VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ
2.1.1. Hóa chất
Các hóa chất, dung môi dùng trong quá trình thực nghiệm là loại dùng trong tổng hợp được nhập từ công ty Merck hoặc Sigma-Aldrich. Các hóa chất này được sử dụng trực tiếp không qua tinh chế thêm. Bao gồm:
- Các isatin: + Isatin + 5-Fluoroisatin + 5-Cloroisatin + 7-Cloroisatin - Acid p-toluensulfonic - Ethyl 7-bromoheptanoat - Ethylen glycol - Hydroxylamin hydroclorid - Sắt (III) clorid
Các hóa chất và dung môi khác: N,N-dimethylformamid (DMF), dicloromethan (DCM), methanol, aceton, ethyl acetat, toluen, natri hydroxyd, natri sulfat khan, kali carbonat, acid hydrocloric, nước muối bão hoà, nước cất.
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ
- Dụng cụ thủy tinh: bình cầu đáy tròn dung tích 50 ml có nút mài, sinh hàn hồi lưu, pipet, bình chiết, phễu thủy tinh, bình chạy sắc ký lớp mỏng (TLC).
- Máy khuấy từ gia nhiệt.
- Máy cất quay chân không Buchi R-210. - Cân phân tích, cân kỹ thuật Shimazu. - Tủ lạnh, tủ sấy, máy siêu âm.
- Bản mỏng silicagel Merck 70-230 mesh để chạy sắc ký lớp mỏng. - Máy Melting point Apparatus Smp3 để xác định nhiệt độ nóng chảy. - Máy Impact 400 để xác định phổ IR.
- Máy khối phổ Agilent 6310 Ion Trap để ghi phổ MS.
- Máy cộng hưởng từ Bruker AV-500 để ghi phổ1H-NMR, 13C-NMR. 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Tổng hợp 4 dẫn chất:
N-hydroxy-7-(3’-spiro[1,3]dioxolan-2’-oxoindolin-1’-yl)heptanamid (IVa)
N-hydroxy-7-(3’-spiro[1,3]dioxolan-5’-fluoro-2’-oxoindolin-1’-yl)heptanamid (IVb)
N-hydroxy-7-(5’-cloro-3’-spiro[1,3]dioxolan-2’-oxoindolin-1’-yl)heptanamid (IVc)
N-hydroxy-7-(7’-cloro-3’-spiro[1,3]dioxolan-2’-oxoindolin-1’-yl)heptanamid (IVd) - Kiểm tra độ tinh khiết
- Xác định cấu trúc của các chất tổng hợp được
2.2.2. Thử tác dụng sinh học của các dẫn chất tổng hợp được
- Thử tác dụng ức chế HDAC.
- Thửđộc tính trên các dòng tế bào ung thư SW620, PC-3 và AsPC-1. - Sơ bộđánh giá tính giống thuốc của các dẫn chất tổng hợp được. 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Tổng hợp hóa học
2.3.1.1. Tổng hợp
- Dựa trên những nguyên tắc và phương pháp cơ bản của hóa học hữu cơđể
tổng hợp các dẫn chất theo thiết kế.
- Theo dõi quá trình phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng (TLC).
2.3.1.2. Kiểm tra độ tinh khiết
Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng TLC và đo nhiệt độ nóng chảy.
2.3.1.3. Xác định cấu trúc các dẫn chất tổng hợp được
Các dẫn chất sau khi tổng hợp được xác định cấu trúc bằng các phổ: phổ
hồng ngoại, phổ khối, phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR và 13C-NMR.
- Phổ hồng ngoại (IR): được ghi tại Viện Hoá học các Hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam trên máy Impact 400 với kỹ thuật viên nén KBr trong vùng 4000-600 cm-1. Các mẫu rắn được phân tán trong KBr đã sấy khô với tỷ lệ 1 : 200 rồi ép dưới dạng film mỏng dưới áp lực cao có hút chân không để loại bỏ hơi ẩm.
- Phổ khối lượng (MS): được đo bằng máy khối phổ Agilent 6310 Ion Trap của Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 1H-NMR và carbon 13C-NMR được ghi trên máy Bruker AV-500 tại Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, dung môi DMSO-d6. Độ chuyển dịch hóa học (δ) được biểu thị bằng đơn vị phần triệu (ppm), lấy mốc là pic của chất chuẩn nội tetramethylsilan (TMS).
2.3.2. Thử tác dụng sinh học
2.3.2.1. Thử tác dụng ức chế HDAC
Tác dụng ức chế HDAC của các dẫn chất được đánh giá bằng 2 phương pháp: - Đánh giá theo phương pháp Western blot:
Tác dụng ức chế HDAC của các dẫn chất tổng hợp được đánh giá gián tiếp thông qua xác định mức độ acetyl hóa histon H3, H4 trong tế bào ung thưđại tràng (SW620). Phân tích dựa trên Western blot có thể khẳng định được tác dụng của các mẫu thử làm tăng hoặc giảm sự acetyl hóa histon H3, H4 khi so sánh với mẫu trắng. Chi tiết cách tiến hành được dựa trên phương pháp đã được công bố trước đây [45].
- Định lượng nồng độ HDAC2 bị ức chế bằng phương pháp huỳnh quang Tác dụng ức chế HDAC của dẫn chất tổng hợp được thử tại Khoa Dược Trường Đại học Chungbuk, Cheongju, Hàn Quốc. Enzym HDAC2 được cung cấp bởi BPS Bioscience (San Diego, CA, USA) và sử dụng bộ kit định lượng Fluoregenic HDAC Assay Kit (BPS Bioscience). Các bước tiến hành được thực hiện theo hướng dẫn của bộ kit thử nghiệm.
Tóm tắt các bước như sau: Enzym HDAC2 được ủ với KBH-A42 ở nhiều nồng độ khác nhau ở 37oC trong 30 phút với sự có mặt của cơ chất HDAC có gắn huỳnh quang. HDAC developer (tạo chất phát huỳnh quang trong hỗn hợp phản
ứng) được thêm vào sau khi ủ. Mức độ phát huỳnh quang được ghi bằng máy VICTOR (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) với bước sóng kích thích 360 nm và bước sóng phát xạ 460 nm. Kết quảđược ghi lại và giá trị IC50 được tính toán bằng phần mềm GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).
2.3.2.2. Thửđộc tính tế bào
Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư (thử độc tính tế bào) in vitro được thực hiện tại Khoa Dược, trường Đại học Quốc gia Chungbuk, Cheongju, Hàn Quốc theo phương pháp Sulforhodamin B (SRB) [7,17].
Dòng tế bào thử nghiệm: SW620 (tế bào ung thư đại tràng), PC-3 (tế bào ung thư tiền liệt tuyến) và AsPC-1 (tế bào ung thư tuyến tuỵ).
Các tế bào ung thưđược lấy từ Ngân hàng tế bào ung thư của Viện nghiên cứu Sinh học và Công nghệ sinh học Hàn Quốc (KRIBB).
* Nguyên tắc thử
Dựa trên khả năng gắn của thuốc nhuộm với các acid amin cơ bản của protein trong tế bào, sử dụng phương pháp đo màu để tính tổng lượng protein, từđó suy ra số lượng tế bào [7].
* Các bước tiến hành:
Bước 1: Chuẩn bị tế bào (đĩa A)
- Sử dụng các tế bào đang ở pha logarit hoặc được trypsin hoá (với các dòng tế bào bám dính).
- Phân tán dòng tế bào trong môi trường RPMI 1640 bổ sung 10% FBS (huyết thanh bào thai bò), 1% glutamin, 1% pen/ strep (100 U/ml penicillin và 100 µg/ml streptomycin) hoặc các môi trường phù hợp khác, điều chỉnh đến nồng độ
300-500.103 tế bào/ml.
- Thu lấy mỗi giếng 100 000 tế bào và phân tán vào 10 ml môi trường gồm 20% FBS, 1% glutamin và 1% pen/ strep.
- Từ 100 000 tế bào trong 10 ml môi trường, dùng pipet hút 100 µl hỗn dịch tế bào và môi trường vào mỗi giếng để có 1000 tế bào ở mỗi giếng.
- Hàng đầu tiên được sử dụng làm mẫu trắng, hàng tiếp theo là các mẫu đối chứng (không có mẫu thử).
Bước 2: Chuẩn bị mẫu (đĩa B)
- Thêm 125 µl môi trường RPMI 1640 vào mỗi giếng của đĩa 96 giếng. - Thêm 125 µl mẫu thử (hoà tan trong DMSO) vào hàng đầu tiên, trộn đều, sau đó lấy 125 µl hỗn hợp ở hàng đầu tiên thêm vào các giếng ở hàng thứ hai, lặp lại quá trình này cho đến hàng cuối cùng để có được các nồng độ pha loãng.
- Hút 100 µl ở hàng thứ 10 của đĩa B thêm vào hàng cuối cùng của đĩa A (để
dung dịch nồng độ nhỏ hơn ít ảnh hưởng đến nồng độ dung dịch được hút ở các lần tiếp theo), lần lượt như vậy cho đến hàng thứ 3 của đĩa A.
- Thêm 100 µl môi trường RPMI 1640 (không chứa mẫu thử) vào hàng mẫu
đối chứng đểđược 200 µl hỗn dịch với 10% FBS trong mỗi giếng. - Thêm 200 µl môi trường vào hàng mẫu trắng.
- Ủ trong 48 h.
Bước 3: Tiến hành thử:
- Chuẩn bị dung dịch gốc 50% TCA, làm lạnh ở 4oC rồi thêm 50 µl dung dịch đã làm lạnh vào mỗi giếng chứa 200 µl hỗn dịch tế bào và môi trường để tạo nồng độ 10% TCA ở mỗi giếng.
- Đặt đĩa 96 giếng ở 4oC trong 1 h để cốđịnh tế bào.
- Chuẩn bị dung dịch 0,4% SRB (kl/tt) trong 1% acid acetic và thêm 70 µl dung dịch này vào mỗi giếng, đểở nhiệt độ phòng trong 30 phút.
- Rửa đĩa với 1% acid acetic 5 lần để rửa trôi lượng SRB chưa gắn.
- Chuẩn bị dung dịch gốc 10 mM tris(hydroxymethyl)aminomethan (base Trizma) và thêm 200 µl dung dịch này vào mỗi giếng để hoà tan các SRB đã gắn.
Đặt đĩa 96 giếng vào máy lắc trong ít nhất 10 phút.
- Đọc độ hấp thụ ở 492 nm với các đĩa vi thể (microplate), loại trừ độ hấp thụ của nền (đĩa microplate) ở bước sóng 620 nm.
* Tính kết quả
Giá trị IC50 là nồng độ của mẫu thử mà ở đó độ hấp thụ giảm đi 50% so với mẫu đối chứng. Kết quả cuối cùng là giá trị trung bình của 3 lần đo độc lập với độ
sai khác không quá 5%. Giá trị IC50được tính dựa theo phương pháp Probits.
2.3.2.3. Sơ bộđánh giá mức độ giống thuốc của các dẫn chất tổng hợp được
Tính giá trị logP của các dẫn chất bằng phần mềm EPIsuite. Quy trình bao gồm vẽ cấu trúc 2D, tạo Smile notation bằng phần mềm ChemSketch 4.0 của ACD labs sau đó đưa Smile notation vào phần mềm EPIsuite để tính logP.
Đánh giá mức độ giống thuốc của các chất dựa trên quy tắc Lipinsky [23]: - Khối lượng phân tử của chất không lớn hơn 500 g/mol.
- Số trung tâm nhận liên kết hydro (N, O) không lớn hơn 10. - Số trung tâm cho liên kết hydro (NH, OH) không lớn hơn 5. - Giá trị logP của chất không lớn hơn 5.