Chương 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.3.3.1. Kết quả thử tác dụng ức chế HDAC
Các enzym HDAC điều khiển quá trình deacetyl hoá histon, do đó dựa trên mức độ ức chế quá trình deacetyl hoá histon có thể đánh giá khả năng ức chế
HDAC của các chất tổng hợp được. Mức độ ức chế quá trình deacetyl hoá histon của các dẫn chất IVa-d ở nồng độ 3 µM được đánh giá dựa trên phương pháp Western blot.
Hình 3.1:Kết quả thử tác dụng ức chế HDAC của các dẫn chất IVa-d
theo phương pháp Western blot
Ghi chú: Dòng tế bào thử nghiệm: SW620; Nồng độ mẫu thử: 3 µM; Thời gian thử: 24 h. VH: mẫu trắng; SAHA: acid suberoylanilid hydroxamic; GAPDH: glyceraldehyd 3-phosphat dehydrogenase (chất đảm bảo sự phân bốđồng nhất của các protein và kháng thể)
Trên hình ảnh điện di (hình 3.1), vết đậm của cả 4 dẫn chất IVa-d biểu thị sự
có mặt của acetyl-histon H3 và acetyl-histon H4. Kết quả trên cho thấy các dẫn chất
IVa-d đã ức chế quá trình deacetyl hoá nên acetyl-histon H3 và acetyl-histon H4
không bị deacetyl hoá hoàn toàn. Như vậy, cả 4 dẫn chất IVa-dđều làm ức chế quá trình deacetyl hoá của HDAC khi thử tại nồng độ 3 µM.
Dựa trên kết quả thử theo phương pháp Western blot, các dẫn chất IVa-d
tiếp tục được đem định lượng nồng độ ức chế 50% hoạt động deacetyl hoá của HDAC (IC50) bằng phương pháp huỳnh quang. Kết quảđược trình bày ở bảng 3.8.
Acetyl-Histon H3 VH SAH A IV a IVb IVc Acetyl-Histon H4 GAPDH IVd (3 µM)
Bảng 3.8: Kết quả thử tác dụng ức chế HDAC của các dẫn chất IVa-d bằng phương pháp định lượng IC50 Chất R Tác d(µg/ml)ụng ức chế HDAC (IC(µM)50) IVa -H 0,055 0,165 IVb 5-F 0,021 0,059 IVc 5-Cl 0,012 0,033 IVd 7-Cl 0,053 0,144 SAHA 0,053 0,201
Ghi chú: IC50: Nồng độức chế 50% hoạt động deacetyl hoá của HDAC
Các chất tác dụng theo cơ chế phân tử, do đó để so sánh hoạt tính giữa các chất, giá trị IC50được quy đổi từµg/ml sang µM.
Kết quả thu được trong bảng 3.8 cho thấy các dẫn chất tổng hợp được có IC50 từ
0,033-0,165 µM, thấp hơn hẳn so với SAHA (IC50 = 0,201 µM). Điều đó có nghĩa là các dẫn chất IVa-d có tác dụng ức chế HDAC vượt trội hơn so với SAHA. Đặc biệt, dẫn chất IVc ức chế HDAC tốt nhất với IC50 nhỏ hơn 6 lần so với IC50 của SAHA.
Từ bảng 3.8 có thể thấy dẫn chất không mang nhóm thế IVa cho giá trị IC50 lớn hơn so với các dẫn chất IVb-d. Như vậy, tác dụng ức chế HDAC của N-
hydroxy-7-(3’-spiro[1,3]dioxolan-2’-oxoindolin-1’-yl) heptanamid (IVa) yếu hơn so với các dẫn chất mang nhóm thếở vị trí 5 hoặc 7 trên mạch vòng. Từ kết quả này có thể sơ bộ nhận xét: các nhóm thế halogen ở vị trí 5 hoặc 7 có khả năng đã tạo cấu trúc không gian phù hợp hơn để các chất ức chế HDAC tạo tương tác với enzym.
So sánh giá trị IC50 của các dẫn chất mang nhóm thế halogen ở cùng vị trí 5 trên khung indol - IVb (5-F) và IVc (5-Cl) thấy dẫn chất IVc có IC50 nhỏ hơn IVb.
Điều này cho thấy dẫn chất mang nhóm thế 5-Cl ức chế enzym mạnh hơn dẫn chất mang nhóm thế 5-F. Giả thiết có thể do dẫn chất IVb mang F hút điện tử mạnh hơn dẫn chất IVc mang Cl nên mật độ điện tử trên nhóm khoá hoạt động của IVb giảm hơn so với IVc, vì vậy có khả năng làm giảm tương tác Van der Waals với các acid amin trong kênh enzym, dẫn đến hoạt tính của IVb giảm hơn so với IVc.
Kết quả thử với các dẫn chất cùng mang nhóm thế clo nhưng ở 2 vị trí khác nhau - vị trí 5 trên mạch vòng (IVc) và vị trí 7 trên mạch vòng (IVd) - cho thấy IVd
IVc (IC50 = 0,033 µM). Từđó rút ra kết luận: tác dụng ức chế HDAC của dẫn chất
IVc tốt hơn IVd. Kết quả trên có thể gợi ý rằng cấu trúc không gian của dẫn chất có nhóm thế ở vị trí 5 phù hợp để tạo tương tác với enzym hơn cấu trúc dẫn chất có nhóm thế ở vị trí 7. Tuy nhiên, cần chú ý rằng nhóm thế halogen ở vị trí 7 không cản trở tương tác giữa các chất ức chế HDAC và enzym do IVd có tác dụng tốt hơn dẫn chất không nhóm thếIVa.
Như vậy, kết quả thử tác dụng ức chế HDAC bằng phương pháp Western blot cho thấy 4 dẫn chất IVa-d đều có tác dụng ở nồng độ 3 µM. Giá trị IC50 của
IVc khi thử tác dụng ức chế HDAC nhỏ hơn các chất còn lại và nhỏ hơn SAHA do có cấu trúc phù hợp hơn.