ĐẶT VẤN ĐỀViệt Nam là quốc gia nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa, có hệ thực vật vô cùng phong phú và đa dạng. Bên cạnh đó Việt Nam còn được thừa hưởng một nền y học cổ truyền phát triển từ rất lâu đời. Vì vậy, nguồn dược liệu dồi dào cùng với vốn kinh nghiệm sử dụng của các dân tộc chính là một nguồn nguyên liệu vô cùng quý giá cho các nghiên cứu về hợp chất thiên nhiên, cũng như những nghiên cứu vềhoạt tính sinh học theo hướng hiện đại. Trong những năm gần đây, cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, các nhà khoa học đã chứng minh sự có mặt của gốc tự do trong hệ thống sinh học 23. Các gốc tự do sinh ra trong cơ thể gây ra nhiều hậu quả nghiêm trọng như gây ra các bệnh: ung thư, bệnh tim mạch, tiểu đường, các bệnh thoái hóa thần kinh, viêm khớp dạng thấp, lão hóa 25, 32, 43. Chính vì vậy, các nhà khoa học đã nghiên cứu và phát hiện các chất có khả năng phân hủy, loại bỏ các gốc tự do, chúng được gọi là các chất chống oxy hóa như: các enzym (superoxid dismutase, glutathione peroxidase, catalase…), acid ascorbic, αtocopherol, glutathione, carotenoid, flavonid,…Theo hướng nghiên cứu đó, hiện nay đã có nhiều công bố về tác dụng chống ung thư, chống oxy hóa, tác dụng hạ đường huyết 39, 41 của dược liệu hạt Vải (Semen Litchi). Trong y học cổ truyền Việt Nam, hạt Vải đã được sử dụng đểđiều trị nhiều chứng bệnh như: chữa đau dạ dày, chữa răng sưng đau có sâu…Tuy nhiên, các đề tài nghiên cứu về dược liệu hạt Vải ở Việt Nam còn hạn chế. Để góp phần tăng thêm sự hiểu biết về nguồn thực vật làm thuốc của Việt Nam, chúng tôi thực hiện đề tài “ Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng sinh học của hạt Vải ( Semen Litchi ) với 2 mục tiêu:
BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN VIỆT DŨNG NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT VÀ TIÊU CHUẨN HÓA CAO BÁN THÀNH PHẨM DIẾP CÁ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2014 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN VIỆT DŨNG NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT VÀ TIÊU CHUẨN HÓA CAO BÁN THÀNH PHẨM DIẾP CÁ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: 1. TS. Trần Minh Ngọc 2. ThS. Thân Thị Kiều My Nơi thực hiện: Viện Dược liệu HÀ NỘI – 2014 LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến toàn thể thầy cô giáo và cán bộ trong trường Đại học Dược Hà Nội đã nhiệt tình chỉ bảo, giúp đỡ và mang lại cho tôi những kiến thức cùng kinh nghiệm quý báu trong suốt 5 năm học vừa qua Tôi xin chân thành cảm ơn ThS. Thân Thị Kiều My, giảng viên bộ môn Dược liệu - Trường Đại học Dược Hà Nội; TS. Trần Minh Ngọc, Khoa Bào chế- Chế biến - Viện Dược liệu đã trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ tôi nhiệt tình trong suốt quá trình thực hiện nghiên cứu và tạo điều kiện tốt nhất để tôi có thể hoàn thiện đề tài khóa luận này. Tôi xin cảm ơn ThS. Phạm Tuấn Anh, giảng viên Bộ môn Dược liệu - Trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ, chỉ bảo, động viên trong quá trình tôi thực hiện khóa luận. Tôi cũng xin cảm ơn các anh chị Khoa Bào chế - Chế biến, Viện Dược liệu đã tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tận tình trong thời gian tôi nghiên cứu ở đây. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè người thân luôn động viên, khích lệ ủng hộ, là động lực không nhỏ để tôi có kết quả ngày hôm nay. Chân thành cảm ơn. Hà Nội, tháng 5 năm 2014 Sinh viên Nguyễn Việt Dũng MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2 1.1. Vị trí phân loại 2 1.2. Đặc điểm thực vật 2 1.3. Phân bố 2 1.4. Bộ phận dùng 3 1.5. Thành phần hóa học 3 1.6. Tác dụng dược lý 10 1.7. Công dụng 12 1.8. Một số chế phẩm chứa diếp cá trên thị trường 13 CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị 15 2.2. Nội dung nghiên cứu 16 2.3. Phương pháp nghiên cứu 16 CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20 3.1. Xác định hàm lượng flavonoid toàn phần trong dược liệu 20 3.2 Nghiên cứu qui trình chiết xuất cao diếp cá 23 3.3. Khảo sát phương pháp loại tạp làm giàu flavonoid 30 3.4. Xây dựng điều kiện chiết xuất chung 32 3.5. Kết quả kiểm tra các chỉ tiêu cao diếp cá giàu flavonoid 35 3.8. Bàn luận 39 KẾT LUẬN Error! Bookmark not defined. ĐỀ XUẤT 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT EtOH Ethanol EtOAc Ethyl acetat MeOH Methanol SD Độ lệch chuẩn STT Số thứ tự TLTK Tài liệu tham khảo TT Thuốc thử UV – VIS Tử ngoại – khả kiến (Ultraviolet – Visible) DANH MỤC BẢNG BIỂU STT Tên bảng biểu Trang 1 Bảng 1.1. Các hợp chất flavonoid có trong cây diếp cá 3 2 Bảng 1.2. Một số hợp chất polyphenol có trong cây diếp cá 5 3 Bảng 1.3. Một số thành phần chính có trong tinh dầu diếp cá 6 4 Bảng 1.4. Các hợp chất alkaloid trong cây diếp cá 9 5 Bảng 3.1. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của quercitrin 21 6 Bảng 3.2. Kết quả định lượng flavonoid toàn phần trong dược liệu diếp cá 23 7 Bảng 3.3. Hiệu suất chiết xuất và hàm lượng flavonoid toàn phần trong cao diếp cá khi chiết sử dụng các dung môi khác nhau 24 8 Bảng 3.4. Hiệu suất chiết xuất và hàm lượng flavonoid toàn phần trong cao diếp cá khi chiết ở các nhiệt độ khác nhau 26 9 Bảng 3.5. Khối lượng cao thu được từ các lần chiết ở các thời gian chiết khác nhau 27 10 Bảng 3.6. Hiệu suất chiết xuất và hàm lượng flavonoid toàn phần trong cao diếp cá khi chiết với tỉ lệ dược liệu/ dung môi khác nhau 28 11 Bảng 3.7. Hiệu suất chiết xuất và hàm lượng flavonoid toàn phần trong cao diếp cá đã loại tạp khi sử dụng phương pháp loại tạp khác nhau 31 12 Bảng 3.8. Hiệu suất chiết xuất và hàm lượng flavonoid toàn phần trong sản phẩm tiến hành với quy mô 1kg dược liệu 35 13 Bảng 3.9. Độ ẩm các mẫu cao diếp cá 35 14 Bảng 3.10. Tro toàn phần của cao diếp cá 36 15 Bảng 3.11. Kết quả định tính bằng phản ứng hóa học 37 16 Bảng 3.12. Kết quả định lượng flavonoid toàn phần trong 3 mẫu cao 39 DANH MỤC HÌNH VẼ ĐỒ THỊ STT Tên hình vẽ, đồ thị Trang 1 Hình 1.1. Ảnh cây diếp cá 2 2 Hình 1.2. Khung cấu trúc chung của các hợp chất flavonoid trong diếp cá. 3 3 Hình 1.3. Chế phẩm Ceditan của công ty cổ phần dược phẩm 3/2 13 4 Hình 1.4. Chế phẩm Helaf của công ty cổ phần dược Hậu Giang 13 5 Hình 1.5. Chế phẩm An trĩ vương 14 6 Hình 3.1. Hình ảnh phổ UV-VIS của dung dịch mẫu chuẩn quercitrin 120 µg/ml 21 7 Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa độ hấp thụ và nồng độ quercitrin chuẩn 22 8 Hình 3.3. Sơ đồ quy trình chiết xuất với các điều kiện đã khảo sát 29 9 Hình 3.4. Sơ đồ loại tạp sử dụng EtOAc 32 10 Hình 3.5. Sơ đồ loại tạp bằng EtOAc sử dụng cao lỏng diếp cá 32 11 Hình 3.6. Sơ đồ quy trình chiết xuất cao diếp cá giàu flavonoid 34 12 Hình 3.7. Ảnh chụp sắc kí đồ của cao diếp cá. 38 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay trên thế giới, xu hướng tìm kiếm và sử dụng sản phẩm chăm sóc sức khỏe có nguồn gốc từ nhiên ngày càng tăng. Con người có khuynh hướng sử dụng nhiều thuốc có nguồn gốc từ thiên nhiên do hiệu quả điều trị cũng như ít tác dụng phụ hơn thuốc tân dược. Việt Nam chúng ta cũng không nằm ngoài xu hướng đó. Điều kiện tự nhiên ưu đãi cho đất nước ta có hệ sinh thái phong phú và đa dạng, có tiềm năng to lớn về tài nguyên cây thuốc. Đất đai và khí hậu nhiệt đới gió mùa phù hợp với nhiều loài cây trồng, trong đó có nhiều loài cây thuốc quý. Đây chính là tiền đề tốt để ngành Dược phát triển thuốc từ dược liệu. Diếp cá là loài thực vật phổ biến ở Việt Nam. Diếp cá không chỉ được sử dụng làm rau ăn hàng ngày mà còn được sử dụng làm thuốc với nhiều công dụng như: trị mụn nhọt, trĩ, viêm ruột, lở ngứa…[6]. Các thành phần đã được nghiên cứu xác định trong diếp cá như: flavonoid [24], tinh dầu [15], alkaloid [16] trong đó flavonoid là thành phần chính có nhiều tác dụng: chống viêm, phòng chống ung thư, chống oxy hóa [12]…Do đó có thể thấy công dụng điều trị của cao diếp cá do các hợp chất flavonoid. Hiện nay diếp cá được nhiều Công ty dược phẩm trong nước quan tâm nghiên cứu, sản xuất thành các sản phẩm lưu hành trên thị trường như An trĩ vương, Herlaf…với thành phần chính là cao diếp cá. Tiến hành nghiên cứu quy trình chiết xuất sẽ giúp xác định các điều kiện chiết xuất tối ưu nhằm thu được cao diếp cá giàu flavonoid, góp phần đảm bảo chất lượng cao thuốc khi đưa vào sản xuất. Ngoài ra, trước khi đưa vào sản xuất cần phải đánh giá chất lượng cao diếp cá, do đó đó việc xây dựng tiêu chuẩn cao thuốc rất có ý nghĩa trong việc kiểm soát chất lượng nguồn nguyên liệu đầu vào này. Vì vậy, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu chiết xuất và tiêu chuẩn hóa cao bán thành phẩm Diếp cá” với các mục tiêu sau: - Nghiên cứu quy trình chiết xuất cao bán thành phẩm diếp cá giàu flavonoid. - Tiêu chuẩn hóa cao bán thành phẩm diếp cá giàu flavonoid. 2 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Vị trí phân loại Cây Diếp cá còn được là Ngư tinh thảo, giấp cá hay lá dấp. Diếp cá có tên khoa học là Houttuynia cordata Thunb. Theo “Thực vật dược” năm 2007 [1] và hệ thống phân loại thực vật Takhtajan năm 1987, vị trí phân loại của diếp cá như sau: Ngành Ngọc lan Magnoliophyta Lớp Ngọc lan Magnoliopsida Phân lớp Ngọc lan Magnoliidae Bộ Hồ tiêu Piperrales Họ Lá dấp Saururaceae Chi Diếp cá Houttuynia 1.2. Đặc điểm thực vật Cây thuộc thảo, thân ngầm, rễ mọc ở các đốt. Thân trên mặt đất mọc đứng cao 40cm, có lông. Lá hình tim, mềm nhẵn, mặt dưới tím nhạt, khi vò có mùi tanh như cá do đó có tên gọi diếp cá hay ngư tinh thảo. Cụm hoa là bông, màu vàng không có bao hoa, có 4 lá bắc trắng, tất cả trông như 1 hoa. Quả nang mở ở đỉnh [4]. Hình 1.1. Ảnh cây diếp cá 1.3. Phân bố Chi Houttuynia chỉ có 1 loài diếp cá, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới châu Á, từ Nhật Bản, Trung Quốc đến Việt Nam, Lào, Ấn Độ và các nước 3 Đông Nam Á khác. Ở Việt Nam, cây mọc hoang dại ở các tỉnh miền núi, trung du và đồng bằng. Cây được trồng nhiều nơi để làm rau và làm thuốc. Diếp cá thuộc loại cây ưa ẩm và hơi chịu nóng. Cây sinh trưởng gần như quanh năm, mạnh nhất trong mùa xuân hè [5],[6]. 1.4. Bộ phận dùng Toàn cây, trừ rễ, hái về dùng tươi hoặc phơi sấy khô [6]. 1.5. Thành phần hóa học 1.5.1. Flavonoid Diếp cá có thành phần flavonoid khá phong phú. Các hợp chất flavonoid trong diếp cá có khung cấu trúc chung là OOR 7 OH O OR 3 OH R 3 ' Hình 1.2. Khung cấu trúc chung của các hợp chất flavonoid trong diếp cá Một số flavonid đáng chú ý trong diếp cá được trình bày trong bảng 1.1. Bảng 1.1. Các hợp chất flavonoid có trong cây diếp cá STT Tên chất Cấu trúc hóa học TLTK 1 Quercetin [24],[30], [31] 2 Quercitrin OOH OH O O OH OH O OH OH OH [24],[30], [31] [...]... liệu/dung môi chiết xuất + Nhiệt độ chiết xuất + Thời gian chiết xuất + Số lần chiết xuất - Tiến hành nghiên cứu phương pháp loại tạp để làm giàu flavonoid trong cao diếp cá - Dựa trên các khảo sát về điều kiện chiết xuất và phương pháp loại tạp đưa ra quy trình chiết xuất cao diếp cá Từ đó khảo sát độ ổn định của quy trình chiết xuất về hiệu suất chiết, hàm lượng flavonoid toàn phần trong cao - Tiêu chí... thân diếp cá chứa tinh dầu, đây là thành phần làm diếp cá có mùi đặc biệt Trong thành phần tinh dầu diếp cá đã xác định được 346 chất [12] Thành phần chủ yếu của tinh dầu diếp cá là các aldehyd và dẫn chất của ceton Ngoài ra tinh dầu diếp cá chứa các hợp chất terpen, các acid hữu cơ, alcol Một số thành phần chính của tinh dầu diếp cá đã được xác định trình bày trong bảng 1.3 Bảng 1.3 Một số thành phần. .. độ lệch chuẩn tính toàn bằng phần mềm MICROSOFT EXCEL 2.3.3 Xây dựng tiêu chuẩn của cao Diếp cá Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho cao diếp cá dựa trên các chỉ tiêu quy định tại Dược điển Việt Nam, gồm các chỉ tiêu: - Cảm quan: Mô tả màu sắc, mùi vị cao diếp cá 19 - Độ ẩm: Thể chất cao được quy định dựa vào độ ẩm Cao lỏng được quy ước 1ml cao tương ứng 1g dược liệu, cao đặc độ ẩm không quá 20% và không... 3.2 Nghiên cứu qui trình chiết xuất cao diếp cá 3.2.1 Khảo sát dung môi chiết xuất Do EtOH ở các nồng độ khác nhau và nước có thể chiết được phần lớn flavonoid, vì vậy tiến hành khảo sát quy trình chiết xuất sử dụng các dung môi khác nhau là EtOH 96%, EtOH 75%, EtOH 50%, EtOH 25% và nước với phương pháp chiết xuất sử dụng là chiết hồi lưu cách thủy Tiến hành: Dược liệu diếp cá sấy khô, xay thành bột... tính, định lượng flavonoid toàn phần 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Nghiên cứu qui trình chiết xuất cao diếp cá giàu flavonoid qui mô phòng thí nghiệm - Nghiên cứu xây dựng qui trình chiết xuất cao diếp cá dựa vào việc khảo sát lựa chọn: + Dung môi phù hợp với nguyên tắc an toàn, dễ kiếm, hiệu quả kinh tế: EtOH, nước được lựa chọn để nghiên cứu + Lựa chọn phương pháp chiết xuất: Đun hồi lưu, ngâm lạnh…... tinh các loại: Bình gạn 1 lít, 2 lít; bình cầu 250ml, 500ml, 1lít, 2lít, phễu thủy tinh 2.2 Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu xây dựng quy trình chiết xuất dựa trên các khảo sát về dung môi dùng để chiết xuất, tỷ lệ giữa dược liệu và dung môi, nhiệt độ chiết, thời gian chiết - Xây dựng tiêu chuẩn của cao diếp cá giàu flavonoid theo Dược điển Việt Nam IV với các chỉ tiêu: Cảm quan, độ ẩm, tro toàn phần, ... quercitrin trong mẫu dược liệu diếp cá (µg/ml) P: Khối lượng mẫu dược liệu diếp cá (g) W: Độ ẩm của mẫu dược liệu diếp cá (%) + Hàm lượng flavonoid toàn phần tính theo quercitrin trong cao diếp cá được xác định theo công thức: X(%) = C’: nồng độ flavonoid toàn phần tính theo quercitrin trong mẫu cao diếp cá (µg/ml) P’: Khối lượng mẫu cao diếp cá (g) W’: Độ ẩm của mẫu cao diếp cá (%) - Xử lý kết quả: kết... dịch chiết, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm đến cao Sau khi chiết và cô đến cao, cân khối lượng cao và định lượng flavonoid toàn phần trong cao bằng phương pháp quang phổ tử ngoại Từ kết quả định lượng ta sẽ lựa chọn được dung môi chiết xuất thích hợp Kết quả khảo sát dung môi chiết xuất được trình bày trong bảng 3.3 Bảng 3.3 Hiệu suất chiết xuất và hàm lượng flavonoid toàn phần trong cao diếp cá. .. OH 1.5.5 Các thành phần khác Theo nghiên cứu của Phạm Văn Cư và các đồng nghiệp, trên mẫu diếp cá ở tỉnh Thừa Thiên Huế đã phân lập ra các hợp chất sterols là β-sistosterol, campesterol, stigmasterol [3] 10 Ngoài ra trong diếp cá còn chứa các nguyên tố vi lượng Fe, Mn, Mg [11] 1.6 Tác dụng dược lý 1.6.1 Tác dụng chống virus Tác dụng kháng nhiều loại virus của diếp cá đã được nghiên cứu Thành phần tạo... dịch chiết nước của diếp cá Kết quả cho thấy các thành phần trong diếp cá chiết xuất có tác dụng ngăn chặn 5 dòng tế bào này [8] 12 Ngoài ra, trên 1 nghiên cứu khác trên mô hình in vitro cho thấy các alkaloid trong diếp cá có tác dụng chống lại 5 dòng tế bào gây ung thư ở người là A-549, SK-OV-3, SK-MEL-2,XF-498, HCT-15 [16] 1.7 Công dụng Theo y học cổ truyền, diếp cá có vị cay, hơi lạnh, hơi độc vào . đầu vào này. Vì vậy, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài Nghiên cứu chiết xuất và tiêu chuẩn hóa cao bán thành phẩm Diếp cá với các mục tiêu sau: - Nghiên cứu quy trình chiết xuất cao bán thành. Herlaf…với thành phần chính là cao diếp cá. Tiến hành nghiên cứu quy trình chiết xuất sẽ giúp xác định các điều kiện chiết xuất tối ưu nhằm thu được cao diếp cá giàu flavonoid, góp phần đảm bảo. suất chiết xuất và hàm lượng flavonoid toàn phần trong cao diếp cá khi chiết sử dụng các dung môi khác nhau 24 8 Bảng 3.4. Hiệu suất chiết xuất và hàm lượng flavonoid toàn phần trong cao diếp