(HPTLC)
2.2.4.1. Quy trình bán định lượng
a. Mẫu chuẩn: từ mẫu chuẩn đã chuẩn bị theo mục a phần 2.2.3.1, pha dãy chuẩn gồm các nồng độ nhƣ bảng 2.4.
Bảng 2.4. Các dãy nồng độ của dung dịch mẫu chuẩn (mg/ml).
GMG1 GMG2 GMG3 GMG4 GMG5 GMG6
Nồng độ 0,096 0,192 0,288 0,384 0,480 0,576
b. Mẫu thử: chuẩn bị theo mục b phần 2.2.3.1.
c. iều kiện triển khai sắc ký: theo phần 2.2.3.2.
Triển khai sắc ký lớp mỏng các mẫu thử và các mẫu chuẩn trên cùng một bản mỏng. Xây dựng đƣờng chuẩn bán định lƣợng dựa trên diện tích pic và nồng độ Gymnemagenin của các mẫu chuẩn. Từ đƣờng chuẩn bán định lƣợng, khảo sát đƣợc khoảng nồng độ Gymnemagenin trong các mẫu thử. Từ đó tính hàm lƣợng % Gymnemagenin trong dƣợc liệu theo công thức sau :
25
% GMG = × 100
Trong đó :
% GMG: tỷ lệ % Gymnemagenin có trong dƣợc liệu. C: là nồng độ dung dịch thử (mg/ml).
m: là khối lƣợng bột dƣợc liệu (g). f: là hệ số pha loãng của mẫu thử. h: là độ ẩm của bột dƣợc liệu.
2.2.4.2. Thẩm định phương pháp bán định lượng
a. ộ đặc hiệu
Cách tiến hành: chuẩn bị 3 mẫu sau:
Mẫu trắng: dung dịch MeOH
Mẫu thử: mẫu GL3 đƣợc chuẩn bị theo phần b mục 2.2.3.1.
Mẫu chuẩn: chuẩn Gymnemagenin (GMG4) đƣợc chuẩn bị theo phần a mục 2.2.3.1.
Triển khai sắc ký với điều kiện đã đƣợc mô tả ở mục 2.2.3.2, quan sát số lƣợng vết, hình dáng các vết và so sánh giá trị RSD của Rf [12].
Đánh giá kết quả: đánh giá dựa trên giá trị RSD của Rf. Công thức tính RSD đƣợc ghi ở mục 2.2.3.3. Phƣơng pháp HPTLC đƣợc coi là có tính đặc hiệu hay chọn lọc đối với chất cần phân tích nếu: (i) Sắc ký đồ của mẫu thử cho các vết chính có cùng hình dạng, màu sắc, giá trị Rf với các vết chính trong sắc ký đồ của mẫu chuẩn; (ii) Sắc ký đồ các mẫu trắng không xuất hiện các vết tƣơng ứng với các vết chính trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn.
Giá trị đề nghị chấp nhận khi so sánh trị số Rf: độ lệch chuẩn tƣơng đối của giá trị Rf các vết trên sắc ký đồ dung dịch thử không quá 5%. Độ lệch giá trị Rf trên vết mẫu thử so với vết mẫu chuẩn không quá 5% [12].
b. Tính tuyến tính
Cách tiến hành: Chuẩn bị mẫu chuẩn theo mục a phần 2.2.3.1, dãy mẫu chuẩn đƣợc pha theo mục a phần 2.2.4.1. Tiến hành triển khai HPTLC với dãy dung
26
dịch chuẩn trên. Xây dựng phƣơng trình biểu diễn mối quan hệ tuyến tính giữa nồng độ chất chuẩn có trong mẫu và đáp ứng pic thu đƣợc trên các sắc ký đồ bằng phƣơng pháp bình phƣơng tối thiểu.
Đánh giá: Dựa vào hệ số tƣơng quan R2 của đƣờng chuẩn để đánh giá độ tuyến tính. Trong nghiên cứu chấp nhận phƣơng pháp có độ tuyến tính tốt với R2>0,99.
c. ộ thích hợp của hệ thống
Cách tiến hành: Tiêm 6 lần dung dich chuẩn GMG3 đƣợc chuẩn bị theo mục a phần 2.2.4.1, triển khai HPTLC theo điều kiện đƣợc mô tả ở mục 2.2.3.2.
Đánh giá: Tính RSD của diện tích pic, chiều cao pic. Giá trị RSD của diện tích (chiều cao) pic giữa các lần tiêm mẫu (n > 5) nên nhỏ hơn 2,0% (đối với phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [12].
27
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU