Để tăng hiệu quả của quá trình trích ly, các nghiên cứu đã được đưa ra để cải thiện phương pháp trích ly bằng dung mơi bằng cách áp dụng các biện pháp hỗ trợ như vi
sĩng, siêu âm, áp dụng các kĩ thuật trích ly bằng CO2 siêu tới hạn, trích ly pha rắn (SPE – solid phase extraction) hoặc kỹ thuật trích ly bằng cách nén chất lỏng.
Quy trình trích ly cĩ hỗ trợ của siêu âm : sử dụng siêu âm làm tăng nhanh quá trình trích ly, do tác động của sĩng siêu âm phá vỡ các tế bào. Nhưng hiệu quả của việc dùng sĩng siêu âm chưa thống nhất, do sĩng siêu âm cĩ thể làm tăng nhanh quá trình oxy hĩa catechin do việc thúc đẩy sự hình thành của các gốc tự do [61].
Các kĩ thuật trích ly bằng CO2 siêu tới hạn đã dược áp dụng để tách caffeine từ trà [17], tuy nhiên chưa thấy áp dụng hiệu quả trong việc trích ly polyphenol trong thực phẩm nĩi chung hay catechin trong trà nĩi riêng, mặc dù đã cĩ một số nghiên cứu bước đầu trong việc sử dụng CO2 siêu tới hạn để trích ly các hợp chất phân cực. CO2 siêu tới hạn cĩ những ưu điểm vượt trội so với các phương pháp trích ly khác như trích ly ở nhiệt độ thấp tránh sự phân huỷ hay oxi hĩa sản phẩm, khơng phải tách dung mơi sau quá trình trích ly [35], tuy nhiên CO2 là một dung mơi khơng phân cực nên phải cĩ biện pháp hiệu chỉnh dung mơi để cĩ thể sử dụng được trong quá trình trích ly catechin.
Phương pháp trích ly bằng cách nén chất lỏng tỏ ra cĩ một số ưu điểm như thực hiện nhanh, mơi trường hồn tồn trơ, và đã được áp dụng khi thực hiện trích ly polyphenol từ hạt nho [35]. Quy trình này vẫn cịn đang được nghiên cứu và chưa
ứng dụng cho trích ly catechin từ trà. Quá trình trích ly pha rắn cĩ hiệu quả cao, nhưng chỉ mới được ứng dụng chủ yếu trong quá trình chuẩn bị mẫu do chỉ xử lý
được một lượng mẫu tương đối nhỏ [61].
1.4.4 Phương pháp trích ly cĩ hỗ trợ của vi sĩng 1.4.4.1 Giới thiệu về vi sĩng [7, 30, 48, 54]
Vi sĩng là sĩng điện từ lan truyền với vận tốc ánh sáng, cĩ tần số trong khoảng 0.3 – 3GHz. Máy phát vi sĩng đầu tiên được thiết kế bởi Radall và Booth tại đại học Birmingham và được áp dụng trong kỹ thuật radar. Sau đĩ, vào những năm 50 các lị vi sĩng gia dụng bắt đầu được thương mại hĩa ở Mỹ và phổ biến trên tồn thế
cứu khoa học với giải tần số sử dụng thể hiện trong Bảng 1.6. Tần số 2450 MHz là tần số quy ước trên thế giới sử dụng trong các lị vi sĩng gia dụng (trừ một số khu vực sử dụng tần số 2375MHz).
Bảng 1.6 Tần số vi sĩng quy ước trong ứng dụng gia dụng, y tế, cơng nghiệp, nghiên cứu khoa học tại các khu vực khác nhau trên thế giới [54]
Tần số Khu vực sử dụng
0.434 Austria, Netherlands, Portugal, Germany, Switzerland
0.896 United Kingdom
0.915 Bắc Mỹ và Nam Mỹ
2.375 Albania, Bulgaria, Hungary, Romania, Czech và Slovak 2.450 Tồn thế giới (trừ những nơi dùng tần số 2.375 GHz) 3.390 Netherlands 5.800 Tồn thế giới 6.780 Netherlands 24.150 Tồn thế giới 40.680 United Kingdom
Vi sĩng cĩ đặc tính là cĩ thể đi xuyên qua được khơng khí, gốm sứ, thuỷ tinh, polymer và phản xạ trên bề mặt kim loại. Đối với vật chất cĩ độẩm 50% với tần số
2450 Mhz (tương đương với bước sĩng 12.2cm) cĩ độ xuyên thấu 10 cm. Năng lượng vi sĩng tương đối yếu, nhỏ hơn năng lượng liên kết cộng hĩa trị, nên bức xạ
vi sĩng khơng gây ra sự ion hĩa và khơng phá huỷ các liên kết hĩa học .
