Nghiên cứu chiết xuất và tiêu chuẩn hóa cao bán thành phần diếp cá

ĐẶT VẤN ĐỀViệt Nam là quốc gia nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa, có hệ thực vật vô cùng phong phú và đa dạng. Bên cạnh đó Việt Nam còn được thừa hưởng một nền y học cổ truyền phát triển từ rất lâu đời. Vì vậy, nguồn dược liệu dồi dào cùng với vốn kinh nghiệm sử dụng của các dân tộc chính là một nguồn nguyên liệu vô cùng quý giá cho các nghiên cứu về hợp chất thiên nhiên, cũng như những nghiên cứu vềhoạt tính sinh học theo hướng hiện đại. Trong những năm gần đây, cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, các nhà khoa học đã chứng minh sự có mặt của gốc tự do trong hệ thống sinh học 23. Các gốc tự do sinh ra trong cơ thể gây ra nhiều hậu quả nghiêm trọng như gây ra các bệnh: ung thư, bệnh tim mạch, tiểu đường, các bệnh thoái hóa thần kinh, viêm khớp dạng thấp, lão hóa 25, 32, 43. Chính vì vậy, các nhà khoa học đã nghiên cứu và phát hiện các chất có khả năng phân hủy, loại bỏ các gốc tự do, chúng được gọi là các chất chống oxy hóa như: các enzym (superoxid dismutase, glutathione peroxidase, catalase…), acid ascorbic, αtocopherol, glutathione, carotenoid, flavonid,…Theo hướng nghiên cứu đó, hiện nay đã có nhiều công bố về tác dụng chống ung thư, chống oxy hóa, tác dụng hạ đường huyết 39, 41 của dược liệu hạt Vải (Semen Litchi). Trong y học cổ truyền Việt Nam, hạt Vải đã được sử dụng đểđiều trị nhiều chứng bệnh như: chữa đau dạ dày, chữa răng sưng đau có sâu…Tuy nhiên, các đề tài nghiên cứu về dược liệu hạt Vải ở Việt Nam còn hạn chế. Để góp phần tăng thêm sự hiểu biết về nguồn thực vật làm thuốc của Việt Nam, chúng tôi thực hiện đề tài “ Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng sinh học của hạt Vải ( Semen Litchi ) với 2 mục tiêu:

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

HÀ NỘI - 2014

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến toàn thể thầy cô giáo và cán bộ trong trường Đại học Dược Hà Nội đã nhiệt tình chỉ bảo, giúp đỡ và mang lại cho tôi

những kiến thức cùng kinh nghiệm quý báu trong suốt 5 năm học vừa qua

Tôi xin chân thành cảm ơn ThS Thân Thị Kiều My, giảng viên bộ môn Dược liệu - Trường Đại học Dược Hà Nội; TS Trần Minh Ngọc, Khoa Bào chế-

Chế biến - Viện Dược liệu đã trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ tôi nhiệt tình trong suốt quá trình thực hiện nghiên cứu và tạo điều kiện tốt nhất để tôi có thể hoàn thiện đề tài khóa luận này

Tôi xin cảm ơn ThS Phạm Tuấn Anh, giảng viên Bộ môn Dược liệu -

Trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ, chỉ bảo, động viên trong quá trình tôi thực hiện khóa luận

Tôi cũng xin cảm ơn các anh chị Khoa Bào chế - Chế biến, Viện Dược liệu đã tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tận tình trong thời gian tôi nghiên cứu ở đây

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè người thân luôn động viên, khích lệ ủng hộ, là động lực không nhỏ để tôi có kết quả ngày hôm nay

Chân thành cảm ơn

Nguyễn Việt Dũng

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Vị trí phân loại 2

1.2 Đặc điểm thực vật 2

1.3 Phân bố 2

1.4 Bộ phận dùng 3

1.5 Thành phần hóa học 3

1.6 Tác dụng dược lý 10

1.7 Công dụng 12

1.8 Một số chế phẩm chứa diếp cá trên thị trường 13

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 15

2.2 Nội dung nghiên cứu 16

2.3 Phương pháp nghiên cứu 16

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20

3.1 Xác định hàm lượng flavonoid toàn phần trong dược liệu 20

3.2 Nghiên cứu qui trình chiết xuất cao diếp cá 23

3.3 Khảo sát phương pháp loại tạp làm giàu flavonoid 30

3.4 Xây dựng điều kiện chiết xuất chung 32

3.5 Kết quả kiểm tra các chỉ tiêu cao diếp cá giàu flavonoid 35

3.8 Bàn luận 39

KẾT LUẬN Error! Bookmark not defined ĐỀ XUẤT 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO 42

DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG BIỂU

1 Bảng 1.1 Các hợp chất flavonoid có trong cây diếp cá 3

2 Bảng 1.2 Một số hợp chất polyphenol có trong cây diếp cá 5

3 Bảng 1.3 Một số thành phần chính có trong tinh dầu diếp cá 6

4 Bảng 1.4 Các hợp chất alkaloid trong cây diếp cá 9

5 Bảng 3.1 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của quercitrin 21

6 Bảng 3.2 Kết quả định lượng flavonoid toàn phần trong dược

liệu diếp cá

23

7 Bảng 3.3 Hiệu suất chiết xuất và hàm lượng flavonoid toàn

phần trong cao diếp cá khi chiết sử dụng các dung môi khác

nhau

24

8 Bảng 3.4 Hiệu suất chiết xuất và hàm lượng flavonoid toàn

phần trong cao diếp cá khi chiết ở các nhiệt độ khác nhau

26

9 Bảng 3.5 Khối lượng cao thu được từ các lần chiết ở các thời

gian chiết khác nhau

27

10 Bảng 3.6 Hiệu suất chiết xuất và hàm lượng flavonoid toàn

phần trong cao diếp cá khi chiết với tỉ lệ dược liệu/ dung môi

khác nhau

28

11 Bảng 3.7 Hiệu suất chiết xuất và hàm lượng flavonoid toàn

phần trong cao diếp cá đã loại tạp khi sử dụng phương pháp

loại tạp khác nhau

31

12 Bảng 3.8 Hiệu suất chiết xuất và hàm lượng flavonoid toàn

phần trong sản phẩm tiến hành với quy mô 1kg dược liệu

35

13 Bảng 3.9 Độ ẩm các mẫu cao diếp cá 35

14 Bảng 3.10 Tro toàn phần của cao diếp cá 36

15 Bảng 3.11 Kết quả định tính bằng phản ứng hóa học 37

16 Bảng 3.12 Kết quả định lượng flavonoid toàn phần trong 3

mẫu cao

39

3 Hình 1.3 Chế phẩm Ceditan của công ty cổ phần dược phẩm 3/2 13

4 Hình 1.4 Chế phẩm Helaf của công ty cổ phần dược Hậu Giang 13

8 Hình 3.3 Sơ đồ quy trình chiết xuất với các điều kiện đã khảo sát 29

9 Hình 3.4 Sơ đồ loại tạp sử dụng EtOAc 32

10 Hình 3.5 Sơ đồ loại tạp bằng EtOAc sử dụng cao lỏng diếp cá 32

11 Hình 3.6 Sơ đồ quy trình chiết xuất cao diếp cá giàu flavonoid 34

12 Hình 3.7 Ảnh chụp sắc kí đồ của cao diếp cá 38

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay trên thế giới, xu hướng tìm kiếm và sử dụng sản phẩm chăm sóc sức khỏe có nguồn gốc từ nhiên ngày càng tăng Con người có khuynh hướng sử dụng nhiều thuốc có nguồn gốc từ thiên nhiên do hiệu quả điều trị cũng như ít tác dụng phụ hơn thuốc tân dược Việt Nam chúng ta cũng không nằm ngoài xu hướng đó Điều kiện tự nhiên ưu đãi cho đất nước ta có hệ sinh thái phong phú và đa dạng, có tiềm năng to lớn về tài nguyên cây thuốc Đất đai và khí hậu nhiệt đới gió mùa phù hợp với nhiều loài cây trồng, trong đó có nhiều loài cây thuốc quý Đây chính là tiền

đề tốt để ngành Dược phát triển thuốc từ dược liệu

Diếp cá là loài thực vật phổ biến ở Việt Nam Diếp cá không chỉ được sử dụng làm rau ăn hàng ngày mà còn được sử dụng làm thuốc với nhiều công dụng như: trị mụn nhọt, trĩ, viêm ruột, lở ngứa…[6] Các thành phần đã được nghiên cứu xác định trong diếp cá như: flavonoid [24], tinh dầu [15], alkaloid [16] trong đó flavonoid là thành phần chính có nhiều tác dụng: chống viêm, phòng chống ung thư, chống oxy hóa [12]…Do đó có thể thấy công dụng điều trị của cao diếp cá do các hợp chất flavonoid Hiện nay diếp cá được nhiều Công ty dược phẩm trong nước quan tâm

nghiên cứu, sản xuất thành các sản phẩm lưu hành trên thị trường như An trĩ vương,

Herlaf…với thành phần chính là cao diếp cá Tiến hành nghiên cứu quy trình chiết

xuất sẽ giúp xác định các điều kiện chiết xuất tối ưu nhằm thu được cao diếp cá giàu flavonoid, góp phần đảm bảo chất lượng cao thuốc khi đưa vào sản xuất Ngoài ra, trước khi đưa vào sản xuất cần phải đánh giá chất lượng cao diếp cá, do đó đó việc xây dựng tiêu chuẩn cao thuốc rất có ý nghĩa trong việc kiểm soát chất lượng nguồn

nguyên liệu đầu vào này Vì vậy, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu

chiết xuất và tiêu chuẩn hóa cao bán thành phẩm Diếp cá” với các mục tiêu sau:

- Nghiên cứu quy trình chiết xuất cao bán thành phẩm diếp cá giàu flavonoid

- Tiêu chuẩn hóa cao bán thành phẩm diếp cá giàu flavonoid

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Vị trí phân loại

Cây Diếp cá còn được là Ngư tinh thảo, giấp cá hay lá dấp Diếp cá có tên

khoa học là Houttuynia cordata Thunb Theo “Thực vật dược” năm 2007 [1] và hệ

thống phân loại thực vật Takhtajan năm 1987, vị trí phân loại của diếp cá như sau:

Ngành Ngọc lan Magnoliophyta Lớp Ngọc lan Magnoliopsida Phân lớp Ngọc lan Magnoliidae

Bộ Hồ tiêu Piperrales

Họ Lá dấp Saururaceae Chi Diếp cá Houttuynia

Chi Houttuynia chỉ có 1 loài diếp cá, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận

nhiệt đới châu Á, từ Nhật Bản, Trung Quốc đến Việt Nam, Lào, Ấn Độ và các nước

Đông Nam Á khác Ở Việt Nam, cây mọc hoang dại ở các tỉnh miền núi, trung du

và đồng bằng Cây được trồng nhiều nơi để làm rau và làm thuốc

Diếp cá thuộc loại cây ưa ẩm và hơi chịu nóng Cây sinh trưởng gần như quanh năm, mạnh nhất trong mùa xuân hè [5],[6]

1.4 Bộ phận dùng

Toàn cây, trừ rễ, hái về dùng tươi hoặc phơi sấy khô [6]

1.5 Thành phần hóa học

1.5.1 Flavonoid

Diếp cá có thành phần flavonoid khá phong phú

Các hợp chất flavonoid trong diếp cá có khung cấu trúc chung là

Hình 1.2 Khung cấu trúc chung của các hợp chất flavonoid trong diếp cá

Một số flavonid đáng chú ý trong diếp cá được trình bày trong bảng 1.1

Bảng 1.1 Các hợp chất flavonoid có trong cây diếp cá

[31]

2 Quercitrin

O O

O H

OH

OH

[24],[30], [31]

3 Isoquercitrin [24]

O O

O O

D-glucopyranosid

OH OH

OH

OH O

O

CH2OH O H O H

O H

[24]

8

Quercetin-3-O-α-rhamnopyranosyl-

L-

7-O-β-D-glucopyranosid

OH OH

O

OH O

O

CH2OH O

H O H

O H

O C

H3O H

OH O H

[24]

1.5.2 Polyphenol

Trong thành phần của diếp cá chứa 1 số polyphenol có tác dụng chống oxy hóa trình bày trong bảng 1.2

Bảng 1.2 Một số hợp chất polyphenol có trong diếp cá

OH

OH COOH

OH O

OH O

13 Acid quinic

O H

OH OH

O

OH O

H

O H

O

OH OH OH

O H

Một số thành phần chính của tinh dầu diếp cá đã được xác định trình bày trong bảng 1.3

Bảng 1.3 Một số thành phần chính có trong tinh dầu diếp cá

[21]

27 Bornyl acetat

O

O

[15],[20],[23]

Các akaloid trong diếp cá được trình bày trong bảng 1.4

Bảng 1.4 Các hợp chất alkaloid trong cây diếp cá

40 Aristolactam A

O H OCH3

N H O

[16],[24]

43 Norcepharadion B

N H

OCH3

H3CO

O O

Ngoài ra trong diếp cá còn chứa các nguyên tố vi lượng Fe, Mn, Mg [11]

HSV-1.6.2 Tác dụng chống SARS

Thí nghiệm trên chuột cho thấy dịch chiết nước của diếp cá kích thích sự phát triển của tế bào lympho ở lách chuột Tác dụng của diếp cá có thể chia thành 2 giai đoạn Khi có sự xâm nhập của virus SARS, các thành phần trong dịch chiết diếp cá

có thể kích hoạt khả năng miễn dịch qua trung gian tế bào để ngăn chặn lây nhiễm virus Trường hợp đã nhiễm bệnh, thành phần trong dịch chiết diếp cá có thể làm chậm quá trình nhân lên của virus bằng cách ức chế enzym quan trọng tổng hợp

ARN của virus SARS [17]

Thí nghiệm trên mô hình chuột gây viêm màng phổi bởi carrageenan và gây phù nề tai bởi xylen, cho thấy thành phần tinh dầu có trong diếp cá có tác dụng ngăn chặn phản ứng viêm Tuy nhiên khả năng chống viêm của diếp cá không bằng dexamethason [21]

Trên 1 nghiên cứu khác cho thấy tác dụng chống viêm của tinh dầu diếp cá dựa trên sự ức chế cyclooxygenase-2 (COX-2), dẫn tới giảm tổng hợp prostagladin

là chất trung gian hóa học của phản ứng viêm [18]

Nghiên cứu trên chuột thấy rằng, quercitrin (hàm lượng 50; 100 và 200 mg/kg dùng đường uống) trong diếp cá cho thấy có tác dụng ức chế biểu hiện phù chân sau của chuột gây ra bởi histamin, serotonin, brandykinin Quercitrin còn có tác dụng ức chế tình trạng viêm cấp tính [12].

1.6.4 Tác dụng chống dị ứng

Thí nghiệm trên chuột cho thấy, các thành phần trong dịch chiết nước diếp cá

có khả năng ức chế hợp chất 48/80-gây ra sốc phản vệ toàn thân ở chuột Đồng thời kháng dinitrophenyl IgE ở chuột giúp ngăn cản phản ứng dị ứng trên da, ngăn cản kích hoạt tế bào mast Do đó diếp cá có tác dụng chống dị ứng, có các tác dụng điều

trị với bệnh liên quan đến dị ứng như hen suyễn, viêm mũi dị ứng [13]

Thí nghiệm trên mô hình in vitro nhận thấy rằng diếp cá với các thành phần

quercetin, quercitrin, quercetin-3-O-β-D-galactosid có khả năng ức chế quá trình

peroxid hóa lipid góp phần bảo vệ tế bào [10]

Ngoài ra 1 số hợp chất polyphenol trong diếp cá như acid chlorogenic và các dẫn chất của nó, procyanidin B, catechin… có tác dụng chống oxy hóa mạnh [26]

Nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn của 2 loài Houttuynia emeiensis và

Houttuynia cordata (Diếp cá), nhận thấy các thành phần có trong tinh dầu của cả 2

loài trên hiệu quả kháng khuẩn với chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus và

cá Kết quả cho thấy các thành phần trong diếp cá chiết xuất có tác dụng ngăn chặn

5 dòng tế bào này [8]

Ngoài ra, trên 1 nghiên cứu khác trên mô hình in vitro cho thấy các alkaloid trong diếp cá có tác dụng chống lại 5 dòng tế bào gây ung thư ở người là A-549, SK-OV-3, SK-MEL-2,XF-498, HCT-15 [16]

1.7 Công dụng

Theo y học cổ truyền, diếp cá có vị cay, hơi lạnh, hơi độc vào phế kinh Có tác dụng tán nhiệt, tiêu ung thũng, dùng chữa phế ung, ngoài dùng chữa ung thũng, trĩ, vết lở loét

Nhân dân dùng diếp cá trong những trường hợp tụ máu như đau mắt (giã nhỏ

lá ép vào hai miếng giấy bản đắp lên mắt khi ngủ, làm như vậy hai ba lần) hoặc trong bệnh trĩ lòi dom (sắc uống nước với liều 6-12g đồng thời sắc nước lấy xông hơi rồi rửa)

Ngoài ra còn có tác dụng thông tiểu chữa bệnh mụn nhọt kinh nguyệt không đều [5],[6]

Một số bài thuốc có diếp cá

- Chữa trĩ đau nhức: Lá diếp cá nấu nước xông, ngâm rửa, bã dùng đắp vào

chỗ đau

- Chữa đơn sưng của người lớn và trẻ em: Diếp cá, nhọ nồi, cải rừng, xương xông, dưa chuột, khế, đơn đỏ, huyết dụ, nhài, mía dò, các vị dùng lá với liều lượng bằng nhau (mỗi vị 15g), thêm xích hoa xà 3 lá, bí đao 3 miếng, củ nâu 3 miếng Giã nát, chế nước vào, vắt lấy nước cốt uống, bã dùng xoa đắp chỗ sưng

- Chữa trĩ ra máu: Diếp cá 2kg, bạch cập 1 kg Sấy khô tán bột, ngày uống 12g, chia 2-3 lần

6 Chữa trẻ lên sởi: Rau diếp cá sao qua, sắc cho uống thì khỏi hẳn không tái phát

- Chữa viêm ruột kiết lị: Rau diếp cá 20g, xuyên tâm liên 16g, hoàng bá 8g Sắc uống làm 2 lần trong ngày

- Chữa trĩ ngoại bội nhiễm hay thể thấp nhiệt: Diếp cá 16g, kim ngân 16g, hoàng đằng 12g, hoa hòe 12g, chi tử sao đen 12g, kinh giới 12g, chỉ xác 12g Sắc uống ngày 1 thang

- Chữa sởi thời kì phát sốt (sởi chưa mọc): Lá diếp cá 16g, rau rệu 16g, cam thảo đất 12g Sắc ngày uống 3 lần

- Chữa viêm tai giữa: Cây diếp cá khô 20g, táo đỏ 10 quả, nước 600ml, sắc còn 200ml, chia 3 lần uống trong ngày [6]

1.8 Một số chế phẩm chứa diếp cá trên thị trường

Hiện nay trên thị trường xuất hiện một số sản phẩm là thuốc và thực phẩm chức năng sử dụng diếp cá để chăm sóc bảo vệ sức khỏe nhân dân

+ Cenditan: Công ty cổ phần Dược phẩm 3/2

Công thức trong 1 viên

+ Helaf: Công ty cổ phần dược Hậu Giang

Công thức trong 1 viên

- Cao khô diếp cá….210mg

- Cao khô rau má……45mg

Công dụng

- Hỗ trợ điều trị trĩ, táo bón và

kiết lỵ

- Giúp giải nhiệt, thông tiểu,

mát gan, giải độc, kháng viêm,

giúp vết thương chóng lành và

mau lên da non, tăng cường hệ

miễn dịch của cơ thể

Hình 1.4 Chế phẩm Helaf của công

ty cổ phần dược Hậu Giang

+ An trĩ vương: Công ty cổ phần sản xuất và thương mại Hồng Bàng

Công thức trong 1 viên chứa

- Hỗ trợ điều trị và phòng ngừa táo bón

- Giúp bảo vệ và tăng sức bền của tĩnh mạch, đường tiêu hóa

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị

2.1.1 Nguyên vật liệu

Các mẫu dược liệu diếp cá khô:

- Mẫu DL1: thu mua ở Ba Vì, Hà Nội (dược liệu Việt Nam), 3/2013

- Mẫu DL2: mua ở chợ Ninh Hiệp, Gia Lâm, Hà Nội (dược liệu Trung Quốc), 4/2013

- Mẫu DL3: mua ở phố Lãn Ông, Hà Nội (dược liệu Việt Nam, Hưng Yên), 4/2013

2.1.2 Thiết bị, hóa chất

Hóa chất dùng cho nghiên cứu

Hóa chất tinh khiết và thuốc thử trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn phân tích theo Dược điển Việt Nam IV

- Dung môi hữu cơ: Ethyl acetat, EtOH 96%, methanol, aceton…

- Thuốc thử: Các thuốc thử trong phản ứng định tính và sắc ký

- Bản mỏng tráng sẵn silicagel GF254 (Merck)

- Quercitrin chuẩn hàm lượng 98%, hyperin chuẩn hàm lượng 98% được cung cấp bởi Công ty Tauto Biotech Trung Quốc

Thiết bị dùng trong nghiên cứu

- Bếp cách thủy các cỡ cho bình chiết từ 100ml, 250ml, 500ml, 1lít

- Máy cất quay Eyela, dung tích bình cất từ 100 ml, 250ml, 500ml, 1lít, 2lít

- Máy xay dược liệu

- Tủ sấy thường Binder – FD 115 dung tích 100 lít

- Máy đo độ ẩm Precisa HA60

- Cân kỹ thuật Sartorius TE612

- Cân phân tích Sartorius CPA 224S

- Đèn tử ngoại Vilder Lourmat

- Máy quang phổ tử ngoại Shinodzu UV-1800

- Micropipet Boeco 1ml, 5ml

- Dụng cụ thủy tinh các loại: Bình gạn 1 lít, 2 lít; bình cầu 250ml, 500ml, 1lít, 2lít, phễu thủy tinh

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu xây dựng quy trình chiết xuất dựa trên các khảo sát về dung môi dùng

để chiết xuất, tỷ lệ giữa dược liệu và dung môi, nhiệt độ chiết, thời gian chiết

- Xây dựng tiêu chuẩn của cao diếp cá giàu flavonoid theo Dược điển Việt Nam IV với các chỉ tiêu: Cảm quan, độ ẩm, tro toàn phần, định tính, định lượng flavonoid toàn phần

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Nghiên cứu qui trình chiết xuất cao diếp cá giàu flavonoid qui mô phòng thí nghiệm

- Nghiên cứu xây dựng qui trình chiết xuất cao diếp cá dựa vào việc khảo sát lựa chọn:

+ Dung môi phù hợp với nguyên tắc an toàn, dễ kiếm, hiệu quả kinh tế: EtOH,

nước được lựa chọn để nghiên cứu

+ Lựa chọn phương pháp chiết xuất: Đun hồi lưu, ngâm lạnh…

+ Tỉ lệ dược liệu/dung môi chiết xuất

+ Nhiệt độ chiết xuất

+ Thời gian chiết xuất

- Tiêu chí đánh giá quy trình: hiệu suất chiết xuất, hàm lượng flavonoid trong cao chiết xuất, tính khả thi của quy trình (dùng dung môi ít độc, rẻ tiền, quy trình đơn giản dễ áp dụng cho sản xuất quy mô lớn)

2.3.2 Phương pháp định lượng flavonoid toàn phần bằng phương pháp quang phổ tử ngoại khả kiến

+ Nguyên tắc: Dựa vào phản ứng tạo màu của AlCl3 với hợp chất flavonoid, do muối nhôm clorid tạo phức bền vững với nhóm ceton ở vị trí C-4 và nhóm hydroxyl

ở vị trí C-5 của hợp chất quercitrin [7] Vì vậy dựa trên phản ứng tạo màu của chất chuẩn quercitrin với AlCl3, định lượng flavonoid toàn phần theo quercitrin

Định lượng bằng phương pháp đường chuẩn

Chuẩn bị dung dịch chuẩn: Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn quercitrin trong

EtOH 96% có nồng độ chính xác khoảng: 240 µg/ml, 120 µg/ml, 60 µg/ml, 30 µg/ml và 15 µg/ml

Chuẩn bị mẫu thử từ dược liệu: Cân chính xác khoảng 3g bột dược liệu diếp

cá (đã xác định hàm ẩm), thêm 60ml EtOH 50%, chiết hồi lưu cách thủy 1h, lọc lấy dịch chiết Bã tiếp tục được chiết thêm 2 lần nữa, mỗi lần 40ml EtOH 50% Gộp dịch chiết, cô cách thủy đến còn 50ml Dịch nước được lắc với EtOAc 3 lần, mỗi lần 50ml Gạn lấy phần EtOAc, cô đến cắn Cắn thu được hòa trong EtOH 96%, rồi chuyển vào bình định mức 500,0 ml Bổ sung EtOH 96% đến vạch được dung dịch thử

Chuẩn bị mẫu thử từ cao diếp cá:

+ Với mẫu cao diếp cá chưa loại tạp: Cân chính xác khoảng 0,3g cao chế phẩm vào cốc thủy tinh (đã xác định hàm ẩm) Hòa tan trong 50ml nước Dịch nước được lắc với EtOAc 3 lần, mỗi lần 50ml EtOAc Gạn lấy phần EtOAc, cô đến cắn Cắn thu được hòa tan EtOH 96% rồi chuyển vào bình định mức 500,0ml Bổ sung EtOH 96% đến vạch được dung dịch thử

+ Với mẫu cao diếp cá đã tiến hành loại tạp: Cân chính xác khoảng 0,1g cao chế phẩm vào cốc thủy tinh (đã xác định hàm ẩm), hòa tan EtOH 96% rồi chuyển vào bình định mức 500,0ml Bổ sung EtOH 96% đến vạch được dung dịch thử

- Tiến hành phản ứng tạo mầu đo quang: Lấy chính xác 1,0 ml dung dịch thử hoặc

dung dịch chuẩn vào bình định mức 10,0 ml, thêm chính xác 3,0 ml AlCl3 5% trong

EtOH 96%, bổ sung EtOH 96% vừa đủ đến vạch, lắc đều để yên 30 phút, tiến hành

đo độ hấp thụ quang

- Chuẩn bị mẫu trắng: Lấy chính xác 3,0ml AlCl3 5% trong EtOH 96% vào bình định mức 10,0ml; bổ sung EtOH 96% vừa đủ đến vạch

- Xây dựng đường chuẩn: Xây dựng đường chuẩn biểu diễn mối tương quan giữa

nồng độ và độ hấp thụ quang của mẫu chuẩn

+ Hàm lượng flavonoid toàn phần tính theo quercitrin trong dược liệu diếp cá được xác định theo công thức:

X(%) =

C:nồng độ flavonoid toàn phần tính theo quercitrin trong mẫu dược liệu diếp cá (µg/ml)

P: Khối lượng mẫu dược liệu diếp cá (g)

W: Độ ẩm của mẫu dược liệu diếp cá (%)

+ Hàm lượng flavonoid toàn phần tính theo quercitrin trong cao diếp cá được xác định theo công thức:

C’:nồng độ flavonoid toàn phần tính theo quercitrin trong mẫu cao diếp

cá (µg/ml)

P’: Khối lượng mẫu cao diếp cá (g)

W’: Độ ẩm của mẫu cao diếp cá (%)

- Xử lý kết quả: kết quả thực nghiệm được biểu diễn dưới dạng giá trị trung bình ±

độ lệch chuẩn tính toàn bằng phần mềm MICROSOFT EXCEL.

2.3.3 Xây dựng tiêu chuẩn của cao Diếp cá

Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho cao diếp cá dựa trên các chỉ tiêu quy định tại Dược điển Việt Nam, gồm các chỉ tiêu:

- Cảm quan: Mô tả màu sắc, mùi vị cao diếp cá

- Độ ẩm: Thể chất cao được quy định dựa vào độ ẩm Cao lỏng được quy ước 1ml

cao tương ứng 1g dược liệu, cao đặc độ ẩm không quá 20% và không quá 5% đối với cao khô (nếu không có chỉ dẫn khác)

Xác định độ ẩm bằng phương pháp mất khối lượng do làm khô hay phương pháp sấy theo phụ lục 9.6 Dược điển Việt Nam IV

- Tro toàn phần: Là lượng tro khi tro hóa hoàn toàn mẫu thử tại một điều kiện

nung nhất định trong 1g chế phẩm thử Tiến hành theo Phụ lục 9.8 Dược điển Việt Nam IV

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Xác định hàm lượng flavonoid toàn phần trong dược liệu

Để nghiên cứu xây dựng được qui trình chiết xuất cao diếp cá giàu flavonoid hiệu suất cao thì nguồn dược liệu đầu vào cần phải xác định và qui định hàm lượng flavonoid toàn phần trong dược liệu trước khi tiến hành chiết xuất

3.1.1 Thực nghiệm

- Chuẩn bị dung dịch chuẩn: Cân chính xác 2,4 mg quercitrin chuẩn 98% hòa tan

hoàn toàn vào 1,0 ml EtOH 96% ta được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 2400µg/ml Từ dung dịch chuẩn gốc tiến hành pha thành các dung dịch chuẩn có nồng độ là 240 µg/ml, 120 µg/ml, 60 µg/ml, 30 µg/ml, 15 µg/ml trong EtOH 96%

- Chuẩn bị mẫu thử từ dược liệu: tiến hành với 3 mẫu dược liệu DL1, DL2, DL3,

chuẩn bị như mục 2.3.2

- Tiến hành phản ứng tạo mầu đo quang: Lấy chính xác 1,0 ml dung dịch thử hoặc

dung dịch chuẩn vào bình định mức 10,0 ml, thêm chính xác 3,0 ml AlCl3 5% trong EtOH 96%, bổ sung EtOH 96% vừa đủ đến vạch, lắc đều để yên 30 phút, tiến hành