Nghiên cứu bào chế hệ nano lipid rắn chứa fluconazol

Hệ tiểu phân nano lipid lần đầu tiên được nghiên cứu vào những năm đầu của thập niên 90 đã thu được nhiều thành công lớn, đặc biệt trong việc bào chế các dạng thuốc hấp thu qua da và niê

NGÔ THỊ PHƯƠNG LIÊN

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ

HỆ NANO LIPID RẮN CHỨA FLUCONAZOL KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2013

============

NGÔ THỊ PHƯƠNG LIÊN

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ

HỆ NANO LIPID RẮN CHỨA FLUCONAZOL KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Th.S Nguyễn Thị Mai Anh

DS Đào Minh Huy

Là những người thày đã luôn tận tình chỉ bảo, hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Em cũng chân thành cảm ơn:

Các thầy cô trong Ban giám hiệu, phòng Đào tạo cùng toàn thể các thầy cô các bộ môn và cán bộ các phòng ban trường Đại học Dược Hà Nội đã tận tình dạy

dỗ em trong những năm tháng học tập tại trường

Các thầy cô và kỹ thuật viên bộ môn Bào chế, bộ môn Công nghiệp Dược,

bộ môn Dược lực trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong quá trình thực hiện khóa luận này

Cuối cùng em xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè, đặc biệt là những

người bạn thân thiết trong nhóm NNCC đã luôn ở bên cạnh, động viên, cổ vũ em

trong những thời điểm khó khăn nhất để em có thể hoàn thành khóa luận này

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 17 tháng 05 năm 2013

Sinh viên

Ngô Thị Phương Liên

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 VÀINÉTVỀHỆTIỂUPHÂNNANOLIPID 2

1.1.1 Cấu tạo 2

1.1.2 Thành phần 3

1.1.3 Phương pháp bào chế 6

1.1.4 Những hạn chế của hệ tiểu phân nano lipid 9

1.2 FLUCONAZOL 11

1.2.1 Công thức hoá học 11

1.2.2 Tính chất 11

1.2.3 Tác dụng, chỉ định 12

1.2.4 Các dạng thuốc chứa fluconazol 12

1.2.5 Một số nghiên cứu về hệ nano lipid điều trị nấm 13

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 NGUYÊNVẬTLIỆUVÀTHIẾTBỊ 15

2.1.1 Nguyên vật liệu 15

2.1.2 Thiết bị nghiên cứu 16

2.2. PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU 16

2.2.1 Phương pháp bào chế hệ tiểu phân nano lipid fluconazol 16

2.2.2 Phương pháp đánh giá hệ tiểu phân nano lipid 18

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT 23

3.1 KHẢOSÁTPHƯƠNGPHÁPBÀOCHẾNLCFLUCONAZOL 23

3.1.1 Phương pháp nhũ hóa khuếch tán dung môi 23

3.1.2 Phương pháp đun chảy nhũ hóa 24

3.2 KHẢOSÁTẢNHHƯỞNGCỦATÁDƯỢC 29

fluconazol 30

3.2.2 Lựa chọn chất diện hoạt thân nước 31

3.2.3 Lựa chọn nồng độ chất diện hoạt (Tween 40) 33

3.2.4 Lựa chọn lipid lỏng 34

3.2.5 Lựa chọn nồng độ lipid sử dụng 35

3.2.6 Lựa chọn nồng độ dược chất 36

3.3 ĐÁNHGIÁMỘTSỐĐẶCTÍNHCỦANLCFLUCONAZOL 38

3.3.1 Hàm lượng dược chất 38

3.3.2 KTTP, phân bố KTTP và thế Zeta 38

3.3.3 Xác định cấu trúc NLC bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) 39

39

3.3.4 Xác định trạng thái kết tinh của dược chất 40

3.3.5 Sơ bộ đánh giá khả năng giải phóng dược chất từ NLC fluconazol 41

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DSC (differential scanning calorimetry) : Nhiệt lượng vi sai quét

HLB (hydrophilic-lipophilic balance) : Hệ số cân bằng dầu – nước

HPLC

(high performance liquid chromatography)

: Sắc ký lỏng hiệu năng cao

HSH (high shear homogenization) : Đồng nhất hóa nhờ lực phân cắt lớn

KTTP : Kích thước tiểu phân

NLC (nanostructure lipid carries) : Hệ tiểu phân nano lipid

PDI (polydispersity index) : Chỉ số đa phân tán

TEM (transmission electron microscopy) : Kính hiển vi điện tử truyền qua SLN (solid lipid nanoparticles) : Hệ tiểu phân nano lipid rắn

Bảng 2.1: Nguyên vật liệu sử dụng trong quá trình thực nghiệm 15

Bảng 3.1: Công thức, thông số thiết bị bào chế NLC fluconazol bằng phương pháp nhũ hóa khuếch tán dung môi 23

Bảng 3.2: Công thức, thông số thiết bị bào chế NLC fluconazol sử dụng thiết bị đồng nhất hóa rotor – stator 24

Bảng 3.3: Ảnh hưởng của thiết bị đồng nhất hóa tới KTTP của NLC 25

Bảng 3.4: Công thức bào chế khảo sát ảnh hưởng của thời gian siêu âm 26

Bảng 3.5: Công thức bào chế khảo sát ảnh hưởng của loại lipid rắn 29

Bảng 3.6: Công thức bào chế khảo sát nồng độ Tween 40 33

Bảng 3.7: Ảnh hưởng của nồng độ Tween 40 tới KTTP của hệ NLC fluconazol 33 Bảng 3.8: Công thức bào chế khảo sát một số lipid lỏng 34

Bảng 3.9: Công thức bào chế khảo sát nồng độ dược chất 36

Bảng 3.10: Công thức và phương pháp bào chế NLC fluconazol 37

Bảng 3.11: Diện tích pic của các dung dịch fluconazol chuẩn nồng độ khác nhau 41

Hình 1.2: Ba kiểu phân bố dược chất trong tiểu phân nano lipid 3

Hình 1.3: Ảnh hưởng của nồng độ chất diện hoạt lên bề mặt, cấu trúc tiểu phân 10

Hình 2.1: Sơ đồ bào chế NLC fluconazol bằng phương pháp nhũ hóa khuếch tán dung môi .16

Hình 2.2: Sơ đồ bào chế NLC fluconazol bằng phương pháp đun chảy nhũ hóa 17

Hình 2.3: Bình Franz 20

Hình 3.1: Ảnh hưởng của thời gian siêu âm tới KTTP của hệ NLC fluconazol 27

Hình 3.2: Ảnh hưởng của phương pháp làm lạnh tới KTTP của hệ NLC fluconazol 28

Hình 3.3: Ảnh hưởng của tá dược lipid rắn tới KTTP và thế Zeta của hệ NLC fluconazol 30

Hình 3.4: Ảnh hưởng của loại chất diện hoạt tới KTTP và thế Zeta của hệ NLC fluconazol 31

Hình 3.5: Đồ thị phân bố KTTP của hệ NLC fluconazol sử dụng CDH benzalkonium clorid 32

Hình 3.6: Ảnh hưởng của một số lipid lỏng tới KTTP và thế Zeta của hệ NLC fluconazol 34

Hình 3.7: Ảnh hưởng của nồng độ hỗn hợp lipid lên KTTP của hệ NLC fluconazol 35

Hình 3.8: Độ nhớt của hệ NLC fluconazol 35

Hình 3.9: Phần trăm fluconazol giải phóng qua màng thẩm tích với các mẫu NLC fluconazol có nồng độ dược chất khác nhau 37

Hình 3.10: Kết quả đo KTTP của hệ NLC fluconazol 38

Hình 3.11: Kết quả đo thế Zeta của hệ NLC fluconazol 39

Hình 3.12: Hình ảnh chụp TEM của NLC fluconazol .39

Hình 3.13: Phổ nhiệt lượng vi sai quét của các mẫu fluconazol, alcol cetylic, F-NLC 0; 2; 20% 40

Hình 3.15: Phần trăm fluconazol giải phóng qua màng thẩm tích 42 Hình 3.16: Phần trăm fluconazol giải phóng qua da thỏ 43 Hình 3.17: Hiện tượng tháo thuốc ra khỏi hệ tiểu phân nano lipid rắn (SLN) 44

ĐẶT VẤN ĐỀ

Công nghệ nano ra đời đã đánh dấu một bước ngoặt lịch sử đối với nền công nghiệp dược phẩm, mở ra những hướng phát triển mới trong việc nghiên cứu, bào chế ra các sản phẩm mới với nhiều ưu điểm vượt trội so với các dạng bào chế quy ước Hệ tiểu phân nano lipid lần đầu tiên được nghiên cứu vào những năm đầu của thập niên 90 đã thu được nhiều thành công lớn, đặc biệt trong việc bào chế các dạng

thuốc hấp thu qua da và niêm mạc

Trong những năm gần đây, việc điều trị bệnh nấm do các loại nấm men hoại sinh gây bệnh trên da và niêm mạc đang ngày càng được quan tâm Nguyên nhân là

do các loại nấm này trong những điều kiện xác định có khả năng xâm nhập vào các khoang ổ sâu hơn trong cơ thể, làm gia tăng tỉ lệ những người bị nhiễm nấm cơ hội Thêm vào đó, các tổ chức nấm phát triển chậm và thường tồn tại ở các mô khó thấm thuốc nên điều trị các bệnh do nấm gây ra thường lâu dài và khó hơn các bệnh nhiễm khuẩn khác [2]

Fluconazol là một dẫn chất azol – nhóm thuốc hiện đang được ứng dụng rộng rãi trên lâm sàng, trong điều trị nhiễm nấm ở trên bề mặt da, niêm mạc và toàn thân do chúng có phổ kháng nấm rộng [2] Việc ứng dụng hệ đưa thuốc có cấu trúc nano sử dụng chất mang lipid vào nghiên cứu bào chế đã mở ra những hướng đi mới giúp làm kiểm soát giải phóng, tăng tính thấm, do đó làm tăng sinh khả dụng

của chế phẩm

Vì vậy, đề tài “Nghiên cứu bào chế hệ nano lipid rắn chứa fluconazol” được

tiến hành với 2 mục tiêu sau:

1 Bào chế được hệ nano lipid chứa fluconazol

2 Sơ bộ đánh giá được một số đặc tính của hệ nano lipid chứa fluconazol

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 VÀI NÉT VỀ HỆ TIỂU PHÂN NANO LIPID

1.1.1 Cấu tạo

Hệ đưa thuốc có cấu trúc nano (nanostructured systems, nanoparticles-based

system) là các hệ đưa thuốc kích cỡ nano, trong đó, dược chất có tính chất khác

nhau được lồng hay gắn vào chất mang có nguồn gốc hữu cơ hay vô cơ Các giá mang thuốc này thường được đưa vào cơ thể dưới dạng thuốc tiêm truyền

tĩnh mạch, thuốc uống, thuốc phun mù, thuốc giọt… với mục đích chính là nâng cao

sinh khả dụng, kéo dài tác dụng và đưa thuốc tới đích [5] Trong thời gian gần đây,

chất mang lipid đặc biệt được chú ý với hai dạng bào chế là SLN (solid lipid

nanoparticles) và NLC (nanostructures lipid carries)

Hình 1.1: Cấu trúc của tiểu phân SLN (trái) và NLC (phải)

Hệ tiểu phân nano lipid rắn (SLN) đã được nghiên cứu phát triển từ những

năm 1990 bằng việc thay thế lipid lỏng của một nhũ tương D/N bằng một lipid rắn

hoặc hỗn hợp nhiều lipid rắn [23] Mỗi tiểu phân có cấu tạo gồm một màng lipid

đơn, bao quanh một lõi chứa cốt lipid rắn, dược chất nằm xen kẽ trong cốt lipid ở

dạng hoà tan hoặc kết tinh Kích thước trung bình của SLN nằm trong khoảng từ 40

– 1000 nm được phân tán trong nước hoặc trong một dung dịch chất diện hoạt thân

nước [23], [27]

SLN được nghiên cứu nhiều trong bào chế các dạng thuốc nhờ những ưu

điểm như: độ ổn định vật lý cao, bảo vệ các dược chất kém bền, kiểm soát giải

phóng dược chất (giải phóng nhanh hoặc duy trì), dung nạp tốt (đặc biệt thích hợp

khi sử dụng cho các chế phẩm hấp thu qua da và niêm mạc), có thể phối hợp cả

dược chất thân nước và thân dầu, tránh được việc sử dụng dung môi hữu cơ,

dễ dàng mở rộng quy mô sản xuất [21], [27], [31] Tuy nhiên, SLN có nhiều nhược điểm như: hiệu suất nạp thuốc không cao, có hiện tượng tháo thuốc ra khỏi tiểu phân trong quá trình bảo quản do có sự chuyển dạng lipid từ dạng kém bền sang dạng bền vững hơn (hai dạng α và β’ kém bền hơn so với dạng β), hiện tượng sắp xếp lại mạng lưới tinh thể của lipid làm giảm không gian chứa dược chất [22], [23], [27], [31]

Hệ tiểu phân nano lipid thế hệ hai (NLC) đã được phát triển để khắc phục những hạn chế trên của SLN NLC được bào chế bằng cách thay thế lipid rắn trong SLN bằng hỗn hợp lipid rắn và lipid lỏng, với tỉ lệ lipid lỏng từ 0,1% đến 30%

Do thêm vào một lượng lipid lỏng trong thành phần, hỗn hợp lipid có nhiệt độ nóng chảy thấp hơn hẳn so với chỉ sử dụng lipid rắn, nhưng vẫn tồn tại ở thể rắn khi ở nhiệt độ dưới 40oC Sử dụng thêm lipid lỏng giúp ức chế quá trình tái kết tinh của các phân tử dược chất do chúng bị “trộn” lẫn trong “mạng lưới không gian” của chất mang lipid [5] So với SLN, NLC có hiệu suất nạp thuốc cao hơn, tránh được hiện tượng tháo thuốc ra khỏi hệ tiểu phân nano lipid Dược chất có thể nằm giữa các chuỗi acid béo hoặc giữa các lớp lipid trong cấu trúc của tiểu phân NLC [23]

Chất nền lipid

đồng nhất

Lớp vỏ dược chất bao quanh lõi lipid

Lớp vỏ lipid bao quanh lõi dược chất

Hình 1.2: Ba kiểu phân bố dược chất trong tiểu phân nano lipid

1.1.2 Thành phần

Các thành phần trong hệ tiểu phân nano lipid gồm có: dược chất (có thể thân dầu hoặc thân nước), lipid rắn, lipid lỏng (đối với NLC), chất diện hoạt và nước

1.1.2.1 Dược chất

Có rất nhiều dược chất khác nhau có thể được đưa vào SLN như

doxorubicin, diazepam, paclitaxel, prednisolon, acyclovir,… Điểm then chốt trong

việc lựa chọn dược chất đưa vào SLN là khả năng nạp thuốc vào lipid, được đánh

giá qua một số yếu tố, ví dụ như [22]:

- Độ tan của dược chất trong lipid chảy lỏng

- Khả năng trộn lẫn của dược chất và lipid ở thể lỏng

- Cấu trúc vật lý và hoá học của hệ lipid – dược chất

- Trạng thái đa hình của lipid

Jensen L B và cộng sự đã bào chế SLN dùng ngoài với 5 corticoid có độ tan

trong lipid khác nhau bằng phương pháp đồng nhất ở áp suất cao

Kết quả giải phóng in vitro cho thấy corticoid càng thân dầu thì sự giải phóng từ

SLN càng chậm Trái lại, những dược chất thân nước sẽ tồn tại trong pha nước

nhiều hơn nên giải phóng dược chất nhanh hơn Nguyên nhân là do những dược

chất thân dầu sẽ được hoà tan trong lipid nóng chảy nhiều hơn, nên sẽ giữ được

trong các tiểu phân nano nhiều hơn [18]

1.1.2.2 Lipid

Lipid được sử dụng thường có cấu tạo gần giống với lipid sinh lý nên an

toàn, ít độc tính đối với cơ thể khi sử dụng Lipid bao gồm nhiều loại như: glycerid

(tristearin, tripalmitat…), acid béo (acid stearic), alcol béo (alcol cetylic), steroid

(cholesterol), sáp (sáp ong, cetyl palmitat) Loại lipid sử dụng ảnh hưởng nhiều đến

các thông số của tiểu phân nano lipid như: KTTP, tốc độ kết tinh lipid, trạng thái kết

tinh, hình dạng tinh thể lipid [21]

Hầu hết các trường hợp, nếu nồng độ lipid vượt quá 5 – 10% sẽ làm tăng

KTTP (thậm chí đến kích thước micro) và khoảng phân bố kích thước mở rộng

Ghadiri M và cộng sự, Shah K A và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của tỉ lệ

lipid lên KTTP và phân bố KTTP Cả hai nghiên cứu đều cho kết quả tương tự

nhau: khi tăng tỉ lệ lipid, độ nhớt của hệ tăng do đó KTTP và PDI tăng theo

Ghadiri M và cộng sự còn nhận thấy, tăng tỉ lệ lipid (acid stearic) làm tăng hiệu

suất nạp thuốc paromomycin trong bào chế SLN Nguyên nhân do khi tăng tỉ lệ lipid làm không gian bên trong tiểu phân tăng lên, nên lượng dược chất được giữ trong những tiểu phân này nhiều hơn [12], [26]

Wang R và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của 3 loại lipid rắn có nhiệt độ nóng chảy khác nhau: acid stearic (tonóng chảy= 67 – 69oC), glyceryl monostearat

sự hình thành và cấu trúc của SLN chứa tacrolimus (FK506) – một chất có tác dụng

ức chế miễn dịch Kết quả cho thấy KTTP SLN sử dụng Compritol 888 ATO > acid stearic > glyceryl monostearat Tuy nhiên, SLN acid stearic có hiệu suất nạp thuốc cao nhất Việc sử dụng chất mang là Compritol 888 ATO có nhiệt độ nóng chảy cao

đã làm tăng độ nhớt của SLN, giải thích cho việc SLN thu được có KTTP lớn hơn 2 mẫu còn lại [30]

Ảnh hưởng của alcol béo có độ dài mạch carbon khác nhau (12C – 18C) đến

tính thấm qua da ex vivo của econazol nitrat đã được Sanna V và cộng sự nghiên

cứu Cả 4 alcol béo (alcol laurylic, alcol myristylic, alcol cetylic, alcol stearylic) đều

có hiệu suất nạp thuốc cao 95 – 99% Nguyên nhân có thể do các alcol này với mạch C dài làm cho trật tự không gian của lipid kém linh hoạt, tạo ra nhiều “khoảng trống” cho các phân tử dược chất nằm xen kẽ vào Tuy nhiên khi sử dụng alcol cetylic và alcol stearylic (16C và 18C) chế phẩm có KTTP nhỏ hơn khi sử dụng 2 alcol béo mạch carbon ngắn còn lại (12C và 14C) PDI nằm trong khoảng 0,3 - 0,4

và giá trị này giảm khi độ dài của mạch carbon tăng lên [25]

1.1.2.3 Chất diện hoạt

Chất diện hoạt có thể sử dụng đơn độc hoặc phối hợp với nhau để ngăn chặn

sự tái kết tập các tiểu phân Nồng độ chất diện hoạt ảnh hưởng rất lớn đến tính chất của hệ tiểu phân nano lipid như: KTTP, PDI, hiệu suất nạp thuốc và khả năng giải phóng dược chất Nồng độ chất diện hoạt sử dụng tốt nhất là từ 0,5 đến 5% [5] Một số chất diện hoạt thường dùng: poloxame, lecithin, phosphatidylcholin, polysorbat,… Loại chất diện hoạt sử dụng tuỳ thuộc vào đường dùng của thuốc và

bị hạn chế nhiều khi sử dụng bằng đường tiêm [21]

Liu C H và cộng sự đã nghiên cứu bào chế SLN chứa vitamin K1 (0,25 –

0,5%) dùng đường uống bằng phương pháp siêu âm Nghiên cứu đã đánh giá ảnh

hưởng của lipid (acid lauric, acid myristic, acid palmatic, acid stearic, Precirol

ATO5), chất diện hoạt thân nước (Tween 80, Tween 20, Pluronic F68), chất diện

hoạt thân dầu (Centrol 2F-SB, Myverol 18 - 04K, Span 60, Pre - 7070) đến KTTP

và độ ổn định của SLN Kết quả cho thấy, SLN được tạo thành từ Precirol ATO5

(glyceryl palmitolstearat) kết hợp với hỗn hợp hai chất nhũ hoá Pluronic F68

(poloxame 188) và Myverol 18 - 04K (glyceride dầu cọ đã hydrogen hoá) cho

KTTP nhỏ nhất và ổn định nhất SLN có dạng hình cầu, KTTP trung bình, thế Zeta,

hiệu suất nạp thuốc lần lượt là 125 nm; - 23 mV; > 85% và có thể bảo quản được ở

25oC trong 4 tháng Tương tự như nhũ tương, việc sử dụng kết hợp chất diện hoạt

thân dầu và chất diện hoạt thân nước sẽ tạo được các hệ phân tán ổn định hơn so với

việc sử dụng đơn độc một loại chất nhũ hoá [20]

1.1.3 Phương pháp bào chế

1.1.3.1 Đồng nhất hoá nhờ lực phân cắt lớn (HSH - high shear homogenization)

và siêu âm

Đây là phương pháp đầu tiên được sử dụng để nghiên cứu bào chế hệ nano

lipid trong phòng thí nghiệm do tính sẵn có của các thiết bị, dễ dàng thao tác

Trong phương pháp này, pha dầu đun chảy đã hoà tan dược chất được phối hợp từ

từ vào pha nước chứa chất diện hoạt, đồng thời khuấy ở tốc độ cao hoặc siêu âm ở

nhiệt độ cao để hình thành hệ nano nhũ tương Để nguội hoặc làm lạnh trong điều

kiện phù hợp sẽ hình thành các tiểu phân nano lipid [21]

Gambhrie M S và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng của

thời gian siêu âm đến tính chất của SLN dùng ngoài chứa dithranol Khi tăng thời gian siêu âm thì KTTP giảm, đồng thời hiệu suất nạp thuốc tăng

Nguyên nhân có thể do khi tăng thời gian siêu âm thì KTTP giảm dẫn tới diện tích

bề mặt tăng lên làm cho dược chất dễ dàng được gắn vào các tiểu phân lipid [11]

Trong nghiên cứu bào chế SLN chứa vitamin K1 (0,25 – 0,5%) dùng đường

uống bằng phương pháp siêu âm, Liu C H và cộng sự đã khảo sát ảnh hưởng của

thời gian siêu âm tới KTTP KTTP giảm từ 239 xuống còn 127 nm khi tăng thời

gian siêu âm từ 2 – 8 phút Hơn 8 phút, thời gian siêu âm không ảnh hưởng đến

KTTP nữa Tăng thời gian siêu âm cũng không làm ảnh hưởng tới hiệu suất nạp

thuốc của SLN [20]

Cả hai kỹ thuật siêu âm và HSH đều đơn giản, dễ thực hiện ở quy mô phòng

thí nhiệm Tuy nhiên, kỹ thuật siêu âm cũng có một số nhược điểm như: khi tăng

thời gian siêu âm (thường lớn hơn 15 phút) dẫn tới nguy cơ nhiễm tạp kim loại,

phân bố kích thước tiểu phân rộng Cả hai kỹ thuật đều sinh nhiều năng lượng trong

quá trình bào chế nên không thích hợp khi sử dụng cho các dược chất kém bền [29]

1.1.3.2 Đồng nhất hoá ở áp suất cao (high pressure homogenization)

Là phương pháp đã được ứng dụng rộng rãi để bào chế nano nhũ tương

(nanoemulsions) từ nhiều năm trước đây Đồng nhất hoá ở áp suất cao hiện cũng là

phương pháp hiệu quả và khả thi nhất trong bào chế hệ nano lipid, do có nhiều ưu

điểm như: KTTP thu được nhỏ hơn, thời gian sản xuất ngắn nên có thể áp dụng

rộng rãi ở qui mô công nghiệp [21], [23] Có 2 phương pháp đồng nhất hoá ở áp

suất cao được sử dụng để bào chế hệ nano lipid là đồng nhất nóng và đồng nhất lạnh

[21], [27]

Nguyên tắc: Trong thiết bị đồng nhất hoá ở áp suất cao, chất lỏng sẽ được

đẩy qua một khe hẹp kích thước vài micromet, dưới áp suất cao 100 – 2000 bar

Chất lỏng được tăng tốc trong một khoảng rất ngắn tới vận tốc rất cao (trên 1000

km/h) tạo ra lực phân cắt lớn làm giảm KTTP [21]

1.1.3.3 Phương pháp nhũ hóa khuếch tán dung môi (solvent emulsification –

diffusion)

Hoà tan dược chất và lipid trong một dung môi hữu cơ trộn lẫn được với

nước (ví dụ aceton), rồi phân tán vào pha nước chứa chất nhũ hoá Tiểu phân nano lipid được hình thành do hiện tượng khuếch tán dung môi từ pha

dầu ra pha nước Bốc hơi dung môi ở áp suất thấp sẽ thu được hệ tiểu phân nano

lipid rắn [5]

Fu-Qiang Hu và cộng sự đã nghiên cứu bào chế SLN và NLC sử dụng phương pháp khuếch tán dung môi với các loại lipid khác nhau, có hoặc không có chứa dược chất là clobetasol propionat, kết quả được đánh giá dựa trên một số đặc điểm về KTTP, khả năng giải phóng dược chất, hiệu suất nang hoá [15], [16], [17]

Bảng 1.1: Bảng tóm tắt các thí nghiệm do Fu-Qiang Hu và cộng sự tiến hành Thí nghiệm 1 2 3

Lipid rắn Monostearin Acid stearic Monostearin

triglycerids

CNH - Pluronic F68

- Natri cholat Natri dodoecyl sulfat

tự của lipid trong phân tử, giúp tạo thêm nhiều “khoảng trống” để dược chất có thể gắn thêm vào SLN thu được ở 70oC có khả năng gắn thuốc vào lipid cao hơn ở

0oC Trái lại, khả năng gắn thuốc vào NLC không bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ

Thử nghiệm in vitro cho thấy, NLC bào chế ở 70oC có khả năng giải phóng dược chất theo 2 giai đoạn: giải phóng ồ ạt trong những giờ đâu, giải phóng kéo dài sau

đó [15], [16], [17]

1.1.3.4 Phương pháp bào chế đi từ vi nhũ tương (microemulsion)

Vi nhũ tương được bào chế từ lipid có nhiệt độ nóng chảy thấp (ví dụ: acid stearic), chất diện hoạt (ví dụ: polysorbat 20, polysorbat 60, soy phosphatidylcholin,

taurodeoxycholic) sử dụng đơn độc hoặc phối hợp thêm với một số chất khác

(ví dụ: butanol, sodium monoctylphosphat) và nước Đầu tiên lipid được đun chảy

lỏng ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy của nó Sau đó, phân tán vào trong nước

có chứa chất diện hoạt đã được đun nóng ở nhiệt độ tương đương với lipid bằng

cách khuấy nhẹ tạo vi nhũ tương D/N Hoà tan vi nhũ tương nóng vào trong nước

lạnh (2 – 3oC) và tiếp tục khuấy (tỉ lệ vi nhũ tương và nước từ 1:25 – 1:50)

Sự thay đổi nhiệt độ nhanh sẽ làm cho lipid kết tinh, đồng thời ngăn chặn sự kết tụ

của các tiểu phân [5], [21], [22]

Ngoài những phương pháp bào chế kể trên còn có một số phương pháp khác

dùng để bào chế hệ tiểu phân nano lipid: phương pháp đông tụ, phương pháp sử

dụng chất lỏng siêu tới hạn, phương pháp tiếp xúc màng, phương pháp nhiệt độ đảo

pha, phương pháp phun sấy, phương pháp phun tĩnh điện [4]

1.1.4 Những hạn chế của hệ tiểu phân nano lipid

Mặc dù có rất nhiều ưu điểm như đã nêu trên nhưng hệ nano lipid cũng gặp

một số hạn chế trong quá trình bào chế và bảo quản

1.1.4.1 Sự phân huỷ của dược chất khi hình thành hệ nano lipid

Các phương pháp bào chế sử dụng nguồn năng lượng cao (đồng nhất hoá ở

áp suất cao, đồng nhất hoá nhờ lực phân cắt lớn và siêu âm) làm tăng khả năng

nhiễm tạp hoá học và đặc biệt là dễ dẫn tới phân huỷ dược chất không bền như

ADN, albumin, erythropoietin [29] Những dược chất có phân tử khối lớn hay chứa

những chuỗi dài dễ bị phân huỷ hơn dược chất có phân tử khối thấp và hình cầu [5]

1.1.4.2 Hiện tượng gel hoá

Là hiện tượng thay đổi KTTP keo và có sự chuyển dạng từ hỗn dịch có độ

nhớt thấp sang gel có độ nhớt cao trong quá trình bảo quản Nguyên nhân có thể do:

nhiệt độ cao, tiếp xúc với ánh sáng Sử dụng các chất đồng diện hoạt có độ linh

động cao như glycolat có khả năng hạn chế được hiện tượng này Hiện tượng gel

hoá có thể dự đoán trước thông qua thế Zeta [5]

Helgason T và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất diện hoạt

lên bề mặt, cấu trúc tiểu phân, cũng như sự ổn định cấu trúc của SLN

Tác giả tiến hành nghiên cứu bào chế SLN tripalmitin bằng kĩ thuật đồng nhất hoá nóng dưới áp suất cao sử dụng chất diện hoạt không ion hoá Tween 20 Nghiên cứu đã chỉ ra rằng đường kính tiểu phân ít bị ảnh hưởng khi tăng nồng độ Tween 20 từ 0 – 5%, nhưng khi sử dụng Tween 20 ở nồng độ cao giúp tránh được hiện tượng gel hoá trong quá trình bảo quản Nguyên nhân của hiện tượng gel hoá là

do các phân tử chất diện hoạt không đủ để bao hết bề mặt kị nước của các tiểu phân lipid rắn [14]

Hình 1.3: Ảnh hưởng của nồng độ chất diện hoạt lên bề mặt, cấu trúc tiểu phân 1.1.4.3 Sự chuyển dạng thù hình của lipid

Sự chuyển dạng thù hình của lipid ảnh hưởng trực tiếp đến sự kết hợp vào lipid của dược chất và sự giải phóng dược chất Do đó, SLN có hiện tượng tháo thuốc ra khỏi tiểu phân trong quá trình bảo quản do có sự chuyển dạng lipid từ dạng kém bền, có năng lượng cao (dạng α hoặc β’) sang dạng bền vững, có năng lượng thấp hơn (dạng β) Trong quá trình bào chế, sau khi nhũ hóa tạo nano nhũ tương,

hệ được làm lạnh nhanh hình thành các tiểu phân SLN, trong đó tiểu phân lipid tồn tại dưới dạng kém bền Các tiểu phân lipid này sắp xếp lộn xộn, tạo ra nhiều “không gian trống” cho dược chất Sau quá trình bảo quản, một phần các tiểu phân lipid

chuyển sang dạng bền vững hơn nên sắp xếp có trật tự hơn, làm giảm bớt

“không gian trống”, dược chất bị đào thải ra ngoài tiểu phân SLN (hiện tượng tháo thuốc) Nếu quá trình này được kiểm soát, SLN hứa hẹn là dạng bào chế giúp kiểm soát giải phóng dược chất NLC sử dụng thêm lipid lỏng làm ổn định cấu trúc

“cốt lipid rắn” đã giúp cải thiện hiện tượng tháo thuốc và kiểm soát quá trình giải phóng dược chất [23], [27], [31]

- Đặc tính: Bột kết tinh màu trắng hoặc gần như trắng [28]

- Độ tan: Ít tan trong nước (8 - 10 mg/ml), tan được trong rượu và aceton,

ít tan trong chloroform, isopropanol, tan hoàn toàn trong methanol, rất ít tan trong toluen [28]

- Nhiệt độ nóng chảy khoảng 139oC [2]

- Bảo quản ở nơi kín, nhiệt độ dưới 30oC [28]

- Độ ổn định: Tiến hành thử nghiệm độ ổn định của fluconazol ở 90oC trong các môi trường khác nhau (nước; HCl 0,1M; NaOH 0,1M;

H2O2 3%) Phần trăm fluconazol chưa bị phân hủy ở các điều kiện kể trên sau 1 giờ và 6 giờ lần lượt là > 94,13% và > 90,12% [9]

- Có tác dụng tốt với hầu hết các chủng nấm Candida, kể cả nhiễm nấm ở

giai đoạn cuối của bệnh nhân AIDS đã kháng thuốc trị nấm khác FLZ được dùng cho người bệnh không dung nạp các thuốc trị nấm thông thường hoặc khi các thuốc này không có tác dụng [1], [3]

 Chỉ định:

- Nhiễm nấm Candida ở miệng – họng, thực quản, âm hộ - âm đạo và các bệnh nhiễm nấm Candida toàn thân nghiêm trọng khác [1], [3]

- Nhiễm nấm màng não do Cryptococcus neoformans, các bệnh nấm do

Blastomyces, Coccidioides immitis và Histoplasma [1], [3]

- Dự phòng nhiễm nấm Candida cho người ghép tuỷ xương đang điều trị

bằng hoá chất hoặc tia xạ, người bệnh nhiễm HIV [1], [3]

1.2.4 Các dạng thuốc chứa fluconazol

1.2.5 Một số nghiên cứu về hệ nano lipid điều trị nấm

Das S và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu bào chế SLN và NLC clotrimazol

bằng kĩ thuật siêu âm Nghiên cứu đã so sánh hai hệ tiểu phân nano lipid SLN và

NLC thông qua các chỉ số KTTP, PDI, thế Zeta, hiệu suất nạp thuốc (drug loading), hiệu suất nang hoá (drug encapsulation efficiency), khả năng giải

phóng dược chất và độ ổn định SLN, NLC thu được có KTTP, PDI, thế Zeta,

hiệu suất nạp thuốc lần lượt là < 100 nm; < 0,17; < - 22 mV và > 82% Hình ảnh chụp SEM cho thấy các tiểu phân có kích thước <100 nm đều có hình cầu

với cả hai dạng bào chế Khi nồng độ dược chất thấp, NLC có hiệu suất nạp thuốc

cao hơn SLN; hiệu suất này tương đương nhau khi sử dụng nồng độ dược chất cao Tuy nhiên, cả hai dạng bào chế đều có khả năng kéo dài thời gian giải phóng dược

chất, rất thích hợp để nghiên cứu phát triển thành các chế phẩm dùng ngoài da,

đường uống và đường tiêm NLC khi bảo quản ở 25oC trong 3 tháng ổn định hơn

SLN về KTTP, PDI, hiệu suất nạp thuốc, hiệu suất nang hoá, khả năng giải phóng

dược chất [10]

Bhalekar M và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu bào chế SLN chứa

miconazol nitrat bằng kĩ thuật đồng nhất nóng (hot homogenization) Lipid sử dụng Compritol 888 ATO, propylene glycol giúp tăng độ tan của dược

chất trong lipid, chất diện hoạt gồm có Tween 80 và glyceryl monostearat

KTTP thu được nằm trong khoảng từ 244 đến 766 nm, hiệu suất nang hoá đạt 80 -

100%, ổn định sau 1 tháng bảo quản Công thức bào chế cho kết quả tốt nhất được

kết hợp vào gel (tá dược gel là Carbopol 940) với mục đích sử dụng ngoài da

So sánh tính thấm qua da của gel so với chế phẩm gel có trên thị trường thông qua

thử nghiệm ex vivo Kết quả cho thấy lượng dược chất hấp thu trên da khi sử dụng

gel chứa SLN là 57% cao hơn nhiều so với các chế phẩm gel trên thị trường là 30%

[6]

Kim J và cộng sự tiến hành nghiên cứu bào chế hệ nano lipid chứa

itraconazol bằng phương pháp đồng nhất hoá ở áp suất cao sử dụng đường tiêm tĩnh

mạch Việc sử dụng lipid làm chất mang giúp tăng độ tan của itraconazol, đồng thời

giúp kiểm soát thời gian giải phóng itraconazol từ hệ đưa thuốc kích thước nano

NLC itraconazol sử dụng tristearin làm lipid rắn, triolein làm lipid lỏng, chất diện

hoạt gồm eggPC, Tween 80 và DSPE - PEG 2000 với nồng độ dược chất 20 mg/g

NLC thu được lần lượt có KTTP, PDI, thế Zeta, hiệu suất nang hoá lần lượt là 280

nm; 0,2; - 30 mV và > 80% Khi sử dụng 1% lipid lỏng, NLC thu được có KTTP

nhỏ nhất và hiệu suất nang hoá cao nhất Khả năng giải phóng dược chất từ dạng

NLC phụ thuộc vào nồng độ lipid lỏng sử dụng Thử nghiệm in vitro NLC

itraconazol tiến hành trên chuột, sử dụng đường tiêm tĩnh mạch với liều 5 mg/kg

Kết quả cho thấy sau khi tiêm, nồng độ itraconazol trong huyết tương được duy trì

[19]

Gupta M và cộng sự tiến hành nghiên cứu bào chế hệ tiểu phân nano lipid

chứa fluconazol bằng phương pháp khuếch tán dung môi, mục đích sử dụng ngoài

da nhằm điều trị nhiễm nấm tại chỗ SLN và NLC thu được có KTTP, hiệu suất

nang hoá tương đương nhau, lần lượt là 178 và 134 nm; 75,7 ± 4,94%

và 81,4 ± 3,89% Nghiên cứu cũng đã chứng minh nhiều ưu điểm của NLC so với

SLN trong khả năng giải phóng dược chất qua da thông qua thử nghiệm in vitro và

in vivo Thử nghiệm in vitro cho thấy, cả SLN và NLC đều làm tăng khả năng lưu

giữ thuốc trên da gấp nhiều lần so với dung dịch thuốc với cùng nồng độ fluconazol

Thử nghiệm in vivo cho thấy, NLC kéo dài thời gian tác dụng lên gấp 5 lần so với

dạng bào chế thông thường sau 12 giờ, trong khi đó SLN chỉ tăng gấp 3,3 lần khi sử

dụng liều tương đương So với các dạng bào chế trước kia, NLC fluconazol có khả

năng kiểm soát giải phóng giúp duy trì nồng độ thuốc trên da, do đó kéo dài thời

gian lưu thuốc trên da, thích hợp trong việc điều trị nấm trên bề mặt da [13]

Như vậy, NLC hứa hẹn là dạng bào chế thích hợp trong việc nghiên cứu bào

chế các dạng thuốc chống nấm dùng ngoài da

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ

2.1.1 Nguyên vật liệu

Bảng 2.1: Nguyên vật liệu sử dụng trong quá trình thực nghiệm STT Nguyên liệu Nguồn gốc Tiêu chuẩn

1 Fluconazol Trung Quốc Nhà sản xuất

2 Acid clohydric Trung Quốc Nhà sản xuất

3 Acid oleic Trung Quốc Nhà sản xuất

4 Alcol cetylic Trung Quốc Nhà sản xuất

5 Alcol cetostearylic Trung Quốc Nhà sản xuất

6 Benzalkonium clorid Trung Quốc Nhà sản xuất

7 Cremorphor RH40 Trung Quốc Nhà sản xuất

8 Dinatri phosphat Trung Quốc Nhà sản xuất

9 Ethanol Trung Quốc Nhà sản xuất

10 Kali clorid Trung Quốc Nhà sản xuất

11 Kali dihyrophosphat Trung Quốc Nhà sản xuất

12 Labrafac Trung Quốc Nhà sản xuất

14 Natri clorid Trung Quốc Nhà sản xuất

15 Natri deoxycholat Trung Quốc Nhà sản xuất

16 Natri hydroxid Trung Quốc Nhà sản xuất

17 Natri lauryl sulfat Trung Quốc Nhà sản xuất

18 Parafin Trung Quốc Nhà sản xuất

19 Poloxame 188 Trung Quốc Nhà sản xuất

20 Span 80 Trung Quốc Nhà sản xuất

21 Triglycerid Trung Quốc Nhà sản xuất

22 Tween 20 Trung Quốc Nhà sản xuất

23 Tween 40 Hàn Quốc Nhà sản xuất

24 Tween 80 Trung Quốc Nhà sản xuất

2.1.2 Thiết bị nghiên cứu

- Máy siêu âm LABSONIC® M

- Máy khuấy từ IKA – WERKE (Đức)

- Máy đo pH EUTECH INSTRUMENTS pH 510

- Máy đo kích thước tiểu phân và thế Zeta ZETASIZER NANO ZS90 Malverin

- Máy đông khô LABCONCO

- Hệ thống đánh giá giải phóng dược chất qua màng Hanson Research

- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent

- Máy lọc nén và các thiết bị bào chế, kiểm nghiệm khác

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Phương pháp bào chế hệ tiểu phân nano lipid fluconazol

2.2.1.1 Phương pháp nhũ hóa khuếch tán dung môi

Hình 2.1: Sơ đồ bào chế NLC fluconazol bằng phương pháp nhũ hóa khuếch tán dung môi

- Hòa tan hoàn toàn chất diện hoạt thân nước vào trong 100 ml nước, đun nóng tới 70oC

- Hòa tan hoàn toàn lipid, fluconazol trong hỗn hợp dung môi hữu cơ đồng tan với nước (aceton: ethanol = 1:1) (A)

- Phối hợp nhanh (A) vào pha nước sử dụng thiết bị đồng nhất hóa rotor – stator (tốc độ 10.000 vòng/phút, thời gian 5 phút) Duy trì nhiệt độ của hệ ở

60 – 70oC bằng chức năng cấp nhiệt của máy khuấy từ, thu được nhũ tương

- Làm lạnh nhanh nhũ tương về nhiệt độ phòng thu được NLC fluconazol

2.2.1.2 Phương pháp đun chảy nhũ hóa

Hình 2.2: Sơ đồ bào chế NLC fluconazol bằng phương pháp đun chảy nhũ hóa

- Hòa tan hoàn toàn chất diện hoạt thân nước vào trong 100ml nước, đun nóng tới 70 – 80oC

- Đun chảy pha dầu (có hoặc không có chất diện hoạt thân dầu) ở 60 – 70oC, sau đó phân tán đều FLZ vào pha dầu đã đun chảy đến khi thu được dung dịch trong suốt Duy trì nhiệt độ

- Phối hợp pha dầu vào pha nước sử dụng thiết bị đồng nhất hóa rotor – stator hoặc siêu âm:

 Cách 1: sử dụng máy khuấy từ kết hợp với siêu âm ở tần số 30.000 Hz,

biên độ 100 µm

Đun chảy ở 60 – 70oC

Dược chất Nước CDH thân nước

Đun nóng ở 70 – 80oC

1 Siêu âm kết hợp khuấy từ

2 Thiết bị đồng nhất hóa rotor – stator (có

hoặc không kết hợp siêu âm + khuấy từ)

Khuấy duy trì về nhiệt độ phòng

Lipid + CDH thân

dầu (nếu có)

Nano nhũ tương Nhũ hóa

NLC fluconazol

 Cách 2: sử dụng thiết bị đồng nhất hóa rotor – stator (tốc độ 10.000

vòng/phút, thời gian 5 phút), có hoặc không kết hợp với siêu âm kèm khuấy từ (với các thông số như trên)

Luôn duy trì nhiệt độ của hệ ở 60 – 70oC bằng chức năng cấp nhiệt của máy khuấy từ, thu được nano nhũ tương

- Nano nhũ tương được làm nguội bằng cách khuấy duy trì về nhiệt độ phòng,

thu được NLC fluconazol

2.2.2 Phương pháp đánh giá hệ tiểu phân nano lipid

2.2.2.1 Đánh giá kích thước, phân bố KTTP và thế Zeta

KTTP và phân bố KTTP được xác định bằng phương pháp tán xạ lase Trước khi đo cần tiến hành pha loãng chế phẩm nhiều lần bằng nước cất đã lọc qua màng 0,2 µm để tránh hiện tượng đa tán xạ Mẫu pha loãng được đo ở điều kiện hệ

số khúc xạ ánh sáng bằng 1,3310; nhiệt độ đo 25oC

Thế Zeta được xác định gián tiếp thông qua linh độ điện di của tiểu phân nano khi đặt trong điện trường Các mẫu trước khi đo được pha loãng với nước cất

đã lọc qua màng 0,2 µm; pH 7,0

2.2.2.2 Đánh giá cấu trúc hệ nano bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM)

Nguyên tắc: dùng chùm điện tử chiếu xuyên qua mẫu vật nghiên cứu, điện tử

sẽ bị tán xạ trên các mặt tinh thể của mạng tinh thể chất Ảnh mẫu nghiên cứu xuất hiện trên màn huỳnh quang với độ phóng đại theo yêu cầu

Hình thái và kích thước tiểu phân trong hệ nano lipid được quan sát qua kính hiển vi điện tử truyền qua có độ phóng đại M = x50 – x600.000, độ phân giải

 = 3oA, điện áp gia tốc U = 40 – 100 kV

2.2.2.3 Xác định trạng thái kết tinh của dược chất

Các mẫu phân tích được làm khô trước khi phân tích nhiệt bằng cách đông khô Điều kiện tiến hành: nhiệt độ quét 10oC – 250oC, tốc độ gia nhiệt 10oC/phút, môi trường khí nitơ

2.2.2.4 Xây dựng đường chuẩn cho định lượng fluconazol bằng HPLC

Cân chính xác khoảng 0,3000 g FLZ hòa tan trong khoảng 5,0 ml methanol trong bình định mức 100 ml, sau đó thêm nước vào cho đủ thể tích thu được dung dịch A Từ dung dịch A pha loãng bằng pha động thành các dung dịch có nồng độ 120; 240; 450; 600; 900 µg/ml Lọc qua màng 0,45 µm Xây dựng đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa nồng độ FLZ và diện tích pic

2.2.2.5 Định lượng nồng độ fluconazol trong hệ nano lipid bằng HPLC

- Detector UV phát hiện ở bước sóng 261 nm

b Chuẩn bị mẫu chuẩn và mẫu thử

 Mẫu chuẩn

Cân chính xác khoảng 0,3000 g FLZ hòa tan trong khoảng 5,0 ml methanol, cho vào bình định mức 100 ml, sau đó thêm nước vào cho đủ thể tích thu được dung dịch A Từ dung dịch A pha loãng bằng nước thành dung dịch có nồng độ 24 µg/ml Lọc qua màng 0,45 µm

nano

m

m S

S X

Trong đó:

X: phần trăm khối lượng FLZ trong mẫu

2.2.2.6 Sơ bộ đánh giá khả năng giải phóng fluconazol từ hệ tiểu phân nano

lipid

a Điều kiện thử giải phóng

Đánh giá hàm lượng FLZ giải phóng từ hệ tiểu phân nano lipid qua hệ thống giải phóng qua màng Hanson Research với các điều kiện cụ thể như sau:

- Thiết bị: bình Franz

- Thể tích môi trường khuếch tán V = 7 ml

- Môi trường khuếch tán: đệm PBS (phospho buffer saline) pH 7,4

- Màng giải phóng: màng thẩm tích (12 – 14 kDa) hoặc da thỏ

Da thỏ trước khi đem thử được tiến hành xử lý trước: lựa chọn da thỏ ở vùng lưng, cạo sạch lông, loại bỏ lớp cơ và lớp mỡ dưới da Lựa chọn vùng da đồng đều, cắt miếng da thỏ sao cho đủ che phủ ngăn chứa mẫu

Ngăn cho được cải tiến để chứa được 1ml mẫu thử, ngăn nhận chứa môi trường khuếch tán, màng giải phóng được đặt giữa hai ngăn

Hình 2.3: Bình Franz

b Cách thức tiến hành

Tại thời điểm t = 0, bơm mẫu thử vào ngăn chứa mẫu Lấy mẫu tại những thời điểm nhất định: 15 phút, 30 phút, 1 giờ, từ giờ thứ 2 đến giờ thứ 6 mỗi giờ lấy một mẫu và tại thời điểm cuối cùng 24 giờ Mỗi lần lấy 1 ml Định lượng FLZ giải

phóng bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) đã nêu ở mục 2.2.3.5

c Xác định mức độ fluconazol giải phóng từ hệ nano lipid:

Mức độ giải phóng dược chất từ các mẫu thử được đánh giá qua 3 bước sau:

- Xác định nồng độ FLZ trong môi trường khuếch tán tại thời điểm t: kết quả được tính bằng cách so sánh trực tiếp với dung dịch FLZ chuẩn đã biết trước nồng độ theo công thức:

c c

St, Sc: Diện tích pic của mẫu thử và mẫu chuẩn

- Xác định lượng FLZ giải phóng từ các mẫu hỗn dịch tại thời điểm t được tính theo công thức:

Qt = V.Ct + ʋ ∑ C Trong đó:

Qt: Tổng lượng FLZ đã giải phóng tại thời điểm t (µg)

V: Thể tích môi trường khuếch tán (ml)

v : Thể tích mỗi lần lấy mẫu thử (ml)

Ct: Nồng độ FLZ trong môi trường khuếch tán tại thời điểm t (µg/ml)

Ci: Nồng độ FLZ trong môi trường khuếch tán tại thời điểm trước đó (µg/ml)

- Tính tỉ lệ phần trăm FLZ đã giải phóng từ các mẫu nghiên cứu tại thời điểm t xác định theo công thức:

Xt: Phần trăm FLZ đã giải phóng tính tới thời điểm t (%)

Qt: Lượng FLZ đã giải phóng tính tới thời điểm t (mg) M: Khối lượng FLZ có trong mẫu thử (mg)