Vi sĩng cĩ khả năng đốt nĩng các vật chất cĩ cấu trúc phân cực do cĩ khả năng làm quay các phân tử trong điện trường xoay chiều cĩ tần số rất cao. Quá trình đốt nĩng diễn ra từ bên trong vật thể nên quá trình truyền nhiệt diễn ra nhanh và đều hơn quá trình gia nhiệt thơng thường. Quá trình gia nhiệt các hợp chất càng phân cực diễn ra càng nhanh dưới tác dụng chiếu vi sĩng.
1.4.4.2 Kĩ thuật trích ly cĩ hỗ trợ của vi sĩng [7, 12, 29, 30, 48, 54, 61]
Từ khi ra đời, vi sĩng đã thu hút được nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học và
được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Trong ngành hĩa học, vi sĩng được nghiên cứu nhiều trong các quá trình tổng hợp hữu cơ, trích ly tinh dầu, trích ly hợp chất thiên nhiên, phá hủy mẫu trong phân tích, phân huỷ các hợp chất độc hại trong xử lý mơi trường…, các nghiên cứu ứng dụng vi sĩng cho thấy ưu điểm vượt trội của vi sĩng so với các phương pháp gia nhiệt truyền thống khác .
Trích ly với sự hỗ trợ của vi sĩng (Microwave-assisted extraction (MAE)) được
đăng ký bản quyền đầu tiên ở Mỹ. Trong những năm gần đây, phương pháp này đã
được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như trích ly các chất ơ nhiễm cĩ nguồn gốc hữu cơ, trích ly các chất trong cơng nghiệp thực phẩm và sinh học, các hợp chất tự
nhiên, tinh dầu cĩ trong các lồi thực vật. MAE được biết đến như là một kỹ thuật “sạch”, mang lại nhiều ích lợi như : đơn giản, phạm vi ứng nhiều, hiệu quả trích ly cao, giảm thời gian và dung mơi sử dụng.
Trong lĩnh vực trích ly hợp chất thiên nhiên và tinh dầu, phương pháp trích ly bằng vi sĩng mang lại hiệu quả cao do tính chất đặc biệt trong quá trình truyền năng lượng. Khi thực hiện quá trình bằng phương pháp gia nhiệt thường, nhiệt độ được truyền từ bên ngồi qua thành bình chứa vào dung mơi và lớp vật liệu, hình thành gradient nhiệt từ ngồi vào trong, nhiệt độ tại thành thường cao hơn nhiệt độ sơi của dung mơi. Khi thực hiện bằng vi sĩng, vi sĩng tạo ra hiện tượng nâng nhiệt độ của vật thể từ bên trong bằng cách tác động trực tiếp lên các phân tử phân cực một cách
đồng đều với tốc độ rất nhanh. Hiện tượng này làm tăng tốc quá trình khuếch tán của chất cần trích ly vào dung mơi, đồng thời sự tăng nhiệt đột ngột làm hĩa hơi các phân tử dung mơi, gia tăng đột ngột áp suất giúp phá vỡ cấu trúc tế bào, giải phĩng vật chất vào dung mơi. Các quá trình trích ly bằng vi sĩng thường cĩ thời gian ngắn hơn rất nhiều so với phương pháp trích ly thơng thường, cho phép trích ly cĩ hiệu quả hơn các phân tử dễ bị phân hủy dưới tác động của nhiệt độ .
