EC50 (1.7 μM) của sản phẩm trong phản ứng ngăn quá trình oxy hĩa lipid cao hơn EC50 (2.0 μM) tương ứng trong phản ứng với gốc tự do DPPH. Điều này cho thấy khả năng chống oxy hĩa lipid, hay trong mơi trường lipid của sản phẩm polyphenol cao hơn trong mơi trường phân cực (methanol trong thí nghiệm với DPPH), và cũng phù hợp với các kết quả đã cơng bố cho rằng các chất catechin, EGCG, ECG cĩ hoạt tính kháng oxy hĩa trong mơi trường ít phân cực, lipid cao hơn so với khả năng quét gốc tự do trong mơi trường phân cực [49, 53, 55].
Kết quả thí nghiệm thể hiện tiềm năng ứng dụng của sản phẩm như một chất kháng oxy hĩa tự nhiên trong nhiều lĩnh vực khác nhau như thực phẩm, mỹ phẩm hay dược phẩm.
3.4.5 Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của sản phẩm
Bảng 3.13 Hoạt tính kháng khuẩn của sản phẩm trên một số chủng vi khuẩn
Nồng độ hoạt chất (ppm) Tên vi khuẩn 1000 500 250 125 62.5 31.25 15.625 Đối chứng Staphylococcus aureus - - - + + + + + MRSA - - + + + + + + Streptococcus Hemolyticus + + + + + + + + Escherichia Coli + + + + + + + + Chú thích: - : ức chế ; + : khơng ức chế
Nhận xét: Sản phẩm cĩ tác động kháng khuẩn lên chủng vi khuẩn gram (+)
Staphylcoccus aureus và MRSA (một chủng vi sinh vật cĩ khả năng kháng lại methicillin), tuy nhiên hoạt tính kháng khuẩn tương đối yếu, nồng độức chế trong thí nghiệm với Staphylcoccus aureus là 250 ppm và trong thí nghiệm với MRSA là 500 ppm. Sản phẩm khơng thể hiện khả năng kháng khuẩn đối với các chủng vi sinh vật gram (-) (Streptococcus Hemolyticus và E.Coli), phù hợp với các kết quả cơng bố trong [9, 19, 46, 51], cho thấy các catechin từ trà cĩ khả năng ức chất các vi khuẩn gram (+) nhưng cĩ rất ít tác dụng lên các vi khuẩn gram (-). Điểm đặc biệt
đáng lưu ý là tác động của sản phẩm mang tính sát khuẩn, ở hàm lượng ức chế trong cả thí nghiệm với Staphylcoccus aureus và MRSA, vi khuẩn khơng thể phát triển sau 72 giờ quan sát. Tuy nhiên số lượng thí nghiệm cịn hạn chếđể cĩ thể đánh giá
4 KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ
Kết luận : Luận văn đã thực hiện được các kết quả sau:
- Đánh giá bốn phương pháp so màu để định lượng hàm lượng tổng polypohenol trong dịch trích trà. Phương pháp so màu được lựa chọn trong phân tích định lượng tổng polyphenol trong quá trình trích ly trà : phương pháp Folin-ciocalteu do cĩ độ ổn định cao, đơn giản và độ nhạy tốt.
- Đánh giá và lựa chọn giống trà nguyên liệu từ năm giống trà đang được trồng tại vùng trà Bảo Lộc – Lâm Đồng. Các nguyên liệu đã được đánh giá về hàm lượng 4 loại catechin (C, EC, EGCG, ECG), hàm lượng caffeine, hàm lượng một số kim loại. Giống trà HAT được chọn làm nguyên liệu trích ly do cĩ hàm lượng catechin cao nhất (20.43% chất khơ)
- Khảo sát quá trình xử lý nguyên liệu và trích ly polyphenol từ búp trà bằng phương pháp cĩ hỗ trợ của vi sĩng.
Quá trình xử lý ức chế enzyme polyphenol oxidase: thời gian xử lý 90 giây, lượng mẫu xử lý 200 g/1 lần, trong hộp đậy kín, chếđộ năng lượng High trong lị vi sĩng gia dụng Panasonic. Thiết lập chếđộ cơng nghệ cho phương pháp trích ly cĩ hỗ trợ
của vi sĩng với các thơng số như sau (sử dụng lị gia dụng Whirlpool): + Tỉ lệ nguyên liệu : dung mơi : 1 : 6 (g/ml).
+ Dung mơi : dung dịch ethanol 60o.
+ Thời gian chiếu sĩng : 6 phút (thực hiện cho chu trình 1 phút chiếu vi sĩng và 2 phút giải nhiệt, tổng thời gian 18 phút).
+ Cơng suất lị vi sĩng : 800W (đối với lị vi sĩng gia dụng và lượng dung mơi cho mỗi lần trích ly là 250ml).
+ Hiệu quả trích ly cao nhất đạt 82.46 % sau 6 phút chiếu vi sĩng (tổng thời gian trích ly 18 phút).
- Tinh chế sơ bộ và tạo chế phẩm dạng bột từ dịch trích trà thu được bằng quy trình tinh chế sử dụng dung mơi. Sản phẩm thu được cĩ hàm lượng EGCG 35%, catechin tổng 70% và polyphenol tổng 95%.
- Khảo sát hoạt tính kháng oxy hĩacủa chế phẩm. Sản phẩm đã được đánh giá hoạt tính quét gốc tự do in vitro và hoạt tính kháng oxy hĩa MDA tiền in vivo, cho thấy sản phẩm cĩ hoạt tính cao hơn các chất kháng oxy hĩa đối chứng trong các phương pháp tương ứng (vitamin C trong phản ứng quét gốc tự do DPPH và Trolox trong phương pháp kháng oxy hĩa tiền in vivo MDA).
- Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn trên 4 chủng vi khuẩn. Sản phẩm thể hiện khả
năng kháng khuẩn yếu đối với hai chủng vi khuẩn gram (+) (Staphylcoccus aureus
và MRSA), khơng cĩ khả năng ức chếđối với vi khuẩn gram (-).
Đề nghị:
- Tiếp tục khảo sát và mở rộng các loại nguyên liệu trà tại Việt Nam, đánh giá thêm các yếu tố thổ nhưỡng, cách trồng trọt, thời điểm và phương pháp thu hoạch lên hàm lượng catechin trong giống trà.
- Triển khai sản xuất thử nghiệm quá trình trích ly trà.
- Nghiên cứu tinh chế dịch trích trà để thu được sản phẩm cĩ hàm lượng catechin cao hơn.
- Nghiên cứu tách, phân lập các catechin.
- Nghiên cứu mở rộng về hoạt tính kháng oxy hĩa của sản phẩm (in vitro, tiền in vivo, in vivo), hoạt tính kháng khuẩn để đánh giá hiệu quả dược học của sản phẩm.
- Nghiên cứu sử dụng sản phẩm trong các sản phẩm thực phẩm, dược phẩm, mỹ
5 TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Lê Thanh Mai, Nguyễn Thị Hiền, Phạm Thu Thuỷ, Nguyễn Thanh Hằng, Lê Thị Lan Chi, Các phương pháp phân tích ngành cơng nghệ lên men, Đại học Bách Khoa Hà Nội, 2005.
2. Nguyễn Thị Kim Oanh, Nghiên cứu trích ly polyphenol từ lá trà để ứng dụng vào thực phẩm và dược phẩm, Luận văn Thạc sĩ, Đại học Bách Khoa Tp.HCM, 2004.
3. Đỗ Ngọc Quý, Cây chè Việt Nam : sản xuất, chế biến và tiêu thụ, Nhà xuất bản Nghệ An, 2003.
4. Hồng Thị Sản, Phân loại thực vật học, Nhà xuất bản giáo dục, 2003.
5. Lê Thị Hồng Nhan, Nghiên cứu chất màu tự nhiên từ cây hoè (Sophora Japonica L.) tại Việt Nam, Luận văn Thạc sĩ, Đại học Bách Khoa Tp.HCM, 2002.
6. Ngơ Văn Thu, Bài giảng dược liệu, BM Dược liệu ĐH Y Dược Tp.HCM, BM Dược liệu ĐH Y Dược Hà Nội, Hà Nội, 1998.
7. Andre Loupy, Trần Kim Quy, Lê Ngọc Thạch, Phương pháp học mới về
tổng hợp hữu cơ, Trường Đại học KHTN, 1995.
8. Tống Văn Hằng, Cơ sở sinh hĩa và kĩ thuật chế biến trà, Tp.HCM, 1985. 9. Irena Vovk, Breda Simonovska, Heikki Vourela, Separation of eight selected
flavan–3–ols on cellulose thin layer chromatographic plates, Journal of Chromotography A 1077, p188 – 194, 2005.
10. Lawrance Peter Wright, Biochemical analysis for identification of quality in balck tea (Camellia sinensis), Doctoral Thesis, University of Pretoria, South Africa, 2005.
11. Liang Chen, Zhi Xiu Zhou, Variations of main quality components of tea genetic resources (Camellis sinensis (L.) O.Kuntze) preserved in the China National Germplasm tea repository, Plants food for human nutrition 60, p 31-35, 2005.
12. Zohar Kerem, Hilla German-Shashoua, Oded Yarden, Microwave-assisted extraction of bioactive saponins from chickpea (Cicer arietnum L.), J. Sci Food Agric 85, 406 – 412, 2005.
13. D.I. Tsimigiannis, V.Oreopoulou, Free radical scavenging and antioxidant activity of 5,7,3’,4’ – hydroxy substituted flavonoids, Innovative food science and emerging technologies 5, p 523 – 528, 2004.
14. Joung Ho Ko, Gyoung Won Kang, You Jin Seo, Won Jo Cheong, C18 attached silica monolith microcolumns made in stainless steel tubing and their application in analysis of flavonoids in green tea extracts, Bull. Korean Chem. Soc. 25, No. 10 1589, 2004.
15. Jan Wollgast, The contents and effects of polyphenols in chocolate, qualitative and quantitative analys of polyphenols in chocolate and chocolate raw products as well as evaluation of potential implications of chocolate consumption in human health, Doctoral thesis, Jutus Liebig University of Giessen, Germany, 2004.
16. Kai On Chu, Chi Chiu Wang, Micheal Scott Rogers, Kwong Wai Choy, Chi Pui Pang, Determination of catechins and catechin gallates in biological fluids by HPLC with colormetric array detection and solid phase extraction, Analytica Chimica Acta 510, p 69 – 76, 2004.
17. Lallie C. McKenzie, John E. Thompson, Randy Sullivan, James E. Hutchison, Green chemical processing in the teaching laboratory: a convenient liquid CO2 extraction of natural products, Green Chem. 6, p 355 – 358, 2004.
18. S. Azam, N. Hadi, N.U. Khan, S.M. Had, Prooxidant property of green tea polyphenols epicatechin and epigallocatechin-3-gallate: implications for anticancer properties, Toxicology in Vitro 18, p 555–561, 2004.
19. Stapleton PD, Shah S, Anderson JC, Hara Y, Hamilton-Miller JM, Taylor PW. Modulation of beta-lactam resistance in Staphylococcus aureus by catechins and gallates. Int J Antimicrob Agents 23(5), p 462- 467, 2004. 20. Xu Jinze, Tea catechins : Epimerization, antioxidant activity and effect on
body fatness in rats, Doctoral Thesis, The Chinese University of Hong Kong, 2004
21. Yasi Saffari, S.M. Hossein Sadrzedeh, Green tea matabolite EGCG protects membranes against oxidative damage in vivo, Life Sciences 74, p 1513 – 1518, 2004.
22. Ashu Gulati, Renu Rawat, Brajinder Singh, S.D. Ravindranath, Application