3 KẾT QUẢ BÀN LUẬN
3.4.4 Đánh giá hoạt tính kháng oxi hĩa tiền in vivo của sản phẩm (phương pháp
pháp MDA) Đồ thị 3.16 Đồ thị xác định EC50 của Trolox Đồ thị 3.17 Đồ thị xác định EC50 của sản phẩm polyphenol
Bảng 3.12 Giá trị EC50 trong thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hĩa MDA
STT Mẫu EC50 (ppm) EC50 (μM)
1 Polyphenol 0.784 1.7 (*)
2 Trolox 0.5 2.0
(*) Tính tương đương EGCG (M = 458 đvc)
Nhận xét: Tương tự như kết quả thí nghiệm khảo sát khả năng quét gốc tự do DPPH, thí nghiệm khả năng ức chế oxy hĩa lipid MDA cũng cho thấy sản phẩm cĩ khả năng phản ứng cao hơn so với chất đối chứng là Trolox.
Trong thí nghiệm khả năng ngăn chặn quá trình oxi hĩa lipid, chất kháng oxy hĩa thể hiện khả năng ngăn chặn sự hình thành các gốc tự do từ quá trình oxy hĩa các acid béo như zOH, zOOH, zOR. Các gốc tự do này cĩ hoạt tính cao hơn so với gốc tự DPPH và cĩ kích thước tương đối nhỏ. Kết quả thí nghiệm cũng cho thấy nồng
độ EC50 (1.7 μM) của sản phẩm trong phản ứng ngăn quá trình oxy hĩa lipid cao hơn EC50 (2.0 μM) tương ứng trong phản ứng với gốc tự do DPPH. Điều này cho thấy khả năng chống oxy hĩa lipid, hay trong mơi trường lipid của sản phẩm polyphenol cao hơn trong mơi trường phân cực (methanol trong thí nghiệm với DPPH), và cũng phù hợp với các kết quả đã cơng bố cho rằng các chất catechin, EGCG, ECG cĩ hoạt tính kháng oxy hĩa trong mơi trường ít phân cực, lipid cao hơn so với khả năng quét gốc tự do trong mơi trường phân cực [49, 53, 55].
Kết quả thí nghiệm thể hiện tiềm năng ứng dụng của sản phẩm như một chất kháng oxy hĩa tự nhiên trong nhiều lĩnh vực khác nhau như thực phẩm, mỹ phẩm hay dược phẩm.
3.4.5 Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của sản phẩm
Bảng 3.13 Hoạt tính kháng khuẩn của sản phẩm trên một số chủng vi khuẩn
Nồng độ hoạt chất (ppm) Tên vi khuẩn 1000 500 250 125 62.5 31.25 15.625 Đối chứng Staphylococcus aureus - - - + + + + + MRSA - - + + + + + + Streptococcus Hemolyticus + + + + + + + + Escherichia Coli + + + + + + + + Chú thích: - : ức chế ; + : khơng ức chế
Nhận xét: Sản phẩm cĩ tác động kháng khuẩn lên chủng vi khuẩn gram (+)
Staphylcoccus aureus và MRSA (một chủng vi sinh vật cĩ khả năng kháng lại methicillin), tuy nhiên hoạt tính kháng khuẩn tương đối yếu, nồng độức chế trong thí nghiệm với Staphylcoccus aureus là 250 ppm và trong thí nghiệm với MRSA là 500 ppm. Sản phẩm khơng thể hiện khả năng kháng khuẩn đối với các chủng vi sinh vật gram (-) (Streptococcus Hemolyticus và E.Coli), phù hợp với các kết quả cơng bố trong [9, 19, 46, 51], cho thấy các catechin từ trà cĩ khả năng ức chất các vi khuẩn gram (+) nhưng cĩ rất ít tác dụng lên các vi khuẩn gram (-). Điểm đặc biệt
đáng lưu ý là tác động của sản phẩm mang tính sát khuẩn, ở hàm lượng ức chế trong cả thí nghiệm với Staphylcoccus aureus và MRSA, vi khuẩn khơng thể phát triển sau 72 giờ quan sát. Tuy nhiên số lượng thí nghiệm cịn hạn chếđể cĩ thể đánh giá
4 KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ
Kết luận : Luận văn đã thực hiện được các kết quả sau:
- Đánh giá bốn phương pháp so màu để định lượng hàm lượng tổng polypohenol trong dịch trích trà. Phương pháp so màu được lựa chọn trong phân tích định lượng tổng polyphenol trong quá trình trích ly trà : phương pháp Folin-ciocalteu do cĩ độ ổn định cao, đơn giản và độ nhạy tốt.
- Đánh giá và lựa chọn giống trà nguyên liệu từ năm giống trà đang được trồng tại vùng trà Bảo Lộc – Lâm Đồng. Các nguyên liệu đã được đánh giá về hàm lượng 4 loại catechin (C, EC, EGCG, ECG), hàm lượng caffeine, hàm lượng một số kim loại. Giống trà HAT được chọn làm nguyên liệu trích ly do cĩ hàm lượng catechin cao nhất (20.43% chất khơ)
- Khảo sát quá trình xử lý nguyên liệu và trích ly polyphenol từ búp trà bằng phương pháp cĩ hỗ trợ của vi sĩng.
Quá trình xử lý ức chế enzyme polyphenol oxidase: thời gian xử lý 90 giây, lượng mẫu xử lý 200 g/1 lần, trong hộp đậy kín, chếđộ năng lượng High trong lị vi sĩng gia dụng Panasonic. Thiết lập chếđộ cơng nghệ cho phương pháp trích ly cĩ hỗ trợ
của vi sĩng với các thơng số như sau (sử dụng lị gia dụng Whirlpool): + Tỉ lệ nguyên liệu : dung mơi : 1 : 6 (g/ml).
+ Dung mơi : dung dịch ethanol 60o.
+ Thời gian chiếu sĩng : 6 phút (thực hiện cho chu trình 1 phút chiếu vi sĩng và 2 phút giải nhiệt, tổng thời gian 18 phút).
+ Cơng suất lị vi sĩng : 800W (đối với lị vi sĩng gia dụng và lượng dung mơi cho mỗi lần trích ly là 250ml).
+ Hiệu quả trích ly cao nhất đạt 82.46 % sau 6 phút chiếu vi sĩng (tổng thời gian trích ly 18 phút).
- Tinh chế sơ bộ và tạo chế phẩm dạng bột từ dịch trích trà thu được bằng quy trình tinh chế sử dụng dung mơi. Sản phẩm thu được cĩ hàm lượng EGCG 35%, catechin tổng 70% và polyphenol tổng 95%.
- Khảo sát hoạt tính kháng oxy hĩacủa chế phẩm. Sản phẩm đã được đánh giá hoạt tính quét gốc tự do in vitro và hoạt tính kháng oxy hĩa MDA tiền in vivo, cho thấy sản phẩm cĩ hoạt tính cao hơn các chất kháng oxy hĩa đối chứng trong các phương pháp tương ứng (vitamin C trong phản ứng quét gốc tự do DPPH và Trolox trong phương pháp kháng oxy hĩa tiền in vivo MDA).
- Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn trên 4 chủng vi khuẩn. Sản phẩm thể hiện khả
năng kháng khuẩn yếu đối với hai chủng vi khuẩn gram (+) (Staphylcoccus aureus
và MRSA), khơng cĩ khả năng ức chếđối với vi khuẩn gram (-).
Đề nghị:
- Tiếp tục khảo sát và mở rộng các loại nguyên liệu trà tại Việt Nam, đánh giá thêm các yếu tố thổ nhưỡng, cách trồng trọt, thời điểm và phương pháp thu hoạch lên hàm lượng catechin trong giống trà.
- Triển khai sản xuất thử nghiệm quá trình trích ly trà.
- Nghiên cứu tinh chế dịch trích trà để thu được sản phẩm cĩ hàm lượng catechin cao hơn.
- Nghiên cứu tách, phân lập các catechin.
- Nghiên cứu mở rộng về hoạt tính kháng oxy hĩa của sản phẩm (in vitro, tiền in vivo, in vivo), hoạt tính kháng khuẩn để đánh giá hiệu quả dược học của sản phẩm.
- Nghiên cứu sử dụng sản phẩm trong các sản phẩm thực phẩm, dược phẩm, mỹ
5 TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Lê Thanh Mai, Nguyễn Thị Hiền, Phạm Thu Thuỷ, Nguyễn Thanh Hằng, Lê Thị Lan Chi, Các phương pháp phân tích ngành cơng nghệ lên men, Đại học Bách Khoa Hà Nội, 2005.
2. Nguyễn Thị Kim Oanh, Nghiên cứu trích ly polyphenol từ lá trà để ứng dụng vào thực phẩm và dược phẩm, Luận văn Thạc sĩ, Đại học Bách Khoa Tp.HCM, 2004.