Hình 1.9 Nguyên tắc gia nhiệt bằng phương pháp thường (a) và vi sĩng (b)[54] Các điểm cần lưu ý trong quá trình trích ly bằng vi sĩng:
- Dung mơi trích ly : do đặc tính của vi sĩng nên thơng thường dung mơi trích được lựa chọn chủ yếu là các dung mơi cĩ độ phân cực cao (nước, ethanol, methanol…), cho phép tiếp nhận dễ dàng năng lượng vi sĩng. Tuy nhiên cũng cĩ nghiên cứu cho rằng khi dùng các dung mơi khơng phân cực như hexane, cho phép sự truyền dẫn năng lượng vào bên trong tế bào thực vật tốt hơn [61]. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Nhiệt độ và áp suất trích ly : thơng thường quá trình trích ly bằng vi sĩng thường
được thực hiện ở áp suất khí quyển và nhiệt độ sơi của dung mơi. Một số cơng trình cho rằng dưới tác dụng của vi sĩng, dung mơi cĩ thể chuyển sang trạng thái quá nhiệt (sơi ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ sơi thơng thường ở áp suất khí quyển), hoặc ở
trạng thái siêu tới hạn trong các lị đĩng kín. Những trạng thái này cĩ thể giải thích một phần cho hiệu quả trích ly cao của phương pháp vi sĩng [30, 54].
- Thời gian trích ly : phương pháp vi sĩng cho phép giảm đáng kể thời gian trích ly do tăng tốc độ trích lý. Quá trình trích ly thơng thường hoặc bằng Sohlex cĩ thể kéo dài từ vài tiếng cho tới vài ngày, nhưng quá trình trích ly vi sĩng chỉ cần kéo dài khoảng 10 – 20 phút đểđạt được hiệu quả tương đương [7, 61].
Hình 1.10 Sơ đồ hệ thống trích ly cĩ hộ trợ của vi sĩng (a) trích ly với sinh hàn hồn lưu trong lị monomode; (b) trích ly kín trong lị multimode [54].
Điểm yếu hiện nay đối với phương pháp trích ly bằng vi sĩng là thiết bị cịn hạn chế. Phần lớn các nghiên cứu chỉ sử dụng các lị gia dụng thơng thường (cĩ hoặc khơng sửa đổi) nên quy mơ thí nghiệm rất nhỏ, các quá trình trích ly vi sĩng trong cơng nghiệp cũng đang ở giai đoạn thử nghiệm.
Đối với quá trình trích ly catechin từ trà, kĩ thuật trích ly bằng vi sĩng đã được cơng bố trong cơng trình [29], tác giảđã thực hiện quy trình trích ly với nguyên liệu là trà xanh thành phẩm cho thấy phương pháp trích ly bằng vi sĩng cĩ nhiều ưu điểm hơn phương pháp thường. Các thơng số thu được là khả quan tạo định hướng tốt cho nghiên cứu tiếp tục.
Việt Nam cĩ nguồn nguyên liệu trà phong phú, nhưng sản phẩm về trà cịn đơn giản, cơng nghệ thơ sơ, nhỏ lẻ, chủ yếu tập trung khai thác các sản phẩm trà truyền thống. Việc nghiên cứu sản xuất polyphenol từ trà là điều cần thiết nhằm tạo ra sản phẩm cĩ giá trị thương mại cao, đẩy mạnh sự phát triển của ngành cơng nghiệp trà. Hiện nay, tại Việt Nam đã cĩ nghiên cứu về trích ly polyphenol từ trà, nhưng chủ
yếu tập trung vào phương pháp trích ly thường [2], việc cĩ thêm các nghiên cứu về
phương pháp trích ly khác như vi sĩng là cần thiết, tạo tiền đề về cơng nghệ cho việc sản xuất một sản phẩm cĩ hàm lượng giá trị gia tăng cao.
PHƯƠNG PHÁP
2 PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM 2.1 Mục tiêu nghiên cứu
- Đánh giá một số các phương pháp so màu để định lượng hàm lượng tổng polyphenol trong dịch trích trà.
- Đánh giá và lựa chọn giống trà nguyên liệu từ một số giống trà đang được trồng tại vùng trà Bảo Lộc – Lâm Đồng.
