2.2.2.1. Đánh giá kích thước, phân bố KTTP và thế Zeta
KTTP và phân bố KTTP được xác định bằng phương pháp tán xạ lase. Trước khi đo cần tiến hành pha loãng chế phẩm nhiều lần bằng nước cất đã lọc qua màng 0,2 µm để tránh hiện tượng đa tán xạ. Mẫu pha loãng được đo ở điều kiện hệ số khúc xạ ánh sáng bằng 1,3310; nhiệt độ đo 25oC.
Thế Zeta được xác định gián tiếp thông qua linh độ điện di của tiểu phân nano khi đặt trong điện trường. Các mẫu trước khi đo được pha loãng với nước cất đã lọc qua màng 0,2 µm; pH 7,0.
2.2.2.2. Đánh giá cấu trúc hệ nano bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM)
Nguyên tắc: dùng chùm điện tử chiếu xuyên qua mẫu vật nghiên cứu, điện tử sẽ bị tán xạ trên các mặt tinh thể của mạng tinh thể chất. Ảnh mẫu nghiên cứu xuất hiện trên màn huỳnh quang với độ phóng đại theo yêu cầu.
Hình thái và kích thước tiểu phân trong hệ nano lipid được quan sát qua kính hiển vi điện tử truyền qua có độ phóng đại M = x50 – x600.000, độ phân giải = 3oA, điện áp gia tốc U = 40 – 100 kV.
2.2.2.3. Xác định trạng thái kết tinh của dược chất
Các mẫu phân tích được làm khô trước khi phân tích nhiệt bằng cách đông khô. Điều kiện tiến hành: nhiệt độ quét 10oC – 250oC, tốc độ gia nhiệt 10oC/phút, môi trường khí nitơ.
2.2.2.4. Xây dựng đường chuẩn cho định lượng fluconazol bằng HPLC
Cân chính xác khoảng 0,3000 g FLZ hòa tan trong khoảng 5,0 ml methanol trong bình định mức 100 ml, sau đó thêm nước vào cho đủ thể tích thu được dung dịch A. Từ dung dịch A pha loãng bằng pha động thành các dung dịch có nồng độ 120; 240; 450; 600; 900 µg/ml. Lọc qua màng 0,45 µm. Xây dựng đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa nồng độ FLZ và diện tích pic.
2.2.2.5. Định lượng nồng độ fluconazol trong hệ nano lipid bằng HPLC
a. Điều kiện sắc ký
- Cột sắc ký C18 (5 µm), 150 mm x 4,6 mm. - Pha động: Methanol : nước = 60 : 40. - Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút.
- Thể tích tiêm mẫu: 20 µl.
- Detector UV phát hiện ở bước sóng 261 nm.
b. Chuẩn bị mẫu chuẩn và mẫu thử
Mẫu chuẩn
Cân chính xác khoảng 0,3000 g FLZ hòa tan trong khoảng 5,0 ml methanol, cho vào bình định mức 100 ml, sau đó thêm nước vào cho đủ thể tích thu được dung dịch A. Từ dung dịch A pha loãng bằng nước thành dung dịch có nồng độ 24 µg/ml. Lọc qua màng 0,45 µm.
Mẫu thử
Sử dụng trực tiếp 1ml mẫu thử giải phóng qua thiết bị đánh giá giải phóng dược chất qua màng Hanson Research ở những thời điểm khác nhau (mục
2.2.2.6.b).
c. Xác định hàm lượng fluconazol bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng
cao
Phương pháp so sánh dựa vào diện tích pic của dung dịch chuẩn và thử:
100 nano chuan chuan nano m m S S X
Trong đó:
X: phần trăm khối lượng FLZ trong mẫu.
Snano, Schuan : diện tích pic mẫu nano FLZ, mẫu FLZ chuẩn.
mchuan, mthu: khối lượng FLZ chuẩn, FLZ thử.
2.2.2.6. Sơ bộ đánh giá khả năng giải phóng fluconazol từ hệ tiểu phân nano
lipid
a. Điều kiện thử giải phóng
Đánh giá hàm lượng FLZ giải phóng từ hệ tiểu phân nano lipid qua hệ thống giải phóng qua màng Hanson Research với các điều kiện cụ thể như sau:
- Thiết bị: bình Franz.
- Thể tích môi trường khuếch tán V = 7 ml.
- Môi trường khuếch tán: đệm PBS (phospho buffer saline) pH 7,4. NaCl: 8,01 g KCl: 0,2 g Na2HPO4.12H2O: 3,58 g KH2PO4: 0,27 g H2O vừa đủ: 1.000 ml - Nhiệt độ thử: 37oC ± 0,5. - Diện tích thử: 0,785 cm2. - Tốc độ khuấy: 400 vòng/phút. - Thể tích mẫu thử: 1 ml.
- Màng giải phóng: màng thẩm tích (12 – 14 kDa) hoặc da thỏ.
Da thỏ trước khi đem thử được tiến hành xử lý trước: lựa chọn da thỏ ở vùng lưng, cạo sạch lông, loại bỏ lớp cơ và lớp mỡ dưới da. Lựa chọn vùng da đồng đều, cắt miếng da thỏ sao cho đủ che phủ ngăn chứa mẫu.
Ngăn cho được cải tiến để chứa được 1ml mẫu thử, ngăn nhận chứa môi trường khuếch tán, màng giải phóng được đặt giữa hai ngăn.
b. Cách thức tiến hành
Tại thời điểm t = 0, bơm mẫu thử vào ngăn chứa mẫu. Lấy mẫu tại những thời điểm nhất định: 15 phút, 30 phút, 1 giờ, từ giờ thứ 2 đến giờ thứ 6 mỗi giờ lấy một mẫu và tại thời điểm cuối cùng 24 giờ. Mỗi lần lấy 1 ml. Định lượng FLZ giải phóng bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) đã nêu ở mục 2.2.3.5.
c. Xác định mức độ fluconazol giải phóng từ hệ nano lipid:
Mức độ giải phóng dược chất từ các mẫu thử được đánh giá qua 3 bước sau: - Xác định nồng độ FLZ trong môi trường khuếch tán tại thời điểm t: kết quả
được tính bằng cách so sánh trực tiếp với dung dịch FLZ chuẩn đã biết trước nồng độ theo công thức: c c t t C S S C Trong đó:
Ct: Nồng độ FLZ trong môi trường khuếch tán tại thời điểm t (µg/ml). Cc: Nồng độ mẫu chuẩn (µg/ml).
St, Sc: Diện tích pic của mẫu thử và mẫu chuẩn.
- Xác định lượng FLZ giải phóng từ các mẫu hỗn dịch tại thời điểm t được tính theo công thức:
Qt = V.Ct + ʋ . ∑ C
Trong đó:
Qt: Tổng lượng FLZ đã giải phóng tại thời điểm t (µg). V: Thể tích môi trường khuếch tán (ml).
v : Thể tích mỗi lần lấy mẫu thử (ml).
Ct: Nồng độ FLZ trong môi trường khuếch tán tại thời điểm t (µg/ml). Ci: Nồng độ FLZ trong môi trường khuếch tán tại thời điểm trước đó (µg/ml).
- Tính tỉ lệ phần trăm FLZ đã giải phóng từ các mẫu nghiên cứu tại thời điểm t xác định theo công thức:
100 M Q X t t Trong đó:
Xt: Phần trăm FLZ đã giải phóng tính tới thời điểm t (%). Qt: Lượng FLZ đã giải phóng tính tới thời điểm t (mg). M: Khối lượng FLZ có trong mẫu thử (mg).
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT