Tổng hợp và thử tác dụng sinh học của n hydroxy 7 (3’ spiro1,3dioxolan 2’ oxoindolin 1’ yl)heptanamid và một số dẫn chất

    BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI                 NGUYỄN THỊ VÂN TRANG     TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA     N-HYDROXY-7-(3’-SPIRO[1,3]DIOXOLAN       2’-OXOINDOLIN-1’-YL)HEPTANAMID VÀ MỘT SỐ DẪN CHẤT     KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ               HÀ NỘI - 2015       BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI           NGUYỄN THỊ VÂN TRANG     TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA   N-HYDROXY-7-(3’-SPIRO[1,3]DIOXOLAN             2’-OXOINDOLIN-1’-YL)HEPTANAMID VÀ MỘT SỐ DẪN CHẤT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ             Người hướng dẫn: TS Phan Thị Phương Dung ThS Trần Thị Lan Hương Nơi thực hiện: Bộ mơn Hóa Dược     HÀ NỘI - 2015     LỜI CẢM ƠN Sau thời gian thực đề tài với nhiều nỗ lực cố gắng, thời điểm hồn thành khóa luận lúc tơi xin phép bày tỏ lịng biết ơn chân thành với người dạy dỗ, hướng dẫn giúp đỡ suốt thời gian qua Trước hết với lịng kính trọng biết ơn sâu sắc xin bày tỏ lời cám ơn chân thành đến GS Nguyễn Hải Nam, TS Phan Thị Phương Dung, ThS Trần Thị Lan Hương DS Đỗ Thị Mai Dung - Bộ mơn Hóa Dược - trường Đại học Dược Hà Nội, người thầy trực tiếp hướng dẫn tận tình bảo tơi thời gian thực khóa luận Tơi xin gửi lời cảm ơn đến thầy giáo, cô giáo anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Hóa Dược - trường Đại học Dược Hà Nội, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, Khoa Dược - Đại học Quốc gia Chungbuk - Hàn Quốc giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tơi thực khóa luận tốt nghiệp Cuối tơi xin gửi lời cám ơn sâu sắc đến bố mẹ, gia đình bạn bè ln động viên khích lệ tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Hà Nội, ngày 11 tháng năm 2015 Sinh viên Nguyễn Thị Vân Trang     MỤC LỤC Trang DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN 1.1 HISTON DEACETYLASE (HDAC) 1.1.1 Khái niệm histon acetyltransferase (HAT) histon deacetylase (HDAC) 1.1.2 Phân loại HDAC 1.1.3 Vai trò sinh học HDAC chế chống ung thư chất ức chế HDAC 1.2 CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC 1.2.1 Phân loại chất ức chế HDAC 1.2.2 Cấu trúc chất ức chế HDAC 1.2.3 Liên quan cấu trúc - tác dụng chất ức chế HDAC 1.3 MỘT SỐ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP CÁC ACID HYDROXAMIC ỨC CHẾ HDAC TRÊN THẾ GIỚI 12 1.3.1 Thay đổi nhóm khoá hoạt động 12 1.3.2 Thay đổi cầu nối 13 1.4 CÁC ACID HYDROXAMIC ĐƯỢC THIẾT KẾ TỔNG HỢP TRONG NƯỚC 14 Chương NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ 16 2.1.1 Hóa chất 16 2.1.2 Thiết bị, dụng cụ 16     2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 16 2.2.1 Tổng hợp hóa học 16 2.2.2 Thử tác dụng sinh học dẫn chất tổng hợp 17 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.3.1 Tổng hợp hóa học 17 2.3.2 Thử tác dụng sinh học 18 Chương 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 21 3.1 HĨA HỌC 21 3.1.1 Tổng hợp hóa học 21 3.1.2 Kiểm tra độ tinh khiết 29 3.1.3 Xác định cấu trúc 30 3.2 THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC 34 3.2.1 Thử tác dụng ức chế HDAC 34 3.2.2 Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro 34 3.2.3 Sơ đánh giá mức độ giống thuốc 34 3.3 BÀN LUẬN 35 3.3.1 Tổng hợp hóa học 35 3.3.2 Khẳng định cấu trúc 36 3.3.3 Thử hoạt tính sinh học 39 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC     DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT 13 C-NMR : Cộng hưởng từ hạt nhân 13C CTCL : U da tế bào lympho T DCM : Dicloromethan DMF : Dimethyl formamid HAT : Histon acetyltranferase HDAC : Histon deacetylase : Cộng hưởng từ hạt nhân 1H H-NMR IR : Phổ hồng ngoại MeOH : Methanol MS : Phổ khối lượng RPMI 1640 : Môi trường nuôi cấy phát triển Viện tưởng niệm Roswell Park SAHA : Acid suberoylanilid hydroxamic SRG : Nhóm nhận diện bề mặt T°nc : Nhiệt độ nóng chảy TB : Tế bào TCA : Acid tricloroacetic TLC : Phương pháp sắc ký lớp mỏng TSA : Trichostatin A TsOH : Acid p-toluensulfonic ZBG : Nhóm kết thúc gắn với kẽm     DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang Bảng 1.1: Cấu trúc hoạt tính dẫn xuất SAHA ω-alkoxy nghiên cứu Hanessian S cộng Bảng 1.2: Tác dụng sinh học số acid hydroxamic thiết kế, tổng hợp nước 15 Bảng 3.1: Chỉ số lý hóa hiệu suất tổng hợp acid hydroxamic từ ester 10 29 Bảng 3.2: Giá trị Rf nhiệt độ nóng chảy (tonc) dẫn chất IVa-d 30 Bảng 3.3: Kết phân tích phổ IR dẫn chất IVa-d 31 Bảng 3.4: Kết phân tích phổ MS dẫn chất IVa-d 31 Bảng 3.5: Kết phân tích phổ 1H-NMR dẫn chất IVa-d Bảng 3.6: Kết phân tích phổ 32 13 C-NMR dẫn chất IVa-d Bảng 3.7: Đánh giá mức độ giống thuốc dẫn chất IVa-d theo quy tắc Lipinsky 10 40 Bảng 3.9: Kết thử hoạt tính kháng tế bào ung thư dẫn chất IVa-d 12 34 Bảng 3.8: Kết thử tác dụng ức chế HDAC dẫn chất IVa-d phương pháp định lượng IC50 11 33 41 Bảng 3.10: Kết thử hoạt tính acid hydroxamic có khung isatin-3-oxim, isatin-3-methoxim 3-spiro[1,3] dioxolan-2-oxoindolin 43     DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ STT Tên hình Hình 1.1: Cấu trúc chromatin điều khiển trình phiên mã, dịch mã 2 Hình 1.2: Vai trị điều khiển chết tế bào theo chương trình chất ức chế HDAC Trang Hình 1.3: Vai trị điều khiển chu trình tế bào chất ức chế HDAC Hình 1.4: Một số chất ức chế HDAC Hình 1.5: Cấu trúc chất ức chế HDAC Hình 1.6: Cấu trúc apicidin azumamid E Hình 1.7: Tương tác HDAC4 hợp chất có cầu nối mạch vịng nghiên cứu Micco S.D cộng Hình 1.8: Mơ hình ZBG theo nghiên cứu Vanommeslaeghe K cộng 14 Hình 3.1: Kết thử tác dụng ức chế HDAC dẫn chất IVa-d theo phương pháp Western blot 14 14 Hình 1.12: Cấu trúc chung số dãy chất nghiên cứu cơng bố 13 13 Hình 1.11: Cấu trúc HPOB nghiên cứu Lee J.H cộng 12 13 Hình 1.10: Cấu trúc hợp chất tương tự SAHA có nhóm C7 nghiên cứu Taddei M cộng 11 11 Hình 1.9: Cấu trúc chất nghiên cứu Feng T cộng 10 39 Hình 3.2: Biểu đồ so sánh tác dụng dẫn chất IVa-d dòng tế bào ung thư SW620, PC-3 AsPC-1 42     DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ STT Tên sơ đồ Trang Sơ đồ 3.1: Quy trình tổng hợp chung 21 Sơ đồ 3.2: Quy trình tổng hợp dẫn chất IIa 21 Sơ đồ 3.3: Quy trình tổng hợp dẫn chất IIIa 22 Sơ đồ 3.4: Quy trình tổng hợp dẫn chất IVa 23 Sơ đồ 3.5: Quy trình tổng hợp dẫn chất IVb 25 Sơ đồ 3.6: Quy trình tổng hợp dẫn chất IVc 26 Sơ đồ 3.7: Quy trình tổng hợp dẫn chất IVd 28 Sơ đồ 3.8: Cơ chế phản ứng tạo thành IIa-d 35 Sơ đồ 3.9: Cơ chế phản ứng tạo thành IIIa-d 35 10 Sơ đồ 3.10: Cơ chế phản ứng tạo thành IVa-d 36   ĐẶT VẤN ĐỀ Histon deacetylase (HDAC) histon acetyltransferase (HAT) enzym quan trọng tham gia vào trình điều hoà biểu gen Nhiều nghiên cứu cho thấy huy động mức HDAC có khả gây nên sai lệch trình phiên mã, làm kích thích phát triển tế bào ung thư [15,20] Do đó, HDAC mục tiêu phân tử hấp dẫn cho nghiên cứu phát triển thuốc điều trị ung thư [12,21,39] Trong số loại chất ức chế HDAC tổng hợp công bố nay, dẫn xuất acid hydroxamic có hoạt tính tốt, đặc biệt dẫn xuất acid hydroxamic - acid suberoylanilid hydroxamic (SAHA, Zolinza®) , FDA phê duyệt năm 2006 cho điều trị u da tế bào lympho T (CTCL) Theo hướng tiếp cận này, nhóm nghiên cứu mơn Hóa Dược - Đại học Dược Hà Nội tổng hợp, thử hoạt tính cơng bố nhiều dãy chất dẫn xuất acid hydroxamic hướng ức chế HDAC có hoạt tính kháng tế bào ung thư tốt Trong báo khoa học GS Nguyễn Hải Nam cộng [31], acid hydroxamic tương tự SAHA tổng hợp sử dụng khung 5-aryl-1,3,4-thiadiazol làm nhóm khố hoạt động, cho tác dụng ức chế HDAC tốt nhiều lần SAHA Các kết nghiên cứu cho thấy sử dụng dị vòng làm nhóm khố hoạt động có khả cho hoạt tính tốt Dựa vào kết trên, nhóm nghiên cứu GS Nguyễn Hải Nam [1,30] tiếp tục tổng hợp chất có nhóm khố hoạt động dị vịng isatin-3oxim isatin-3-methoxim với cầu nối heptanamid (thay cầu nối octandiamid SAHA), kết thu khả quan Trên sở nghiên cứu trên, tiến hành tổng hợp chất hướng ức chế HDAC với cầu nối heptanamid tiếp tục sử dụng nhóm khố hoạt động thay đổi khung 3spiro[1,3]dioxolan-2-oxoindolin Đề tài “Tổng hợp thử tác dụng sinh học N-hydroxy-7-(3’-spiro[1,3]dioxolan-2’-oxoindolin-1’-yl)heptanamid số dẫn chất” thực với hai mục tiêu: Tổng hợp N-hydroxy-7-(3’-spiro[1,3]dioxolan-2’-oxoindolin-1’-yl)heptanamid dẫn chất Thử tác dụng ức chế HDAC độc tính tế bào dẫn chất tổng hợp   Phụ lục 10: Phổ 1H-NMR IVb (mở rộng)   Phụ lục 11: Phổ 1H-NMR IVc   Phụ lục 11: Phổ 1H-NMR IVc (mở rộng)   Phụ lục 12: Phổ 1H-NMR IVd   Phụ lục 12: Phổ 1H-NMR IVd (mở rộng)   Phụ lục 12: Phổ 1H-NMR IVd (mở rộng)   Phụ lục 13: Phổ 13C-NMR IVa   Phụ lục 13: Phổ 13C-NMR IVa (mở rộng)   Phụ lục 14: Phổ 13C-NMR IVb   Phụ lục 14: Phổ 13C-NMR IVb (mở rộng)   Phụ lục 15: Phổ 13C-NMR IVc   Phụ lục 15: Phổ 13C-NMR IVc (mở rộng)   Phụ lục 16: Phổ 13C-NMR IVd   Phụ lục 16: Phổ 13C-NMR IVd (mở rộng)   Kết thử hoạt tính sinh học dẫn chất Ghi chú: Chất 33A = chất IVa Chất 33C = chất IVc Chất 33B = chất IVb Chất 33H = chất IVd Phụ lục 17: Kết thử hoạt tính sinh học dẫn chất ... 2.2.1 Tổng hợp hóa học 16 2.2.2 Thử tác dụng sinh học d? ?n chất tổng hợp 17 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHI? ?N CỨU 17 2.3.1 Tổng hợp hóa học 17 2.3.2 Thử tác dụng sinh học 18 Chương 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ... TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ N? ??I           NGUY? ?N THỊ V? ?N TRANG     TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA   N- HYDROXY- 7- (3’- SPIRO[1,3]DIOXOLAN             2’- OXOINDOLIN- 1’- YL)HEPTANAMID VÀ MỘT SỐ D? ?N. .. 3.1.1.1 Tổng hợp d? ?n chất N- hydroxy- 7- (3’- spiro[1,3]dioxolan -2’- oxoindolin- 1? ?yl)heptanamid (IVa) a Tổng hợp d? ?n chất IIa Hợp chất spiro[1,3-dioxolan-2,3’-indolin] -2’- on (IIa) tổng hợp từ nguy? ?n liệu