2.2.2.1. Tách chiết ADN tổng số
Quy trình tách chiết ADN sử dụng bộ kít chiết tách ADN thực vật GeneJET (Thermo Scientific) gồm các bƣớc sau:
- Nghiền mẫu trong nitơ lỏng bằng cối chày .
- Chuyển mẫu đã nghiền vào ống eppendorf 1,5 ml có chứa 350 µl Lysis Buffer A. Lắc vortex 10 – 20 giây để trộn đều hỗn hợp đảm bảo tất cả bột lá đƣợc tiếp xúc đều với Lysis Buffer A.
- Thêm 50 l Lysis Buffer B và 20 l RNase A. - Ủ ở 65o
C trong 10 phút, thỉnh thoảng lắc đảo ống trong lúc ủ.
- Thêm 130 l Precipitation Solution và lắc đảo ống 2-3 lần. Ủ trong đá 5 phút. - Ly tâm với tốc độ 14000 vòng/phút trong 5 phút.
- Thu dịch nổi và chuyển sang ống eppendorf 1,5 ml mới. Thêm 400 l Plant gDNA Binding Solution và 400 l ethanol 96% và trộn đều.
- Chuyển hỗn hợp dịch trên vào ống spin column đƣợc cung cấp sẵn. Ly tâm với tốc độ 8000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ dịch.
- Thêm 500 l Wash Buffer I đã đƣợc thêm ethanol 96% vào ống spin column. Ly tâm với tốc độ 10000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ dịch nổi. Column đƣợc chuyển sang đặt trong ống eppendorf mới.
21
- Thêm 500 l Wash Buffer II đã đƣợc thêm ethanol 96%. Ly tâm với tốc độ 14000 vòng/phút trong 3 phút. Loại bỏ ống eppendorf chứa dịch nổi. Column chứa ADN đƣợc chuyển sang đặt trong ống eppendorf mới.
- Thêm 100 l Elution Buffer để hòa tan ADN, ủ trong 5 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó ly tâm với tốc độ 10000 vòng/phút trong 1 phút. Loại column, thu ống eppendorf có chứa ADN đã đƣợc hòa tan.
- Bảo quản ADN ở nhiệt độ -20oC để thực hiện các bƣớc tiếp theo.
2.2.2.2. Khuếch đại ADN (PCR)
Phản ứng PCR đƣợc thực hiện với hỗn hợp phản ứng đƣợc trình bày ở bảng 2.3.
Bảng 2.3. Các thành phần cơ bản của phản ứng PCR
Thành phần Thể tích (µl)/ 1 phản ứng
Nƣớc khử ion vô trùng 5,10
Dung dịch đệm cho Taq ADN polymerase (10X) 1,00
dNTP (2,5mM) 0,30
Mồi xuôi (10pmol/µl) 0,70
Mồi ngƣợc (10pmol/µl) 0,70
Taq ADN-polymerase (5U/µl) 0,25
ADN khuôn 2,00
Tổng thể tích 10,00
Khởi động nhiệt 95oC trong 5 phút. Tiến hành 38 chu kỳ:
+ Biến tính: 95oC trong 50 giây. + Bắt cặp: 57oC trong 50 giây. + Khuếch đại: 72oC trong 50 giây. Pha tổng hợp cuối cùng: 72oC trong 8 phút.
2.2.2.3. Điện di ADN trên gel agarose
Đặt bản gel agarose vào trong máy điện di có dung dịch đệm TAE 1X và đã đƣợc thêm ethidium bromid, tra mẫu ADN cùng với chất chỉ thị xanh bromophenol vào giếng trên bản gel. Chạy điện di ở điện thế 110V trong khoảng 30 phút. Sau đó nhấc bản gel ra và quan sát dƣới đèn tử ngoại ở bƣớc sóng 302 nm.
22
2.2.2.4. Tinh sạch và giải trình tự ADN
Các mẫu ADN sau khi đƣợc khuếch đại đƣợc tinh sạch sử dụng bộ kít tinh sạch GenJet Gel Extraction Kit (Thermo Scientific). Các mẫu ADN đã tinh sạch đƣợc gửi sang phòng thí nghiệm Macrogen (Hàn Quốc) để giải trình tự gen. Phƣơng pháp giải trình tự gen sử dụng bộ kít giải trình tự ADN BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kits (Applied Biosystems) trên máy giải trình tự ABI 3730xl DNA Analyzer và máy nhân gen DNA Engine Tetrad 2 Peltier Thermal Cycler (BIO-RAD).
2.2.2.5. So sánh trình tự ADN
Trình tự ADN của 5 mẫu nghiên cứu đƣợc gửi đăng ký trình tự lên ngân hàng gen thế giới (Genbank) sử dụng phần mềm SEQUIN với các mã số KP126832 (GL1), KP126833 (GL2), KP126834 (GL3), KP163979 (GL4), KP126835 (GL5) và so sánh với trình tự tƣơng ứng của loài Gymnema sylvestre (Retz) R. Br. ex Schult đã công bố trên ngân hàng gen thế giới (Genbank – FM178492) bằng công cụ BLAST.
2.2.2.6. Xây dựng cây phân loại dựa trên trình tự ADN
Trên cơ sở trình tự ADN của các mẫu nghiên cứu xây dựng cây phân loại bằng phần mềm Geneouis R8 phƣơng pháp UPGMA, với hệ số bootstrap 10.000 lần). Cây phân loại này sẽ phản ánh mức độ gần gũi về quan hệ di truyền của các mẫu.