- Khảo sát quá trình xử lý nguyên liệu và trích ly polyphenol từ búp trà bằng phương pháp cĩ hỗ trợ của vi sĩng
- Tinh chế và tạo chế phẩm dạng bột từ dịch trích trà thu được
- Khảo sát hoạt tính kháng oxy hĩa in vitro, tiền in vivo của chế phẩm
2.2 Sơđồ tiến hành thực nghiệm Sơđồ 2.1 Sơđồ tiến hành thực nghiệm Khảo sát phương pháp đo 4 phương pháp: - Folin – Ciocalteu - Prussian Blue - Vanillin – HCl - Diazotized Khảo sát quá trình ức chế enzyme
Lựa chọn nguyên liệu 5 giLD97, LDP1, HAT, PH1, TB14 ống trà nguyên liệu:
Khảo sát phương pháp trích ly cĩ hỗ trợ vi sĩng Đánh giá các yếu tố ảnh hưởng: - Tỷ lệ nguyên liệu: dung mơi, - Dung mơi sử dụng, - Thời gian trích ly, - Chất kháng oxy hĩa hỗ trợ, - Hiệu quả trích ly Tinh chế sơ bộ sản phẩm Đánh giá tính chất của sản phẩm - Hàm lượng catechin
- Hoạt tính kháng oxy hĩa in vitro, tiền in vivo
- Hoạt tính kháng khuẩn Phương pháp ức chế
enzyme cĩ hỗ trợ của vi sĩng
2.3 Phương pháp thực nghiệm 2.3.1 Phương pháp phân tích HPLC
(Thực hiện tại Trung tâm kiểm nghiệm thuốc thú y Tp.HCM)
Phương pháp HPLC sử dụng trong phân tích catechin đã được phát triển trong thời gian gần đây, nhiều phương thức thực hiện với gradient, cột tách và đầu dị khác nhau đã được cơng bố [10, 11, 14, 16], và hiện nay, phương pháp HPLC được coi là phương pháp chuẩn trong phân tích các thành phần catechin của trà.
Điều kiện thực hiện :
- HPLC : HP 1100 Agilant
- Pha động : dung dịch acetonitrile và acid H3PO4 1% theo gradient như (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
sau:
Thời gian (phút) : 0 10 10.1
ACN : 5 40 5
H3PO4(0.1%) : 95 60 95
- Tốc độ dịng : 1 ml/phút
- Cột : C18, Synergi Hydro-RP 80R, Phenomenex, US
- Detector : UV 230 nm
2.3.2 Phương pháp so màu
Hiện nay, phương pháp chính xác nhất dùng để khảo sát và định lượng thành phần polyphenol trong dịch trích trà là phương pháp HPLC. Tuy nhiên phương pháp này tương đối đắt tiền và địi hỏi quá trình xử lý phức tạp. Vì vậy, các phương pháp phân tích so màu được lựa chọn nhằm để định lượng hàm lượng polyphenol tổng và so sánh nhanh hiệu quả trích ly trong quá trình khảo sát phương pháp trích ly. Nhiều phương pháp so màu khác nhau đã được phát triển như phương pháp Folin- ciocalteu, Prussian – Blue nhằm đo hàm lượng polyphenol tổng, phương pháp AlCl
trong methanol hoặc AlCl3, NaNO2 trong NaOH dùng đánh giá hàm lượng flavonoid tổng, phương pháp dùng Vanillin-HCl, BuOH-HCl hoặc Diazotized sulfanilamide để xác dịnh hàm lượng catechin tổng. Mỗi phương pháp đều cĩ ưu và nhược điểm riêng, như phương pháp sử dụng Folin-ciocalteu và Prussian Blue rất
ổn định nhưng quá tổng quát cho nhĩm phenolic, khơng đặc trưng cho nhĩm hợp chất catechin cần khảo sát, thường dẫn đến kết quả cĩ sai số thừa, các phương pháp sử dụng AlCl3, vanillin, hay diazo cĩ độ lựa chọn cao đối với nhĩm catechin thì khơng đạt được độ ổn định, khơng thuận tiện trong quá trình tiến hành thí nghiệm [15, 23, 37, 43, 47, 57, 60].
Tuy vậy, các phương pháp so màu cĩ ưu thế rẻ tiền, thao tác nhanh, đơn giản, khơng địi hỏi các thiết bị phức tạp nên vẫn được sử dụng để đánh giá sơ bộ hay so sánh kết quả. Trong thực nghiệm, bốn phương pháp Folin-ciocalteu, Prussian Blue, Vanillin-HCl và Diazotized sẽ được đánh giá để lựa chọn phương pháp định lượng sử dụng trong các thí nghiệm sau.
