Nghiên cứu đặc điểm hình thái, di truyền và bán định lượng gymnemagenin của loài dây thìa canh lá to (gymnema latifolium wall ex wight) ở việt nam

     THÌA CANH LÁ TO (GYMNEMA LATIFOLIUM   - 2014       CANH LÁ TO (GYMNEMA LATIFOLIUM      PGS. TS. Trần Văn Ơn ThS. NCS. Phạm Hà Thanh Tùng  2014  Em xin được bày tỏ lòng kính trọng, biết ơn và lời cảm ơn sâu sắc nhất tới PGS TS Trần Văn Ơn và ThS NCS Phạm Hà Thanh Tùng - Bộ môn Thực vật, Trường Đại học Dược Hà Nội, các thầy đã tận tình hướng dẫn, định hướng, truyền cảm hứng và giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình thực hiện luận văn. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới em sinh viên Đoàn Thị Phương – K66, Trường Đại học Dược Hà Nội đã luôn sẵn sàng hỗ trợ em trong quá trình thực hiện. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô, các chị kĩ thuật viên và các em sinh viên nghiên cứu khoa học - Bộ môn Thực vật, Trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi để em có thể hoàn thành tốt quá trình làm thực nghiệm tại bộ môn. Lời sau cùng, em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới bố mẹ, các anh chị và bạn bè đã luôn ở bên cạnh ủng hộ, động viên em trong suốt quá học tập, nghiên cứu và hoàn thành đề tài này. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 10 năm 2014 Học viên Nguyễn Thị Thu Hiền MC LC DANH MC CÁC BNG DANH MC CÁC HÌNH DANH MC CÁC CH VIT TT T V 1  TNG QUAN 3 1.1. LOÀI GYMNEMA LATIFOLIUM WALL. EX WIGHT 3 1.1.1. V thc vt 3 1.1.2. V ng di truyn 4 1.1.3. V thành phn hoá hc 5 1.1.4. V tác dng sinh hc 9 1.2. TNG QUAN V U 11 1.2.1. Nghiên cm di truyn 11 1.2.2. áp vân tay sc ký 13 1.2.3. ng dc ký lp mng hi (HPTLC) 15  NG VÀ U 17 2.1. NGUYÊN VT LIU NGHIÊN CU 17 2.1.1. Mu nghiên cu 17 2.1.2. Dung môi, hóa cht 17 2.1.3. Máy móc, thit b 18 2.2. U 19 2.2.1. Nghiên cm hình thái 19 2.2.2. Nghiên cng di truyn 20 2.2.3. Vân tay sc ký Gymnema latifolium Wall. ex Wight 22 2.2.4. ng bc ký lp mng hi (HPTLC) 24  KT QU NGHIÊN CU 27 3.1. M THC VT CÁC MU GYMNEMA LATIFOLIUM WALL. EX WIGHT 27 3.1.1. m a các mu 27 3.1.2. Tng hp các so sánh v m thc vt các mu nghiên cu 31 3.2. M DI TRUYN CÁC MU GYMNEMA LATIFOLIUM WALL. EX WIGHT 33 3.2.1. Tách chit ADN 33 3.2.2. Kt qu khui ADN (PCR) 33 3.2.3. nh trình t ADN ribosom vùng ITS 34 3.2.4. So sánh trình t ADN ribosom vùng ITS 35 3.2.5. Xây dng cây phân loi 37 3.3. VÂN TAY SC KÝ CÁC MU GYMNEMA LATIFOLIUM WALL. EX WIGHT 39 3.3.1. Vân tay sc ký các mu Gymnema latifolium Wall. ex Wight 39 3.3.2. ng Gymnemagenin trong các mu Gymnema latifolium Wall. ex Wight b 41  BÀN LUN 44 4.1. V M HÌNH THÁI 44 4.2. V M DI TRUYN 45 4.2.1. Trình t ADN ribosom vùng ITS 1 4.2.2. ng di truyn các mu Gymnema latifolium  trình t ADN ribosom vùng ITS 46 4.3. VÂN TAY SC KÝ CA LOÀI GYMNEMA LATIFOLIUM WALL. EX WIGHT 48 4.4.  NG GYMNEMAGENIN TRONG CÁC MU GYMNEMA LATIFOLIUM WALL. EX WIGHT 49 4.4.1. V thng Gymnemagenin b pháp HPTLC 49 4.4.2. V kt qu ng 50 4.5. V TÍNH MI C TÀI 52 KT LUN 54 KIN NGH 55 TÀI LIU THAM KHO 56 DANH MC CÁC BNG Bng 1.1 Cu to ca acid gymnemic A  D 6 Bng 2.1 V u trong nghiên cu 17 Bng 2.2 m hình thái mô t các mu G.latifolium Wall. ex Wight 19 Bng 2.3 Các thành phn ca phn ng PCR 21 Bng 2.4 Các dãy n ca dung dch mu chun (mg/ml) 24 Bng 3.1  32 Bng 3.2  34 Bng 3.3 Cn ADN bo th t c các mu nghiên cu 34, 35 Bng 3.4 H s ng di truyn trình t ca các mu G. latifolium Wall. ex Wight nghiên cu và G. sylvestre (Retz) R. Br. ex Schult. (Genbank) 36 Bng 3.5 Thành ph dài trình t n ITS1, 5.8S, ITS2 36 Bng 3.6 G. latifolium Wall. ex Wight nghiên cu 40 Bng 3.7 N Gymnemagenin chun và ding 42 Bng 3.8 Giá tr R f và din tích pic ca các vt sc ký 43 Bng 3.9 Kt qu ng Gymnemagenin b pháp HPTLC 43 DANH MC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cu to acid gymnemic A 1 , A 2 , A 3 và A 4 6 Hình 1.2 Cu trúc ca các acid gymnemic phân l c t Gymnema sylvestre (Retz) R. Br. ex Schult và tác dng h ng huyng 7, 8 Hình 1.3 n ethyl acetat trong mu Gymnema latifolium Wall. ex Wight 8 Hình 1.4 Cu trúc hoá hc ca hp cht GLHE9 (a), GLHE7(b) 9 Hình 1.5 Cu trúc ca vùng ADN ribosom ITS 13 Hình 1.6  thy phân acid gymnemic to Gymnemagenin 15 Hình 3.1 11 o - 106 o  27 Hình 3.2 Gia Lai; 13 o - 108 o  28 Hình 3.3 (Hòa Bình; 20 o N - 105 o  29 Hình 3.4 Mu GL4 (Thái Nguyên; 21 o - 105 o  30 Hình 3.5 Tuyên Quang; 22 o - 105 o  31 Hình 3.6 n di sn phm tách chit ADN 33 Hình 3.7 n di sn phm ADN khui 33 Hình 3.8      t 2 loài trong chi Gymnema R. Br 37 Hình 3.9     c xây dng t các mu Gymnema latifolium Wall. ex Wight và Gymnema sylvestre (Retz) R. Br. ex Schult 38 Hình 3.10 S   ca các mu nghiên cu so sánh vi chun Gymnemagenin 39 Hình 3.11 Kt qu chng pic ca mu th, mu chun và mu trng 41 Hình 3.12 Mi liên h gia n và din tích pic 42 Hình 4.1 c xây dng t các mu trong chi Gymnema R. Br. 48 DANH MC CH VIT TT Chữ viết tắt Tên đầy đủ Diễn giải ADN Acid Deoxyribo Nucleic Acid Deoxyribo Nucleic BLAST Basic Local Alignment Search Tool Công cụ tìm kiếm đồng bộ trình tự bp Base pair Cặp base nitơ C Cystein Cystein CMC Chemistry, Manufacture and Control Hóa học, sản xuất và kiểm soát FDA Food and Drug Administration Cục quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ G Guanin Guanin GAP Good Agricultural Practice Thực hành trồng trọt tốt GC Gas Chromatography Sắc ký khí GMG Gymnemagenin Gymnemagenin HPLC High performance liquid chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao HPTLC High Performance Thin Layer Chromatography Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao IND Investigation New Drug Trung tâm nghiên cứu thuốc mới IR Infrared Tia hồng ngoại ITS Internal Transcribed Spacer Vùng phiên mã nội matK Maturase K Maturase K MS Mass Spectrometry Khối phổ PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp RAPD Random Amplified polymorphic DNA Phân tích đa hình AND khuếch đại ngẫu nhiên rbcL Ribulose-1,5-biphosphate Ribulose-1,5-biphosphate R f Retention factor Hệ số lưu giữ RNase A Ribonuclease A Ribonuclease A rps16 Ribosomal protein S16 Ribosomal protein S16 RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối SFDA State Food and Drug Administration Cục quản lý thực phẩm và dược phẩm Trung Quốc TAE Tris- acetat - EDTA Tris- acetat - EDTA TLC Thin Layer Chromatography Sắc ký lớp mỏng UPGMA Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean Phương pháp xây dựng cây phát sinh loài dạng có gốc UV Ultraviolet Radiation Tia cực tím WHO World Health Organization Tổ chức Y tế thế giới 1 T V Trong nn y hc c truyn  Ayurveda, cây dây thìa canh (Gymnema sylvestre c s dng t  u tr ng [59], [61]. T n nay, các nhà khoa hc vm và sàng lc tác du tr  cây dây thìa canh t các loài khác nhau trong cùng chi Gymnema a trên nguyên lý là các loài trong cùng mt bc taxon thc vng có các thành phn hóa h ng tác dng sinh hc ging nhau. Mt s nghiên cu trên th gic tác dng h ng huy trên các loài Gymnema montanum Hook.f., Gymnema inodorum (Lour.) Decne, Gymnema yunnanense Tsiang,  Vit Nam, nghiên cu v c thc hin bi         u v  m thc vt và tác dng h ng huyt ca cây dây thìa canh (Gymnema sylvestre (Retz.) R. Br. ex Schult.) [13] ng nghiên cu v c m thc vt, thành phn hóa hc và tác dng sinh hc ca cây dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall. ex Wight)  Hòa Bình [6] là cây dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium  và có tác dng h ng huy       Gymnema sylvestre (Retz.) R. Br. ex Schult.) trên mô hình   ng huyt chut bng Streptozocin (STZ) [9], [11]. Bên c        Gymnema latifolium Wall. ex Wight) có kh ng tng thi sinh khi ln i cây dây thìa canh (Gymnema sylvestre y có th  nhnh cây dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall. ex Wight) ng và thm chí là tii cây dây thìa canh (Gymnema sylvestre (Retz.) R. Br. ex Schult.). Góp phn vào vic nghiên c cây dây thìa canh lá to  Vit Nam (Gymnema latifolium     tài m hình thái, di truyng Gymnemagenin 2 ca loài dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall. ex Wight)  Vi c thc hin vi các mc tiêu :  Nghiên cm hình thái ca các mu dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall. ex Wight) thu hái ti Vit Nam.  Nghiên c  m di truyn phân t ca các mu dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall. ex Wight).    ng Gymnemagenin có trong các mu dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall. ex Wight) nghiên cu. [...]... 1.3) Hỡnh 1.3 nh tớnh Gymnemagenin trong cỏc phõn on ethyl acetat trong mu Gymnema latifolium Wall ex Wight a Gymnemagenin chun b Phõn on ethyl acetat ca Gymnema latifolium Wall ex Wight sau khi thy phõn [11] 8 Mi õy nht, phõn lp t phõn on ethyl acetat ca bt dc liu dõy thỡa canh lỏ to (Gymnema latifolium Wall ex Wight) thu c hp cht GLHE9 (c xỏc nh l 3-acetoxy-22,23,24,25,26,27-hexanordammaran-20-on)... [14] Ti Vit Nam, th nghim ban u ó xỏc nh cỏc nhúm cht cú trong dõy thỡa canh lỏ to (Gymnema latifolium Wall ex Wight) thu hỏi ti Hũa Bỡnh cú thnh phn chớnh gm: saponin, flavonoid, tanin, sterol, cht bộo acid amin, ng kh v coumarin [6] Trong nghiờn cu nm 2012, trờn sn phm thu phõn phõn on ethyl acetat ca dõy thỡa canh lỏ to (Gymnema latifolium Wall ex Wight) ó phỏt hin cú pic sc ký tng ng vi Gymnemagenin. .. Dõy thỡa canh lỏ to (Gymnema latifolium Wall ex Wight) mnh hn Dõy thỡa canh (Gymnema sylvestre (Retz) R.Br ex Schult.) Kt qu ny ó c chuyn giao cho Cụng ty Dc Khoa - Trng i hc Dc H Ni, l ni duy nht Vit Nam trng trt Dõy thỡa canh lỏ to theo quy trỡnh hng dn Thc hnh tt Trng trt cõy thuc (GAP- WHO) Cụng ty ó cho ra i sn phm Tr tiu ng DKBetics, phn ct lừi l cõy thuc Dõy thỡa canh v Dõy thỡa canh lỏ to 9 Ngoi... nhiờn cỏc nghiờn cu ó ch ra trong thnh phn húa hc ca Gymnema latifolium Wall ex Wight cú Gymnemagenin [11], thờm vo ú, trờn c s th nghim dõy thỡa canh lỏ to Gymnema latifolium Wall ex Wight cú tỏc dng h ng huyt cao hn dõy thỡa canh Gymnema sylvestre (Retz) R Br ex Schult [9] Cú th thy rng trong dõy thỡa canh lỏ to Gymnema latifolium Wall ex Wight cng cú thnh phn acid gymnemic l thnh phn chớnh gõy... n, Phựng Thanh Hng v cng s (2011), dch chit lỏ Dõy thỡa canh lỏ to (Gymnema latifolium Wall ex Wight) Vit Nam cú tỏc dng h ng huyt trờn c chut bỡnh thng (24,07%) tỏc dng cao nht th hin sau 4 gi, kộo di n 5 gi v trờn chut gõy tng ng huyt bi Streptozotocin (36,31%) sau 10 ngy cho ung dch chit Liu dựng thớch hp lỏ dõy thỡa canh l cn ton phn c pha thnh hn dch trong nc ct vi t l 1:1, vi liu 0,5ml/25g,... (Magnoliopsida) + Phõn Lp Hoa Mụi (Lamiidae) + B Long m (Gentianales) + H Trỳc o (Apocynaceae) + Phõn H Thiờn lý (Asclepiadoideae) + Chi Gymnema R.Br + Loi Gymnema latifolium Wall ex Wight Dõy thỡa canh lỏ to (Gymnema latifolium Wall ex Wight) c bit n n vi cỏc tờn ng ngha khỏc l Gymnema khandalense Santapau v Gymnema kollimalayanum A Ramachandran & M B Viswan [56] 1.1.1.2 c im thc vt ca loi Thõn...Chng 1 1.1 TNG QUAN LOI GYMNEMA LATIFOLIUM WALL EX WIGHT 1.1.1 V thc vt 1.1.1.1 V trớ phõn loi Theo h thng phõn loi ca Takhtajan cụng b nm 2009 [16], dõy thỡa canh lỏ to (Gymnema latifolium Wall ex Wight) cú v trớ phõn loi nh sau: + Ngnh Ngc Lan (Magnoliophyta) + Lp Ngc Lan (Magnoliopsida) + Phõn Lp Hoa Mụi (Lamiidae)... lừi l cõy thuc Dõy thỡa canh v Dõy thỡa canh lỏ to 9 Ngoi cỏc cụng b trờn, hin nay trờn th gii cng nh Vit Nam cha cú mt cụng b chớnh thc no v tỏc dng sinh hc ca Dõy thỡa canh lỏ to (Gymnema latifolium Wall ex Wight) 1.1.4.2 Tỏc dng khỏng khun Cỏc nh khoa hc nhn thy Gymnema sylvestre (Retz) R.Br ex Schult v Gymnema montanum Hook cú tỏc dng khỏng khun trờn c chng vi khun gram õm v gram dng [45] Phự hp... canh lỏ to (Gymnema latifolium Wall ex Wight) 29 21 O 20 12 19 11 1 2 4 AcO 7 19 12 16 1 2 30 6 28 11 15 8 5 30 17 18 14 9 10 3 13 20 29 4 AcO 7 28 16 15 O 27 Ac = 6 23 17 14 8 5 22 18 26 9 10 3 13 21 C 24 a) CH3 b) Hỡnh 1.4 Cu trỳc hoỏ hc ca hp cht GLHE9 (a), GLHE7(b) [4] 1.1.4 V tỏc dng sinh hc 1.1.4.1 Tỏc dng h ng huyt Theo Trn Vn n, Phựng Thanh Hng v cng s (2011), dch chit lỏ Dõy thỡa canh lỏ to. .. Gymnema latifolium Wall ex Wight Kt qu cho thy, 3 mu min Bc Vit Nam (Ho Bỡnh, Thỏi Nguyờn v Tuyờn Quang) cựng nm trong cựng mt nhúm di truyn, trong khi ú 1 mu gn khu vc min Trung Vit Nam khụng cựng nhúm ny Kt qu cho thy s khỏc bit ca cỏc mu theo s phõn b a lý [11] Nm 2013, V Th Thanh Thuý ó gii trỡnh t thnh cụng on gen ITS ca 8 mu trong chi Gymnema R.Br Kt qu ó xỏc nh s tng ng di truyn ca 2 mu Gymnema latifolium . cm hình thái ca các mu dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall. ex Wight) thu hái ti Vit Nam.  Nghiên c  m di truyn phân t ca các mu dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium. m hình thái, di truyng Gymnemagenin 2 ca loài dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall. ex Wight)  Vi c thc hin vi các mc tiêu :  Nghiên cm. i cây dây thìa canh (Gymnema sylvestre y có th  nhnh cây dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall. ex Wight) ng và thm chí