3. Đỗ Ngọc Quý, Cây chè Việt Nam : sản xuất, chế biến và tiêu thụ, Nhà xuất bản Nghệ An, 2003.
4. Hồng Thị Sản, Phân loại thực vật học, Nhà xuất bản giáo dục, 2003.
5. Lê Thị Hồng Nhan, Nghiên cứu chất màu tự nhiên từ cây hoè (Sophora Japonica L.) tại Việt Nam, Luận văn Thạc sĩ, Đại học Bách Khoa Tp.HCM, 2002.
6. Ngơ Văn Thu, Bài giảng dược liệu, BM Dược liệu ĐH Y Dược Tp.HCM, BM Dược liệu ĐH Y Dược Hà Nội, Hà Nội, 1998.
7. Andre Loupy, Trần Kim Quy, Lê Ngọc Thạch, Phương pháp học mới về
tổng hợp hữu cơ, Trường Đại học KHTN, 1995.
8. Tống Văn Hằng, Cơ sở sinh hĩa và kĩ thuật chế biến trà, Tp.HCM, 1985. 9. Irena Vovk, Breda Simonovska, Heikki Vourela, Separation of eight selected
flavan–3–ols on cellulose thin layer chromatographic plates, Journal of Chromotography A 1077, p188 – 194, 2005.
10. Lawrance Peter Wright, Biochemical analysis for identification of quality in balck tea (Camellia sinensis), Doctoral Thesis, University of Pretoria, South Africa, 2005.
11. Liang Chen, Zhi Xiu Zhou, Variations of main quality components of tea genetic resources (Camellis sinensis (L.) O.Kuntze) preserved in the China National Germplasm tea repository, Plants food for human nutrition 60, p 31-35, 2005.
12. Zohar Kerem, Hilla German-Shashoua, Oded Yarden, Microwave-assisted extraction of bioactive saponins from chickpea (Cicer arietnum L.), J. Sci Food Agric 85, 406 – 412, 2005.
13. D.I. Tsimigiannis, V.Oreopoulou, Free radical scavenging and antioxidant activity of 5,7,3’,4’ – hydroxy substituted flavonoids, Innovative food science and emerging technologies 5, p 523 – 528, 2004.
14. Joung Ho Ko, Gyoung Won Kang, You Jin Seo, Won Jo Cheong, C18 attached silica monolith microcolumns made in stainless steel tubing and their application in analysis of flavonoids in green tea extracts, Bull. Korean Chem. Soc. 25, No. 10 1589, 2004.
15. Jan Wollgast, The contents and effects of polyphenols in chocolate, qualitative and quantitative analys of polyphenols in chocolate and chocolate raw products as well as evaluation of potential implications of chocolate consumption in human health, Doctoral thesis, Jutus Liebig University of Giessen, Germany, 2004.
16. Kai On Chu, Chi Chiu Wang, Micheal Scott Rogers, Kwong Wai Choy, Chi Pui Pang, Determination of catechins and catechin gallates in biological fluids by HPLC with colormetric array detection and solid phase extraction, Analytica Chimica Acta 510, p 69 – 76, 2004.
17. Lallie C. McKenzie, John E. Thompson, Randy Sullivan, James E. Hutchison, Green chemical processing in the teaching laboratory: a convenient liquid CO2 extraction of natural products, Green Chem. 6, p 355 – 358, 2004.
18. S. Azam, N. Hadi, N.U. Khan, S.M. Had, Prooxidant property of green tea polyphenols epicatechin and epigallocatechin-3-gallate: implications for anticancer properties, Toxicology in Vitro 18, p 555–561, 2004.
19. Stapleton PD, Shah S, Anderson JC, Hara Y, Hamilton-Miller JM, Taylor PW. Modulation of beta-lactam resistance in Staphylococcus aureus by catechins and gallates. Int J Antimicrob Agents 23(5), p 462- 467, 2004. 20. Xu Jinze, Tea catechins : Epimerization, antioxidant activity and effect on
body fatness in rats, Doctoral Thesis, The Chinese University of Hong Kong, 2004
21. Yasi Saffari, S.M. Hossein Sadrzedeh, Green tea matabolite EGCG protects membranes against oxidative damage in vivo, Life Sciences 74, p 1513 – 1518, 2004.
22. Ashu Gulati, Renu Rawat, Brajinder Singh, S.D. Ravindranath, Application of microwave energy in the manufacture of enhanced – quanlity Green tea, Journal of argicutual and food chemistry, 51, p 4764 – 4768, 2003.
23. Ayumiko Nakamura, Sumiko Tsuji, Yasuhide Tonogai, Analysis of proanthocyanidins in grape seed extracts, health foods and grape seed oil, Journal of health science 49, p 45 – 54, 2003.
24. Begona Bartolome, Veronica Nunez, Maria Monagas, Carmen Gomez- Condorves, In vitro antioxidant activity of red grape skins, Eur Food Res Technol 218, p 173 – 177, 2004.
25. Choi JH, Rhee IK, Park KY, Kim JK, Rhee SJ, Action of green tea catechin on bone metabolic disorder in chronic cadmium-poisoned rats, Life Sci. 73(12), p 1479 – 1489, 2003.
26. Ishizuk H, Eguchi H, Oda T, Ogawa S, Nakagawa K, Honjo S, Kono S,
Relation of coffee, green tea and caffeine intake to gallstone in middle-aged Japanese men, Euro J. Epidemiol 18, p 401 – 405, 2003.
27. Pan T, Jankovic J, Le W, Potential theurapeutic properties of green tea polyphenols in Parkinson’s disease, Drugs aging, 20, p 711-721, 2003.
28. Giancarlo Aldini, Kyung-Jin Yeum, Marina Carini, Norman I. Krinsky, and Robert M. Russell, (-)-Epigallocatechin-(3)-gallate prevents oxidative damage in both the aqueous and lipid compartments of human plasma, Biochemical and biophysical research communications 302, 409–414, 2003. 29. Xuejun Pan, Guoguang Niu, Huizhou Liu, Microwave-assisted extraction of
tea polyphenols and tea caffeine from green tea leaves, Chemical engineering and processing 42, p 129 – 133, 2003.
30. Carmen W. Huie, A review of modern sample-preparation techniques for the extraction and analysis of medicinal plants, Anal Bioanal Chem. 373, p 23 – 30, 2002.
31. Elena N. Hristea, Mihaela Hillebrand, Miron T. Caproiu, Horia Caldararu, Titus Constantinescu, Alexandru T. Balaban, Scavenging the hydroxyl radical by 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl, Arkivoc (II), p 123-132, 2002. 32. Hirota Fujikia, Masami Suganumab, Kazue Imaic, Kei Nakachic, Green tea:
cancer preventive beverage and/or drug, Cancer Letters 188, p 9–13, 2002. 33. Leticia M.Costa, Sandro T. Gouveia, Joanquim A.Nobrega, Comparison of
heating extraction procedures for Al, Ca, Mg and Mn in tea samples, Analytical sciences Vol.18, p 313 – 318, 2002.
34. Lurdes Mira, M.Tereza Fernandez, Marta Santis, Rui Rocha, M.Helena Florencio, Keith R. Jennings, Interactions flavonoids with iron and copper
ions : A mechanism for their antioxidant activity, Free radical research, p 1- 10, 2002.
35. N. L. Rozzi, R.K. Singh, Supercritical fluids and the food industry, Comprehensive reviews in food science and food safety, Vol. 1, 2002.
36. S. Gupta, B. Saha, A.K. Giri, Comparative antimutagenic and anticlastogenic effects of green tea and black tea: a review, Mutation Research 512, 37–65, 2002.
37. Conrad Astill, Mark R. Birch, Clive Dacombe, Philip G.Humphrey, Philip T. Martin, Factors affecting the caffeine and polyphenol contents of black and green tea infusions, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 49, p 5340 – 5347, 2001.
38. David T. Bailey, Parh L. Yuhasz, Bo Lin Zheng, Method for isolation caffeine –free catechins from green tea, U.S patent 6.210.679, 2001.
39. E.Surducan, Camellia Neamtu, V. Surducan, Gabiela Nagy, S.Filip,
Microwave power assisted sample preparation, extraction studies, Studia Universitatis Babes-Bolyai, Physica, Special Issue, 2001.
40. Enrique Cadenas, Handbook of antioxidants, Second edition,
www.vnulib.edu.vn/elibrary, Mercel Bekker Incorporated, 2001.
41. Karin Schwarz, Grete Bertelsen, Lise R. Nissen, Peter T. Gardner, Marina I. Heinonen, Anu Hopia, Tuong Huynh-Ba, Pierre Lambelet, Donald McPhail, Leif H. Skibsted, Lilian Tijburg, Investigation of plant extracts for the protection of processed foods against lipid oxidation. Comparison of antioxidant assays based on radical scavenging, lipid oxidation and analysis of the principal antioxidant compounds, Euro Food Res. Technol. 212, p 319–328, 2001.
42. Yukihiko Hara, Green tea : Health benefits and applications,
www.vnulib.edu.vn/elibrary, Marcel Dekker Incorporated, 2001.
43. Angela Monks, Japanese Green Tea, Continued Investigation into Commercial Production and Development in Tasmania, Department of Primary Industries Water and Environment, Tasmania Gorvement, Tasmania, 2000.
44. Athula Ekanayake, John Robert Bunger, Marvin Joseph Mohlenkamp, Green tea extract subjected to cation exchange treatment and nanofiltration to improve clarity and color, U.S patent 6.063.428, 2000.
45. Ezio Bombardelli, Paolo Morazzoni, Giuseppe Mustich, Polyphenol fractions of tea, the use there of and formulations containing them, U.S. patent 6.096.359, 2000.
46. John H. Weisburger, Tea and health: a historical perspective, Cancer Letters 114, p 315-317, 2000.
47. Harsh P. Singh, S.D. Ravindranath, C. Singh, Analysis of tea shoot catechins: Spectrophotometric quantitation and selective visualization on two – dimensional paper chromatograms using diazotized sulfanilamide, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 47, p 1041 – 1045, 1999.
48. M.Letellier, H. Budzinski, Microwave assisted extraction of organic compounds, Analusis (Wiley – VCH) 27, p 258 -271, 1999.
49. Qiong Guo, Baolu Zhao, Shengrong Shen, Jingwu, Jungai Hu, Wenjuan Xin,
ERS study on the structure – antioxidant activity relationship of tea catechins and their epimers, Biochimia et Biophysica Acta 1427, p 13-23, 1999.
50. Yuko Yoshida, Masaaki Kiso, Tetsuhisa Goto, Efficiency of the extraction of catechins from green tea, Food Chemistry 67, p 429 - 433, 1999.
51. Yukiaki, Yukihiko Hara, Antimutagenic and anticarcinogenic acitivity of tea polyphenols, Mutation Reasearch 436, p 69 – 97, 1999.
52. Yam TS, Hamilton-Miller JM, Shah S. The effect of components of tea (Camellia sinensis) on methicillin resistance, PBP2' synthesis, and beta- lactamase production in Staphylococcus aureus. J Antimicrob Chemother. 42(2), p 211-216, 1998.
53. Z.Y.Chen, P.T.Chan, Antioxidative acitivity of green tea catechins in canola oil, Chemistry and physics of lipids 82, p 163 – 172, 1996.
54. G. Whittaker, Microwave Chemistry, www.tan-delta.com/microwave.html, 1994 & 1997.
55. Terao J Piskula, M Yao Q, Protective effect of epicatechin, epicatechin gallate and quercetin on lipid peroxidation in phospholipid bilayers, Arch Biochem Biophys 308, p 278 – 284, 1994.
56. Hemingway, R.W, Larks, Polyphenol plant, Lees G.L, 1992
57. Horrace D Graham, Stabilization of the Prussian Blue color in the determination of polyphenols, J. Agric. Food Chem. 40, p 801 – 806, 1992. 58. David N.Evans, Charles L. Fairchild, Karl C. Hramer, John C. Sprill, Gerard
J. Wansor, Robert W. Wood, Process for a non-clouding concentrated tea extract, U.S. patent 4.797.293, 1989.
59. Yukihiko Hara Shizuoka, Process for the production of tea catechins, US patent 4.613.672, 1986.
60. T.A. Geissman, The Chemistry of Flavonoid compounds, The Macmillan Company, New York, 1962.
61. Maria Teresa Escribano Bailon, Celestino Santos-Buelga, Polyphenols extraction from foods, University of Salamanca, Spain.
62. Material Safety Data Sheet, (+)-Catechin, Hydrate MSDS, (-)- epigallocatechin gallate MSDS, caffeine MSDS, (-)- Epicatechin MSDS, (-)- Epicatechin gallate MSDS, (+)-gallocatechinMSDS, www.Sciencelab.com.
PHỤ LỤC 1 TÍNH TỐN
Các mẫu được tiến hành 3 lần, lấy giá trị trung bình, sai số được tính theo độ lệch chuẩn SD (standard deviation)
Giá trị trung bình = n x n i i ∑ =1 2 ) 1 ( 1 2 1 2 − ⎟ ⎠ ⎞ ⎜ ⎝ ⎛ − = ∑ ∑ = = n n x x n SD n i n i i i Trong đĩ: xi : giá trị kết quả