3 KẾT QUẢ BÀN LUẬN
3.1.3 Đánh giá các phương pháp
- Độ lựa chọn
Trong thí nghiệm, bốn phương pháp được lựa chọn để thực hiện: hai phương pháp Folin–ciocalteu và Prussian Blue là hai phương pháp tạo màu tổng quát cho nhĩm phenolic, khơng đặc trưng cho catechin, các nhĩm flavonoid, phenolic hay tannin khác vẫn cĩ khả năng phản ứng; hai phương pháp Vanillin-HCl, Diazotized đặc trưng và cĩ độ lựa chọn cao cho nhĩm catechin (flavan-3-ol) [23, 47]; thí nghiệm cũng cho thấy thuốc thử Folin và Prussian Blue phản ứng với acid gallic trong khi vanillin và diazo khơng phản ứng.
Bảng 3.1 Độ lựa chọn của phương pháp
Phương pháp Catechin Acid gallic
Folin – ciocalteu x (phản ứng) x
Prussian Blue x x
Vanillin – HCl x O (khơng phản ứng)
Diazotized x O
- Độ tuyến tính
Theo các kết quả thí nghiệm, các phương pháp đều cho các đường hồi quy tuyến tính từ số liệu thực nghiệm cĩ độ tuyến tính rất cao (các giá trị R2 đều lớn hơn 0.9; phần lớn đều lớn hơn 0.99, trừ một trường hợp của phương pháp Vanillin – HCl,
đường chuẩn trong dung mơi nước cĩ R2 = 0.9897). Với độ tuyến tính rất cao như
vậy, các đường chuẩn đều phù hợp để sử dụng trong đánh giá định lượng.
- Độổn định
Trong quá trình tiến hành thí nghiệm, khi khảo sát với các loại dung mơi khác nhau (bốn loại dung mơi pha chuẩn đã được sử dụng bao gồm nước, ethanol 60o, ethanol 99.5o và methanol), trong hai phương pháp khơng cĩ lựa chọn cao là Folin-ciocalteu và Prussian Blue, phương pháp Folin-ciocalteu cho kết quả đạt độ ổn định cao, kết
quả rất ít bị ảnh hưởng của dung mơi. Các đường chuẩn đối với các loại dung mơi sử dụng trong phương pháp Folin-ciocalteu cĩ phương trình rất gần nhau, hệ số gĩc a biến đổi rất ít. Phương pháp Prussian Blue đạt độ ổn định thấp hơn, các đường chuẩn trên hệ toạđộ cho thấy sự thay đổi khi thay đổi dung mơi. Mặc dù vậy, hệ số
gĩc trong các phương trình hồi quy biến đổi khơng đáng kể.
Hai phương pháp cĩ độ lựa chọn cao Vanillin – HCl và Diazotized cho kết quả trái ngược. Phương pháp Diazotized ít bịảnh hưởng bởi dung mơi, các phương trình hồi quy gần nhau. Phương pháp Vanillin - HCl bị ảnh hưởng rất lớn khi thay đổi dung mơi, các đường chuẩn biến đổi trong một khoảng rộng, điều này cũng phù hợp với theo các kết quả nghiên cứu, ngồi ra các kết quả cơng bố cho thấy phương pháp Vanillin - HCl cịn bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ phản ứng, thời gian phát triển màu…[23].
Trật tự sắp xếp của các phương pháp theo độ ổn định giảm dần như sau: Folin - ciocalteu ≈ Diazotized > Prussian Blue > Vanillin – HCl.
- Độ nhạy
Các phương pháp được thử nghiệm đều được dùng phân tích định tính nên cĩ độ
nhạy rất cao. Theo kết quả thực nghiệm, nồng độ chất chuẩn để giá trịđộ hấp thu A
đạt 0.1 được thể hiện trong bảng sau:
Bảng 3.2 Độ nhạy của phương pháp Phương pháp Nồng độ chuẩn để A đạt 0.1 (ppm) Folin – ciocalteu 0.93 ± 0.10 Prussian Blue 0.14 ± 0.02 Vanillin – HCl 8.01 ± 0.02 Diazotized 0.70 ± 0.10
nhạy khơng đủ để xác định các mẫu cĩ nồng độ thấp dưới 10ppm, nên phải lưu ý khi pha lỗng mẫu, các phương pháp cịn lại đều cho kết quả tốt, phù hợp với việc sử dụng trong phân tích định tính.
- Mức độ phức tạp
Các phương pháp được lựa chọn tương đối đơn giản về sự chuẩn bị và thao tác khi tiến hành. Trong số bốn phương pháp, phương pháp Folin - ciocalteu ít phức tạp nhất về mặt hĩa chất và thao tác thực hiện; phương pháp Prussian Blue sử dụng 3 hĩa chất khác nhau, trong đĩ chất ổn định được sử dụng vào thời điểm cuối cùng trước khi đo, nên phải khống chế chặt chẽ thời gian trong quá trình thực hiện để
tránh gây hiện tượng khơng thống nhất về mặt thời gian giữa các mẫu; phương pháp Vanillin-HCl địi hỏi phải pha hĩa chất mới mỗi ngày do hĩa chất dễ bị biến đổi; phương pháp Diazotized cần phải chuẩn bị thuốc thử diazo, quy trình tổng hợp diazo chưa được thực hiện ổn định, hiệu suất tổng hợp thấp và sản phẩm dễ bị phân hủy và cũng địi hỏi phải pha mới dung dịch diazo mỗi ngày.
Bảng 3.3 Đánh giá các phương pháp so màu trong phân tích định lượng catechin tổng Phương pháp Độ lựa chọn Độ tuyến tính Độổn định Độ nhạy Mức độ phức tạp Folin ciocalteu Khơng lựa chọn
Cao Cao Cao Đơn giản
Prussian Blue Khơng lựa chọn Cao Thấp hơn Folin Cao Phải kiểm sốt thời gian tốt Vanillin HCl
Lựa chọn Cao Khơng Cao Phải chuẩn bị hĩa chất mới mỗi ngày
Diazotized Lựa chọn Cao Cao Cao
Phải tổng hợp thuốc thử, chuẩn bị hĩa chất
Như vậy để đánh giá chính xác hàm lượng polyphenol tổng trong dịch trích trà, khơng cĩ phương pháp nào thỏa mãn đầy đủ các tiêu chuẩn đặt ra. Tuy nhiên phương pháp Folin-ciocalteu phù hợp để đánh giá nhanh hiệu quả của quá trình trích ly, nếu sử dụng thống nhất nguyên liệu và thực hiện quá trình ức chế hoạt động của enzyme tốt. Phương pháp Diazotized, mặc dù cĩ các đặc điểm vềđộổn định, độ
nhạy, độ lựa chọn rất tốt nhưng do thuốc thử chưa đủ ổn định để sử dụng. Phương pháp Vanillin-HCl, tuy mức độổn định khơng cao nhưng lựa chọn riêng cho nhĩm catechin và tương đối đơn giản hơn phương pháp Diazotized, nên khi sử dụng kết hợp với phương pháp Folin-ciocalteu sẽ cung cấp thêm thơng tin về hàm lượng tương đối của các catechin trong mẫu.
Phương pháp Folin-ciocalteu với đường chuẩn catechin pha trong dung mơi ethanol 60o sẽđược sử dụng để xác định hàm lượng polyphenol tổng của các mẫu dịch trích trong quá trình trích ly.