Trà đã được sử dụng như là một phương thuốc trong y học phương đơng từ rất lâu. Tuy nhiên các hiểu biết về cơ chế tác động của trà mới được bắt đầu nghiên cứu mạnh mẽ trong thế kì 20. Trước đây, các tác dụng của trà được cho rằng là do tác
động của thành phần caffeine và vitamin C. Bắt đầu từ khoảng thập niên 70 của thế
kỉ 20, việc nghiên cứu chi tiết về trà đã chỉ ra rằng những tác dụng về mặt dược lý của trà là do sự cĩ mặt rất nhiều của các nhĩm hợp chất catechin trong trà. Nhiều cơng trình đã cơng bố về tác dụng của trà và các chất trích ly từ trà lên nhiều bệnh khác nhau như các bệnh ung thư, bệnh vềđường tim mạch, bệnh tiểu đường, bệnh Alzheimer, bệnh Parkison, bệnh béo phì, bệnh sỏi thận, bệnh về đường tiêu hĩa, bệnh răng miệng…; ngồi ra, trà cịn cĩ tác dụng giảm hàm lượng cholesterol, làm giảm sự nhiễm độc do kim loại, do phĩng xạ….
Tác dụng ngăn chặn và chữa trị bệnh ung thư của trà và các hợp chất catechin được nghiên cứu mạnh mẽ nhất. Khi tiến hành nghiên cứu in vivo, nhiều cơng trình cơng bốđã cho thấy trà và các chất trích ly từ trà như EGCG, EGC, ECG ..của trà cĩ khả
của tế bào ung thư. Trong giai đoạn khơi mào, các hợp chất catechin trung hồ các tác nhân bị kích hoạt bởi cytochrome P450 enzyme, các tác nhân này cĩ khả năng tương tác làm thay đổi cấu trúc của ADN; ngăn chặn sự tạo thành nitrosamine, một nhĩm các hợp chất phát sinh từ khĩi thuốc lá, các amine dị vịng trong thịt, cá nấu chín, các tác nhân được cho là cĩ thể gây ung thư. Các thử nghiệm in vivo cho thấy khả năng tương tác trực tiếp và tăng cường hiệu quả của EGCG, EC vào hệ thống bảo vệ bằng enzyme của tế bào, hạn chế sự hình thành của các tác nhân gây biến đổi trong tế bào.
Trong giai đoạn bắt đầu của tế bào ung thư, EGCG cĩ khả năng ức chế AP-1, một chất dẫn truyền khơi mào cho sự phát triển của tế bào ung thư da; thể hiện khả năng ngăn chặn protein kinase, enzyme kích hoạt tế bào trong giai đoạn phát triển của tế
bào ung thư, ức chế hoạt động của telomerase, làm giảm thời gian sống của tế bào ung thư.
Khi quá trình ung thư đã diễn ra, EGCG cĩ thể can thiệp, ức chế hoạt động của urokinase, enzyme đĩng vai trị quan trọng trong quá trình phát triển và biến đổi của tế bào ung thư, phá huỷ các dạng biến đổi đặc thù của tế bào gây ra do adevirus, hay ngăn chặn quá trình tổng hợp ADN trong tế bào ung thư hepatoma, leukemia, và ung thư phổi…
Các kết quả nghiên cứu in vivo, và các kết quả nghiên cứu trên động vật như chuột, thỏ đều cho kết quả rất tốt về khả năng ngăn chặn ung thư của trà và các chất catechin, tuy nhiên kết quả nghiên cứu trên người vẫn chưa cho thấy hiệu quả tương tự. Một số cơng trình cơng bố catechin và trà cĩ khả năng ngăn chặn ung thư ở
người như ung thư vịm họng, ung thưđường tiêu hĩa, làm giảm khối u ung thư vú [51]…tuy nhiên kết quả cũng mới mang tính cục bộ, chưa đạt được sự thống nhất cao.
1.3.2 Hoạt tính kháng oxy hĩa của nhĩm catechin [18, 21, 32, 36, 42, 51]
1.4.2.1 Quá trình oxy hĩa và nguyên nhân gây bệnh do mất cân bằng oxy hĩa
Theo các nghiên cứu đã được cơng bố, các bệnh như ung thư, tim mạch, lão hĩa … cĩ liên hệ rất gần với các quy luật về quá trình oxy hĩa trong tế bào sống. Các quá trình oxy hĩa, diễn ra dưới tác dụng của các gốc tự do, trong tế bào là cần thiết để
tạo ra năng lượng hoặc trong các quá trình tổng hợp nucleic acid, protein, hormon.... Gốc tự do là những hợp chất hoạt động mạnh, được tạo ra trong cơ thể trong quá trình trao đổi chất hay được đưa vào từ bên ngồi do vi sinh vật hay vi rút. Các gốc tự do được tạo thành gồm các gốc cĩ hoạt tính cao như hydroxyl zOH, ion sắt (Fe2+O), Cu(OH)2, những gốc tự do hoạt tính trung bình và yếu như superoxide anion O2z, peroxyl (ROOz), hydrogen peroxide H2O2, singlet oxy (O1), nitric oxide (NOz), peroxynitrite (ONOO-), alkoxyl (ROz)…. Gốc tự do trong tế bào sinh ra trong quá trình sinh dưỡng được kiểm sốt chặt chẽ thơng qua quá trình kháng oxy hĩa nội tại bằng các hợp chất như glutathione, vitamin E, vitamin C và enzyme superoxide dismutase, ngồi ra cơ thể cịn cĩ các tế bào như neutrophil, monocyte, B-cell… cĩ khả năng chống lại các yếu tố oxy hĩa ngoại lai xâm nhập.
Tuy nhiên, trong tế bào cĩ thể xuất hiện hiện tượng các gốc tự do được tạo ra quá nhiều do mất cân bằng trong hoạt động hoặc do các yếu tố bên ngồi như các chất
độc, do nhiễm vi sinh vật, do ozone, bức xạ UV, nhiễm phĩng xạ, do thuốc lá....Các gốc tự do dư thừa, khi cơ thể thiếu các yếu tố bảo vệ để ngăn chặn, cĩ khả năng tương tác, phá hủy màng lipid khơng bão hồ của tế bào, làm giảm khả năng bảo vệ
tế bào, dẫn đến sự xâm nhập của các tác nhân gây bệnh từ bên ngồi; oxi hĩa các nucleic base làm thay đổi cấu trúc ADN, dẫn đến các quá trình đột biến, phát sinh các khối u, ung thư; làm hỏng cấu trúc các protein mang nhĩm SH (các protein này
đĩng vai trị rất quan trọng như là chất mang hoặc chất hoạt hĩa enzyme trong quá trình hơ hấp), gây ra các bệnh nghiêm trọng vềđường hơ hấp….
Các gốc tự do dư thừa là nguồn gốc phát sinh các bệnh nguy hiểm nên các nghiên cứu đều hướng tới việc khảo sát khả năng kháng oxy hĩa, quét gốc tự do trong quá
trình tìm kiếm các hợp chất trong thiên nhiên cĩ khả năng ngăn chặn hoặc chữa bệnh.
1.4.2.2 Tính kháng oxy hĩa của nhĩm hợp chất catechin [5, 13, 21, 24, 28, 34, 41, 49, 51, 53, 55]
Cơng thức hĩa học của các flavonoid với sự cĩ mặt của các hydrogen phenolic thể
hiện khả năng kháng oxy hĩa mạnh. Cơng thức cấu tạo catechin với nhiều nhĩm hydroxyl (5 nhĩm ở các catechin, 6 ở các gallocatechin, 8 ở các catechin gallate và 9 ở các gallocatechin gallate) đảm bảo khả kháng oxy hĩa rất mạnh của nhĩm hợp chất catechin.
Khi thực hiện khảo sát khả năng khảo sát trên các gốc tự do tổng hợp như DPPH, ABTS…, các catechin thể hiện hoạt tính vượt trội so với các chất kháng oxy hĩa đối chứng như vitamin C, vitamin E, trolox (các catechin thể hiện hoạt tính mạnh hơn từ 3 đến 6 lần). Hoạt tính kháng oxy hĩa của nhĩm catechin thể hiện một sự khác biệt về mối tương quan cấu trúc so với các hợp chất khác họ flavonoid. Khi so sánh với hợp chất flavonoid cĩ hoạt tính quét gốc tự do mạnh nhất trong mơi trường phân cực quercetin (do đặc điểm cấu trúc của quercetin cĩ nhĩm 4-oxo và nối đơi tại vị
trí carbon số 2 và 3 cho phép hình thành sự liên hợp giữa vịng A và vịng B giúp giải toảđiện tử tự do, 3 nhĩm hydroxyl 3,5,7 và hai nhĩm ortho-hydroxyl trên vịng B [5, 13, 49]), các hợp chất C và EC, do trong cơng thức thiếu sự liên hợp giữa vịng A và vịng B, cĩ hoạt tính quét gốc tự do kém hơn, nhưng các gallate catechin như EGCG và ECG cĩ hoạt tính trội hơn. Sự khác biệt về khả năng của EGCG và ECG được giải thích dựa trên số lượng lớn các nhĩm hydroxyl trong cơng thức, cho phép tiếp nhận electron dễ dàng hơn [13].
Hoạt tính kháng oxi hĩa của các catechin trong trà, tính theo tỷ lệ mol, trong thử
nghiệm chống lại sự hình thành các gốc tự do DPPH trong dung dịch nước được xếp theo trật tự giảm dần như sau: epicatechin gallate ≈ epigallocatechin gallte > epigallocatechin > gallic acid > epicatechin ≈ catechin [49]. Với hàm lượng
O OH OH OH HO OH O OH OH O HO OH O OH OH O HO OH H O O COOH HO OH O O O OH O O OH OH O HO OH O HO R. RH 2H. MeOH 3H.
catechin tổng chiếm khoảng 30% khối lượng khơ, trà và dịch trích trà cũng thể hiện tính kháng oxy hĩa rất mạnh trong các thử nghiệm, kết quả tính tốn cho thấy thành phần catechin đĩng gĩp khoảng 70-80% khả năng kháng oxy hĩa của trà [49, 51].
Hình 1.8 Biến đổi của catechin trong quá trình quét gốc tự do [49]
Khi tiến hành thử nghiệm khả năng kháng oxy hĩa trong mơi trường lipid như
chống oxy hĩa lipid màng tế bào (LDL), chống oxy hĩa các acid béo, hay quét các gốc tự do superoxyl, hydroxyl… trong mơi trường lipid ở các thử nghiệm in vitro và
in vivo, các hợp chất catechin đều thể hiện khả năng phản ứng rất mạnh, mạnh hơn nhiều so với trolox, vitamin E,C và cả quercetin [17, 19, 26, 28, 39]. Do đặc điểm gần với mơi trường trong cơ thể sống, các thử nghiệm kháng oxy hĩa trong mơi trường lipid mơ tả đầy đủ hơn triển vọng ứng dụng dược lý của các hợp chất. Đối với khả năng ức chế quá trình peroxide lipid, các catechin của trà được xếp theo trật tự sau: EGCG > ECG > EGC > EC; khả năng quét gốc tự do sinh ra trong quá
trình peroxide lipid thì ECG > EGCG > EC > EGC; khả năng quét gốc tự do zOH giảm theo trật tự ECG > EC > EGCG >> EGC [21, 41, 49, 53, 55].
Các kết quả khả quan nĩi trên đã mở ra nhiều hướng nghiên cứu về tác dụng cụ thể
của các hợp chất catechin lên các bệnh ở người và khả năng sử dụng trong quá trình ngăn ngừa và chữa trị bệnh.
1.3.3 Ứng dụng khả năng kháng oxy hĩa của trà và các chất trích ly từ trà [2, 42, 43, 45] 42, 43, 45]
Ứng dụng được quan tâm mạnh mẽ nhất hiện nay của nhĩm các hợp chất catechin là về khả năng dược lý. Nhưng ngồi ra, khả năng ngăn chặn cĩ hiệu quả các quá trình oxy hĩa, đặc biệt là quá trình oxy hĩa lipid, nhĩm chất này cịn được quan tâm sử dụng trong các sản phẩm thuộc các lĩnh vực khác như mỹ phẩm và thực phẩm. Trong các lĩnh vực này, do đặc điểm xuất phát từ thiên nhiên, an tồn, trà và các chất từ trà đang được sử dụng chủ yếu như một phụ gia chống oxy hĩa nhằm thay thế các phụ gia tổng hợp thường dùng khác như BHT, BHA…. Trong mỹ phẩm, trà và các chất từ trà được bổ sung vào các sản phẩm như chăm sĩc cá nhân (kem đánh răng, kem dưỡng da, sữa tắm…), các sản phẩm tẩy rửa (nước rửa chén, sữa tắm, dầu gội…), sản phẩm tẩy mùi, diệt khuẩn nhẹ…Trong thực phẩm, ngồi khả năng kháng oxy hĩa trong các sản phẩm như bánh kẹo.., trà cịn được sử dụng như một dạng thực phẩm chức năng nhằm tăng cường khả năng phịng bệnh của cơ thể.
1.4 Trích ly polyphenol từ trà
Do đặc điểm về hàm lượng polyphenol trong trà, nên các quá trình trích ly polyphenol từ trà thường được hiểu là trích ly nhằm thu sản phẩm là nhĩm các hợp chất catechin. Hiện nay, sản phẩm catechin từ trà đã được sản xuất ở quy mơ cơng nghiệp ở các nước như Trung Quốc, Nhật Bản, Ấn Độ…, sản lượng chế biến hàng năm rất lớn [42, 43]. Nhìn chung, quy trình trích ly từ trà để tạo thành sản phẩm thơ hay dịch trích cũng tương đối đơn giản, khơng địi hỏi nhiều thiết bị phức tạp. Hiện
nay, trong cơng nghiệp vẫn sử dụng các phương pháp trích ly dung mơi thơng dụng
để thu sản phẩm thơ ban đầu. Sơđồ của quá trình được mơ tả trong sơ đồ sau.
Sơđồ 1.2 Sơđồ quá trình trích ly [50]
1.4.1 Lựa chọn và chuẩn bị nguyên liệu [8, 11, 22, 25, 29, 37, 50]
Nguyên liệu trà dùng để trích ly catechin cĩ thể dùng trà tươi, trà xanh bán thành phẩm hoặc trà xanh thành phẩm, trà oolong. Nếu dùng sản phẩm trà bán thành phẩm hoặc thành phẩm cần phải sử dụng loại trà đã trải qua quá trình ức chế enzyme để đảm bảo hàm lượng catechin. Việc sử dụng trà xanh hoặc trà oolong làm nguyên liệu bị hạn chế do giá thành cao và chất lượng khơng ổn định. Việc lựa chọn nguyên liệu ảnh hưởng rất lớn đến kết quả trích ly polyphenol từ trà do đặc điểm phân bố
hàm lượng catechin khơng đồng đều, phụ thuộc rất nhiều vào giống trà, thổ nhưỡng, thời điểm thu hái, cách bảo quản trước khi sử dụng...
Trà tươi nguyên liệu Diệt men Nghiền nhỏ Trích ly Lọc Bã Dịch trích Tinh chế Dạng sản phẩm thích hợp
Trong thành phần của trà, búp trà và lá non cĩ hàm lượng catechin cao nhất. Trong quá trình phát triển, dưới tác dụng của enzyme polyphenol oxidase, các catechin sẽ
chuyển dần về các dạng hợp chất tannin cĩ phân tử lớn, nên trong các lá già, hàm lượng catechin rất thấp và khơng cĩ ý nghĩa trong việc trích ly catechin. Vì vậy trà tươi, nguyên liệu của quá trình chế biến sản phẩm trà, được sử dụng trong quá trích ly.
Trong lá trà tươi, hợp chất catechin được tổng hợp và nằm trong tế bào lá, và được giữ khơng tiếp xúc với enzyme polyphenol oxidase. Khi cĩ tác dụng cơ học như vị, xay nghiền… làm vỡ cấu trúc tế bào và giải phĩng các enzyme, enzyme sẽ tiếp xúc và oxy hĩa nhanh chĩng các catechin, vì vậy trước khi thực hiện quá trình trích ly cần phải cĩ giai đoạn làm mất hoạt tính enzyme. Hiện nay, trong cơng nghiệp chế
biến trà nĩi chung, hai phương pháp làm mất hoạt tính enzyme thường được sử
dụng là hấp bằng hơi nước và xử lý nhiệt [8, 25].
Trong phương pháp hấp bằng hơi nước, lá trà sau khi hái sẽđược đưa vào một thiết bị dạng thùng quay, hơi nước ở khoảng 100oC được xục vào và đảo liên tục, quá trình diệt men hồn thành sau 2-3 phút. Trong phương pháp này, lá trà thường bị
hấp thu một lượng quá nhiều nước nên hàm lượng ẩm cao, nên trong quy trình chế
biến cần quá trình sấy kéo dài sau đĩ.
Trong phương pháp diệt men bằng nhiệt, lá trà được cho vào thùng sấy nĩng hoặc chảo sao, nhiệt độ bề mặt truyền nhiệt khoảng 120-140oC, lá trà được đảo đều. Quá trình diệt men kết thúc sau khoảng 4-6 phút, quá trình diệt men bằng nhiệt thường
được kết hợp với quá trình sấy sơ bộ bằng cách kéo dài thời gian sấy. Phương pháp diệt men bằng nhiệt cĩ điểm hạn chế là nhiệt độ bề mặt quá cao, gây biến tính sản phẩm ở vị trí tiếp xúc, nhiệt độ khối vật liệu khơng đều và chất lượng sản phẩm thấp [8]. Phương pháp này cũng khĩ chuyển đổi để hoạt động liên tục nên chỉ đựơc áp dụng trong các cơ sở sản xuất quy mơ nhỏ. Hiện nay đã cĩ nghiên cứu sử dụng năng lượng vi sĩng để thực hiện quá trình ức chế enzyme trong sản xuất trà xanh, mặc dù
kết quả mới chỉ ở quy mơ phịng thí nghiệm những cho thấy những điểm khả quan
để nghiên cứu mở rộng [22].
Sau khi diệt men, lá trà sẽ được xay nhỏđể tăng diệt tích tiếp xúc và đem trích ly. Quá trình xay cắt cĩ thể được thực hiện bằng các máy cắt nguyên liệu thơng thường.
1.4.2 Phương pháp trích ly [2, 37, 38, 44, 45, 50, 59, 61]
Quá trình trích ly catechin từ trà hiện nay chủ yếu áp dụng phương pháp trích ly bằng dung mơi. Nguyên tắc của trích ly bằng dung mơi là dựa sự thẩm thấu dung mơi vào tế bào, chất cần trích ly hồ tan vào dung mơi và khuếch tán ra khỏi tế bào. Quá trình trích ly kết thúc khi chất cần trích đạt nồng độ cân bằng trong và ngồi tế
bào. Quá trình trích ly bằng dung mơi cĩ ưu điểm là thiết bị đơn giản, cĩ thể xử lý một lượng rất lớn nguyên liệu và cĩ thể thực hiện quy trình liên tục. Các yếu tố
chính cần lưu ý trong khi thực hiện quá trình trích ly bằng dung mơi:
- Lựa chọn dung mơi trích ly: dung mơi trích ly là các dung mơi hồ tan dược hợp chất cần trích ly. Các polyphenol là các hợp chất phân cực, nên chủ yếu sử dụng