2.3.2.1 Phương pháp Folin–ciocalteu [1, 15]
Thuốc thử Folin–ciocalteu (hỗn hợp muối phức polyphosphotungstate - molydate) rất nhạy đối với chất khử, nếu cĩ mặt hợp chất polyphenol trong mơi trường kiềm nhẹ thì sẽ bị khử thành sản phẩm phức molydenium-tungsten cĩ màu xanh.
Hĩa chất: Thuốc thử Folin-ciocalteu, dung dịch Na2CO3 bão hồ, nước cất.
Chất chuẩn : Dung dịch (+)- catechin.
Phương pháp thực hiện: Lấy 0.5 ml dung dịch (chuẩn hoặc dung dịch cần đo đã pha lỗng- mẫu trắng dùng nước cất) cho vào bình định mức 10ml, cho tiếp 4.5ml nước cất, lắc đều, cho nhanh 0.2 ml Folin và 0.5 ml Na2CO3 bão hịa, lắc đều dung dịch, sau đĩ địch mức bằng nước cất đến 10 ml, lắc đều. Để yên trong 1giờ, sau đĩ tiến hành đo độ hấp thu A tại bước sĩng λ = 725 nm (Máy Jenway 6505 UV/VIS Spectrophotometer).
2.3.2.2 Phương pháp Prussian Blue [2, 15, 57]
Hỗn hợp thuốc thử là FeCl3 và K3Fe(CN)6 bị khử bởi các hợp chất phenol và tạo thành phức ferric (III) hexacyanoferrate (II) cĩ màu xanh.
Hĩa chất : dung dịch 0.02M FeCl3 trong 0.1M HCl, dung dịch 0.016M K3Fe(CN)6, chất ổn định: nước cất + 85 % H3PO4 + 1 % gum arabic theo tỉ lệ 3:1:1 (thể tích).
Chất chuẩn: dung dịch (+)- catechin.
Phương pháp thực hiện : Lấy 0.1 ml dung dịch (chất chuẩn hoặc mẫu cần đo đã pha lỗng đến nồng độ thích hợp) cho vào ống nghiệm, cho tiếp 3 ml nước cất, lắc
đều, tiếp theo cho nhanh 1 ml K3Fe(CN)6 và 1 ml FeCl3, lắc đều dung dịch. Để yên dung dịch trong 15 phút, sau đĩ đem đo độ hấp thu A tại bước sĩng λ = 700 nm.
2.3.2.3 Phương pháp Vanillin – HCl [15, 23]
Vanillin cĩ khả năng bị proton hĩa trong mơi trường acid, tạo thành ion mang điện dương ái điện tử yếu sau đĩ phản ứng với các chất catechin tại vị trí 6 hoặc 8, tách nước tạo thành hợp chất cĩ màu đỏ.
Hĩa chất : dung dịch vanillin 1 % trong methanol (pha mới trước khi sử dụng), dung dịch HCl 9M trong methanol, methanol.
Chất chuẩn : Dung dịch (+)- catechin.
Phương pháp thực hiện : Lấy 1 ml dung dịch (dung dịch chuẩn hoặc dịch trích trà
đã pha lỗng phù hợp – mẫu trắng thay bằng 1 ml methanol) cho vào ống nghiệm, cho tiếp 2.5 ml dung dịch vanillin, lắc đều, sau đĩ 2.5 ml dung dịch HCl. Lắc đều và để yên dung dịch trong thời gian 30 phút, sau đĩ đem đo độ hấp thu tại bước sĩng λ = 500 nm.
NH2 SO2NH2 N SO2NH2 N NO+ + H2O + NaNO2/HCl t < 5oC + 2.3.2.4 Phương pháp Diazotized [22, 47] (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Các chất catechin cĩ khả năng phản ứng ghép đơi với hợp chất diazo trong mơi trường acid tạo thành hợp chất cĩ màu vàng đặc trưng.
Hĩa chất : dung dịch diazotized sulfanilamide 1% trong acetone, dung dịch HCl 30/70 trong acetone (30 thể tích HCl đậm đặc pha lỗng trong 70 thể tích acetone).
Chất chuẩn : dung dịch (+)- catechin.
Quy trình tổng hợp diazotized từ sulfanilamide và NaNO2/HCl: