Dƣợc liệu làm thuốc từ lâu đã đƣợc sử dụng rộng rãi trong phòng và chữa bệnh [39]. Trong nhiều trƣờng hợp, việc nhận biết các dƣợc liệu chỉ dựa trên các đặc điểm hình thái thực vật học có thể chƣa đầy đủ và chính xác hoàn toàn do trong nhiều trƣờng hợp không thể thu thập đủ cơ quan sinh sản, bộ phận quan trọng trong việc xác định chính xác tên cây. Trong trƣờng hợp này, các dữ liệu về di truyền giúp khẳng định tính chính xác của loài nghiên cứu dựa trên cơ sở khác biệt di truyền với các loài khác có quan hệ di truyền gần gũi. Trong nghiên cứu của U. Meve và S. Liede (2002), loài N.columnaris vốn đƣợc xếp vào chi Notechidnopsis
dựa trên đặc điểm hình thái, nhƣng dựa trên dữ liệu về trình tự ITS tác giả đã cho thấy mức độ tƣơng đồng với loài Tromotriche ruschiana và loài Tromotriche longipes thuộc họ Thiên lý (Asclepiadaceae) là 95%, do đó loài này đã đƣợc xếp vào chi Richtersveldia thuộc họ Thiên lý [38]. Chính vì vậy mà nhận diện các dƣợc liệu làm thuốc bằng đặc điểm di truyền bên cạnh phƣơng pháp hình thái thực vật là cần thiết và cũng đã đƣợc áp dụng rộng rãi trên thế giới từ giữa những năm 1990 [39]. Nhƣ vậy, thực hiện nghiên cứu so sánh các mẫu dây thìa canh lá to Gymnema latifolium Wall. ex Wight thu hái tại các địa phƣơng khác nhau ở Việt Nam bổ sung vào phƣơng pháp phân loại dựa trên đặc điểm hình thái thực vật là hƣớng đi đúng và bắt kịp xu thế chung của thế giới. Đây cũng là nghiên cứu đầu tiên trên thế giới và ở Việt Nam công bố trình tự ADN ribosom vùng ITS của loài dây thìa canh lá to
53
Với 246 bài báo đƣợc công bố khi tra cứu với từ khóa “Gymnema” từ thƣ viện Y học quốc gia Hoa Kỳ NCBI ở thời điểm hiện tại thì có tới 212 nghiên cứu về dây thìa canh Gymnema sylvestre (Retz) R. Br. ex Schult. và không có nghiên cứu nào về dây thìa canh lá to Gymnema latifolium Wall. ex Wight đƣợc tìm thấy. Ở Việt Nam, mới chỉ có nghiên cứu định tính sự có mặt của Gymnemagenin trong phân đoạn dịch chiết ethylacetat [11]. Trên thế giới có nhiều nghiên cứu về Gymnemagenin, nhƣng các nghiên cứu đó đều thực hiện nghiên cứu trên loài
Gymnema sylvestre (Retz) R. Br. ex Schult [29], [42], [43], [54], [55]. Nhƣ vậy đây là nghiên cứu đầu tiên công bố về hàm lƣợng Gymnemagenin của dây thìa canh lá to Gymnema latifolium Wall. ex Wight bằng phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao HPTLC. Hàm lƣợng Gymnemagenin trong các mẫu Gymnema latifolium
Wall. ex Wight thu hái tại các địa phƣơng khác nhau ít nhiều cũng có mối liên quan đến đặc điểm di truyền và hình thái thực vật, cũng nhƣ phân bố địa lý của từng mẫu. Trong khuôn khổ thời gian thực hiện đề tài, nhóm nghiên cứu chƣa thể cố định mẫu tại cùng một địa điểm nghiên cứu, vì vậy kết quả bán định lƣợng thành phần Gymnemagenin trong các mẫu Gymnema latifolium Wall. ex Wight có thể là những cơ sở đầu tiên giúp các nhà khoa học có định hƣớng tốt hơn cho những nghiên cứu tiếp tục sau này.
54
KẾT LUẬN
1. ặc điểm hình thái các mẫu Gymnema latifolium Wall. ex Wight
Đã thu thập, mô tả đặc điểm hình thái của 5 mẫu GL1, GL2, GL3, GL4, GL5 và đối chiếu với các tài liệu đã công bố và sơ bộ giám định tên khoa học của các mẫu nghiên cứu là Gymnema latifolium Wall. ex Wight.
2. ặc điểm di truyền các mẫu Gymnema latifolium Wall. ex Wight
Đã giải trình tự đoạn ITS (613 nucleotid) của 5 mẫu dây thìa canh lá to
Gymnema latifolium Wall. ex Wight, và xây dựng đƣợc cây phát sinh loài của 5 mẫu này so với Gymnema sylvestre (Retz) R. Br. ex Schult. Theo đó 5 mẫu
Gymnema latifolium Wall. ex Wight thuộc cùng một nhóm, tách biệt hẳn với
Gymnema sylvestre (Retz) R. Br. ex Schult. 5 mẫu Gymnema latifolium Wall. ex Wight có hệ số tƣơng đồng di truyền khoảng 97% - 99%, sự khác nhau còn lại có thể là do sự khác nhau dƣới loài, cần có thêm những nghiên cứu khác ở những đoạn ADN mã hóa khác để khẳng định thêm vấn đề này.
Trình tự nucleotid vùng ITS1 của dây thìa canh lá to Gymnema latifolium
Wall. ex Wight có xuất hiện trình tự CGGCCCAA từ vị trí nucleotid 54 đến 61, trong khi ở vị trí này trên trình tự vùng ITS1 của dây thìa canh Gymnema sylvestre
(Retz) R. Br. ex Schult là những khoảng trống.
3. àm lƣợng Gymnemagenin trong các mẫu Gymnema latifolium Wall. ex Wight
Hàm lƣợng Gymnemagenin trong 5 mẫu dây thìa canh lá to Gymnema latifolium Wall. ex Wight đƣợc xác định bằng phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) vào khoảng 0,048% - 0,163%. Trong đó mẫu thu hái ở Hòa Bình đạt hàm lƣợng cao nhất 0,163%.
55
KIẾN NGHỊ
1. Tiếp tục nghiên cứu các đoạn trình tự ADN mã hóa khác của dây thìa canh lá to Gymnema latifolium Wall. ex Wight để khẳng định chắc chắn hơn sự khác biệt dƣới loài.
2. Cố định các mẫu dây thìa canh lá to Gymnema latifolium Wall. ex Wight thu hái tại các địa phƣơng khác nhau để tiến hành định lƣợng hàm lƣợng Gymnemagenin bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) nhằm chọn đƣợc giống có chất lƣợng tốt nhất.
56
TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT
1. Nguyễn Bá (2010), Hình thái học thực vật, Nhà xuất bản giáo dục.
2. Trần Thế Bách (2007), Nghiên cứu phân loại Họ Thiên Lý ở Việt Nam, Luận án Tiến sỹ Sinh học – Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật.
3. Bộ môn Thực vật (2002), Thực tập Thực vật và nhận biết cây thuốc, in tại Trung tâm thƣ viện Đại học Dƣợc Hà Nội.
4. Nguyễn Thị Kim Chi (2014), Nghiên cứu phân lập một số hợp chất và độc tính của loài Dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall. ex Wight) thu hái ở Hoà Bình, Khoá luận tốt nghiệp Dƣợc sỹ - Đại học Dƣợc Hà Nội
5. Võ Văn Chi (1999), Từ điển thực vật thông dụng (tập 2), NXB KHKT, tr. 1318- 1319. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
6. Phạm Văn Hải (2010), Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây Dây thìa canh lá to ở Hòa Bình, Khóa luận tốt nghiệp dƣợc sỹ Đại học Dƣợc Hà Nội
7. Phạm Hoàng Hộ (2000), Cây cỏ Việt Nam (Tập 2), NXB Trẻ, tr. 738-740. 8. Nguyễn Thùy Linh (2014), Đánh giá sự thay đổi hàm lượng oxostephanin trong cây trồng loài Stephania dielsiana Y. C. Wu tại Ba Vì (Hà Nội) bằng phương pháp HPTLC. Khoá luận tốt nghiệp Dƣợc sỹ - Đại học Dƣợc Hà Nội.
9. Trần Văn Ơn, Phùng Thanh Hƣơng (2011), Sàng lọc các dược liệu có tác dụng điều trị đái tháo đường ở Việt Nam và nghiên cứu thành phần hóa học, độc tính, hạ đường huyết của một số dược liệu điển hình, Đề tài khoa học và phát triển công nghệ cấp Bộ.
10. Vũ Thị Thanh Thuý (2013), Nghiên cứu sự đa dạng các loài trong chi Gymnema R.Br. sử dụng chỉ thị phân tử ITS, Khoá luận tốt nghiệp Dƣợc sỹ - Đại học Dƣợc Hà Nội.
11. Phạm Hà Thanh Tùng (2012), Nghiên cứu tính đa dạng thực vật và thành phần hoá học của các loài trong chi Gymnema R.Br. ở Việt Nam. Luận văn Thạc sỹ Dƣợc học - Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội.
57
12. Viện Kiểm Nghiệm thuốc trung ƣơng - Bộ Y Tế (2012), Khóa đào tạo thẩm định quy trình phân tích SKLM và HPLC trong thuốc đông dược (theo thông tư số 22).
13. Đỗ Anh Vũ (2007), Nghiên cứu đặc điểm thực vật và tác dụng hạ đường huyết của cây Dây thìa canh (Gymnema sylvestre (Retz.) R. Br. ex Schult.), Khoá luận tốt nghiệp Dƣợc sỹ - Đại học Dƣợc Hà Nội..
TIẾNG ANH
14. Ahmed A. B. A.,Komalavalli N. et al (2009), “Pharmacological activities, phytochemical investigations and in vitro studies of Gymnema sylvestre R.Br. - a historical review”, Comprehensive Bioactive Natural products–Potential & Challenges,1, pp. 75-99.
15. Álvarez I., Wendel J.F (2003), “Ribosomal ITS sequences and plant phylogenetic inference”, Mol Phylogenet Evol, 29(3), pp. 417-34.
16. Armen Takhtajan (2009), Flowering plant, Spinger Netherlands.
17. Baldwin B.G. et al. (1995), “The its Region of Nuclear Ribosomal DNA: A Valuable Source of Evidence on Angiosperm Phylogeny, Annals of the Missouri Botanical Garden, 82(2), pp. 247-277.
18. Bingtao Li, M.G.G.W.D.S. and L.P.-t. Tsiang Ying, Asclepiadaceae R. Brown. In Wu, Z. Y. & P. H. Raven, eds (1995), Flora of China. Vol. 16 (Gentianaceae through Boraginaceae), Science Press, Beijing, and Missouri Botanical Garden Press, St. Louis., pp. 479.
19. Chase M.W. et al. (2005), “Land plants and DNA barcodes: short-term and long-term goals”, Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 360(1462), pp. 1889-95. 20. Deokule S. S. et al. (2013), “An endemic and critically endangered species,
Gymnema khandalense Santapau (Apocynaceae: Asclepoadoideae)- A new record to goa state, India. Journal of Threatened Taxa”, 5(11), pp. 4598-4600.
21. Devi Datt Joshi (2012), Herbal Drugs and Fingerprints, Spinger. 22. Floral of China (1995), pp. 238 - 240.
58
24. Hebert P.D. et al. (2003), “Biological identifications through DNA barcodes. Proc Biol Sci”, 270(1512), pp. 313-21.
25. Hebert P.D. et al. (2004), “Identification of Birds through DNA Barcodes”, PLoS Biol, 2(10), pp. e312.
26. Hollingsworth P.M. et al (2009), “A DNA barcode for land plants”, Proc Natl Acad Sci USA, 106(31), pp. 12794-7.
27. Hollingsworth P.M., Bateman R.M., and Gornall R.J. (1999), Molecular Systematics and Plant Evolution, Taylor & Francis.
28. K., H. and Marston, Saponin. 2005, Cambridge University Press.
29. Kamble B. et al. (2013), “Quantitative estimation of gymnemagenin in
Gymnema sylvestre extract and its marketed formulations using the HPLC-ESI- MS/MS method”, Phytochem Anal, 24(2), pp. 135-40.
30. Kasar R. et al (2013), “Critical Factor That Governs a Successful TLC/ HPTLC Analysis of Herbal Medicinal Products (HMPS)”, Research and Reviews: Journal of Pharmaceutical Analysis, 2(4), pp. 1-8.
31. Kress W. J. and Erickson D. L (2012), DNA Barcodes: Methods and Protocols, Human Press.
32. Kress W.J. et al. (2009), “Plant DNA barcodes and a community phylogeny of a tropical forest dynamics plot in Panama”, Proc Natl Acad Sci USA, 106(44), pp. 18621-6.
33. Kress W.J. et al. (2005), “Use of DNA barcodes to identify flowering plants”, Proc Natl Acad Sci U S A, 102(23), pp. 8369-74.
34. Liang Y.Z., P. Xie, and K. Chan (2004), “Quality control of herbal medicines”, J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 812(1-2), pp. 53-70. 35. Lu F.Y., Kao M.T., Huang S.F. & Wang JC. (1998), Flora of Taiwan - Asclepiadaceae (2nd edition), Editorial Committee of the Flora of Taiwan, Taipei. 36. ManMohan Srivastava (2011), High Performance Thin Layer Chromatography (HPTLC), Spinger. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
59
37. McDowell D.G., N.A. Burns and H.C. Parkes (1998), “Localised sequence regions possessing high melting temperatures prevent the amplification of a DNA mimic in competitive PCR, Nucleic Acids Res, 26(14), pp. 3340-7.
38. Meve U. and L. S. (2002), “A molecular phylogeny and generic rearrangement of the stapelioid Ceropegieae (Apocynaceae-Asclepiadoideae)”, Plant Systematics and Evolution, 234(1), pp.171 - 209.
39. Ming LI et al. (2011), “Identification of herbal medicinal materials using DNA barcodes”, Journal of Systematics and Evolution, 49(3), pp. 271 - 283.
40. Natarajan D. et al. (2011), “Antibacterial potential and FT-IR analysis of Gymnema Kollimalayanum A. Ramachandran & M. B. Viswan: A new record plant, India”, International Journal of Pharmaceutical Sciences Review and Research 7(2), pp. 167-170.
41. Newmaster S.G. et al. (2008), “Testing candidate plant barcode regions in the Myristicaceae”, Mol Ecol Resour, 8(3), pp. 480-90.
42. Puratchimani, V. and S. Jha (2004), “Standardisation of Gymnema sylvestre
R. Br. with reference to gymnemagenin by high-performance thin-layer chromatography”, Phytochem Anal, 15(3), pp. 164-6.
43. Raju V.S., S. Kannababu and G.V. Subbaraju (2006), “Standardisation of
Gymnema sylvestre R.Br. by high-performance thin-layer chromatography: an improved method”, Phytochem Anal, 17(3), pp. 192-6.
44. Ramachandran A. and Natarajan D. (2010), “Antibacterial Activity of
Gymnema kollimalayanum”, A New Plant from Peninsular India, 4(6), pp. 292-295. 45. Ramkumar K.M., Rajaguru P., and Ananthan R. (2007), “Antimicrobial Properties and Phytochemical Constituents of an Antidiabetic Plant Gymnema montanum”, Advances in Biological Research 1, 1(2), pp. 67 - 71.
46. Rashmiin P. et al (2012), “HPTLC Method Development and Validation: Strategy to Minimize Methodological Failures”, Journal of Food and Drug Analysis, 20(4).
47. Ratnasingham S. and P.D. Hebert (2007), “bold: The Barcode of Life Data System (http://www.barcodinglife.org)”, Mol Ecol Notes, 7(3), pp. 355-364.
60
48. Savolainen V. et al. (2005), “Towards writing the encyclopedia of life: an introduction to DNA barcoding”, Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 360(1462), pp. 1805-11.
49. Schoch C.L. et al. (2012), “Nuclear ribosomal internal transcribed spacer (ITS) region as a universal DNA barcode marker for Fungi”, Proc Natl Acad Sci USA, 109(16), pp. 6241-6.
50. Sinsheimer J.E. and G.S. Rao (1970), “Constituents from Gymnema sylvestre
leaves. VI. Acylated genins of the gymnemic acids -isolated and preliminary characterization”, J Pharm Sci, 59(5), pp. 629-32
51. Sinsheimer J.E., G.S. Rao, and H.M. McIlhenny (1970), “Constuents from
Gymnema sylvestre leaves. V. Isolation and preliminary characterization of the gymnemic acids”, J Pharm Sci, 59(5), pp. 622-8.
52. Stocklin W. (1969), “Chemistry and Physiological Properties of Gymnemic Acid, the Antisaccharine Principle of the Leaves of Gymnema sylvestre”, J. Agr. Food Chem., 17(4).
53. Surveswaran S., et al. (2014), “On the systematic position of some Asian enigmatic genera of Asclepiadoideae (Apocynaceae)”, Botanical Journal of the Linnean Society, 174, pp. 601-619.
54. Trivedi P. D. and Pundarikakshudu K. (2008), “A Validated High Performance Thin - layer Chromatographic method for the estimation of gymnemic acids through gymnemagenin in Gymnema sylvestre, materials, extracts and formulations”, International Journal of Applied Science and Engineering, 6(1), pp. 19-28.
55. Trivedi P. D., Pundarikakshudu K., and Shah K. (2011), “A Validated Reverse Phase Liquid Chromatographic Method for Quantification of Gymnemagenin in the Gymnema Sylvestre R. Br. Leaf Samples, Extract and Market Formulation”, International Journal of Applied Science and Engineering, 9(1), pp. 25-31
61
56. U. Meve, Alejandro G. J. (2013), “Taxonomy of the Asian Gymnema latifolium (Apocynaceae, Asclepiadoideae, Marsdenieae), including lectotypification of the synonymous G. Khandalense”, Willdenowia, 43, pp. 81-86. 57. Ulbricht C. et al. (2011), “An evidence-based systematic review of gymnema (Gymnema sylvestre R. Br.) by the Natural Standard Research Collaboration”, J Diet Suppl, 8(3), pp. 311-30.
58. Wang X.C. et al. (2014), “ITS1: a DNA barcode better than ITS2 in eukaryotes?”, Mol Ecol Resour.
59. Yeh G.Y. et al. (2003), “Systematic review of herbs and dietary supplements for glycemic control in diabetes”, Diabetes Care, 26(4), pp. 1277-94.
60. Yoshikawa K. et al (1992), “Antisweet Natural Product. V. Structures of Gymnemic acids VIII-XII from Gymnema sylvestre R. Br.”, Chem. Pharm. Bull, 1992, 40(7), pp. 1779-1782. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
61. Yoshikawa K. et al (1989), “Gymnemic acid V, VI and VII from Gur-ma, the leaves of Gymnema sylvestre”, Chem. Pharm. Bull, 37(3), pp. 852-854.
62. Yoshikawa K. et al (1989), “Structure studies of new antisweet constituents from Gymnema sylvestre”, Tetrahedron Letters, 30(9), pp. 1103-1106.
63. Yukihiro Shoyama (2011), “Quality control of herbal medicines and related areas”, InTech.
INTERNET
PHỤ LỤC
PHỤ LỤC 2a: TÍN HIỆU ĐỌC TRÌNH TỰ ĐOẠN GEN ITS1-5,8S-ITS2 MẪU GL1 (T13) – TÂY NINH
MỒI XUÔI ITS1
PHỤ LỤC 2b: TÍN HIỆU ĐỌC TRÌNH TỰ ĐOẠN GEN ITS1-5,8S-ITS2 MẪU GL2 (T9) – GIA LAI
MỒI XUÔI ITS1
PHỤ LỤC 2c: TÍN HIỆU ĐỌC TRÌNH TỰ ĐOẠN GEN ITS1-5,8S-ITS2 MẪU GL3 (S19) – HOÀ BÌNH
MỒI XUÔI ITS5
PHỤ LỤC 2d: TÍN HIỆU ĐỌC TRÌNH TỰ ĐOẠN GEN ITS1-5,8S-ITS2 MẪU GL4 (S12) – THÁI NGUYÊN
MỒI XUÔI ITS5
PHỤ LỤC 2e: TÍN HIỆU ĐỌC TRÌNH TỰ ĐOẠN GEN ITS1-5,8S-ITS2 MẪU GL5 (T17) – TUYÊN QUANG
MỒI XUÔI ITS1
PHỤ LỤC 2f: TRÌNH TỰ SO SÁNH CÁC MẪU NGHIÊN CỨU >T13_Tay Ninh(GL1) ITS1 (1 phần): CGCGAACACGTTTGAACATCCGCGTCGGGCGTCCGGCCCAAACCGGCGCCCCTCGCCCCC CCGCCCGGCCGAACGGAGCCTTCGTCGGCCTACGGTCGAGCCGGGCAACCGAAACAAAA ATCGGCGCGGGAAGCGCCAAGTACTTGCGAAATGGGATGCCCTCCCGCGGGGAGTGCCGT TCGCGGAATCCTCGCCGCGGGGCTCGAAGGGCGCCCGGAACGAAATGTC 5.8S: ACACGACTCTCGGCAACGGATATCTAGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGTAGCAAACTGC GATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCCCGTGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGC CCGAAGCCGTTAGGCCGAGGGCACGTCTGCCTGGGCGTCACGC ITS2 (1 phần): ATCGCGTCGCCCCCCGCTCTCCCGGTCCCGATAGGGCCGCGGGCAGAGCGGAGGGGCGGA AGTTGGCTCCCCGTGCTCCGTCGCGGCCAGCCTAAAGCAAGGTTCCCTCGCCGCGGACGT CGCGACAAGTGGTGGTCGTCGAGATTGAACGCGTGTCGTCGGCAAGCCGCGTCGAGGCGA TCGTTTGGACCCTGTGAGCGATGGTCCCCCGTCCGTCGGGGG >T9_Gia Lai (GL2) ITS1 (1 phần): CGAGAACACGTTAGAACATCCGCGTCGGGCGTCCGGCCCAAACCGGCGCCCCTCGCCCCC CCGCCCGGCCGAACGGAGCCTCCTTCGGCCGACGGTCGTGCCGGGCAACCGAAACAAAA ACCGGCGCGGGAAGCGCCAAGTACTTGCGAAATGGGATGCCCTCCCGCGGGGAGTGCCGT TCGCGGAATCCTCGCCGCGGGGCTCGAAGGGCGCCCGGAACGAAATGTC 5.8S: ACACGACTCTCGGCAACGGATATCTAGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGTAGCAAACTGC GATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCCCGTGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGC CCGAAGCCGTTAGGCCGAGGGCACGTCTGCCTGGGCGTCACGC ITS2 ( 1 phần): ATCGCGTCGCCCCCCGCTCTCCCCGTCCCGATAGGGCCGCGGGCAGAGCGGAGGGGCGGA AGTTGGCTCCCCGTGCTCCGTCGCGGCCAGCCTAAAACAAGGTTCCCTCGCCGCGGACGT CTCGACAAGTGGTGGTCGTCAAGATTGAACGCGTGTCGTCGGCAAGCCGCGTCGAGGCGA GCGTTTGGACCCTGTGAGCGATGGTCCCCCGTCCGTCGGGGG >S19_Hoa_Binh (GL3) ITS1 (1 phần): CGCGAACACGTTTGAACACCCGCGTCGGGCGTCCGGCCCAAACCGGCGCCCCTCGCCCCC CCGCCCGGCCGAACGGAGCCTCCTTCGGCCGACGGTCGCGCCGGGCAACCGAAACAAAA ATCGGCGCGGGAAGCGCCAAGTACTTGCGAAATGGGATGCCCTCCCGCGGGGAGTGCCGT TCGCGGAATCCTCGCCGCGGGGCTCGAAGGGCGCCCGAAACGAAATGTC 5.8S: ACACGACTCTCGGCAACGGATATCTAGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGTAGCAAACTGC GATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCCCGTGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGC CCGAAGCCGTCAGGCCGAGGGCACGTCTGCCTGGGCGTCACGC ITS2 ( 1 phần): ATCGCGTCGCCCCCCGCTCTCCCCGTCCCGATAGGGCCGCGGGCAGAGCGGAGGGGCGGA AGTTGGCTCCCCGTGCTCCGTCGCGGCCAGCCTAAAACAAGGTTCCCTCGCCGCGGACGT CGCGACAAGTGGTGGTCGTCGAGATTGAACGCGTGTCGTCGGCAAGCCGCGTCGAGGCGA GCGTTTGGACCCTGTGAGCGATGGTCCCCCGTCCGTCGGGGG
PHỤ LỤC 2f (tiếp): TRÌNH TỰ SO SÁNH CÁC MẪU NGHIÊN CỨU >S12_Thai Nguyen (GL4) ITS1 ( 1 phần): CGCGAACACGTTTGAACACCCGCGTCGGGCGTCCGGCCCAAACCGGCGCCCCTCGCCCCC CCGCCCGGCCGAACGGAGCCTCCTTCGGCCGACGGTCGCGCCGGGCAACCGAAACAAAA ATCGGCGCGGGAAGCGCCAAGTACTTGAGAAATGGGATGCCCTCCCGCGGGGAGTGCCGT TCGCGGAATCCTCGCCGCGGGGCTCGAAGGGCGCCCGAAACGAAATGTC 5.8S: ACACGACTCTCGGCAACGGATATCTAGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGTAGCAAACTGC GATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCCCGTGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGC CCGAAGCCGTCAGGCCGAGGGCACGTCTGCCTGGGCGTCACGC ITS2 ( 1 phần): ATCGCGTCGCCCCCCGCTCTCCCCGTCCCGATAGGGCCGCGGGCAGAGCGGAGGGGCGGA AGTTGGCTCCCCGTGCTCCGTCGCGGCCAGCCTAAAACAAGGTTCCCTCGCCGCGGACGT CGCGACAAGTGGTGGTCGTCGAGATTGAACGCGTGTCGTCGGCAAGCCGCGTCGAGGCGA GCGTTTGGACCCTGTGAGCGATGGTCCCCCGTCCGTCGGGGG >T17_Tuyen Quang (GL5) ITS1 (1 phần): CGCGAACACGTTTGAACATCCGCGTCGGGCGTCCGGCCCAAACCGGCGCCCCTCGCCCCC CCGCCCGGCCGAACGGAGCCTCCCTCGGCCGACGGTCGCGCCGGGCAACCGAAACAAAA ATCGGCGCGGGAAGCGCCAAGTACTTGCGAAATGGGATGCCCTCCCGCGGGGAGCGCCGT TCGCGGAATCCTCGCCGCGGGGCTCGAAGGGCGCCCGAAACGAAATGTC 5.8S: ACACGACTCTCGGCAACGGATATCTAGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGTAGCAAACTGC GATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCCCGTGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGC CCGAAGCCGTCAGGCCGAGGGCACGTCTGCCTGGGCGTCACGC ITS2 (1 phần): ATCGCGTCGCCCCCCGCTCTCCCCGTCCCGATAGGGCCGCGGGCAAAGCGGAGGGGCGGA AGTTGGCTCCCCGTGCTCCGTCGCGGCCAGCCTAAAACAAGGTTCCCTCGCCGCGGACGT CGCGACAAGTGGTGGTCGTCGAGATTGAACGCGTGTCGTCGATAAGCCGCGTCGAGGCGA GCGTTTGGACCCTGTGAGCGATGGTCCCCCGTCCGTCGGGGG >G.Sylvestre (Genbank: FM178492.1) ITS1 ( 1 phần): CGCGAACACGTTTGAACACCGGCGTCGGGCGTCGTCGGCGCCCCTCGCCCCCCCGCCCGG CCGAACGGCGGCCCGACCGGTCGTCGGTCGCGCCGGGCAACCGAAACAAAAACCGGCGC GGGAAGCGCCAAGGACTTGAGAAATGGGATGCCTTCCCGCGGGGAGTGCCGTTCGCGGA ATCCTCGCCGCGGGGCTCGAAG GGCGCCCGAAACGAAATGTC 5.8S: ACACGACTCTCGGCAACGGATATCTAGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGTAGCAAACTGC GATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCCCGTGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGC CCGAAGCCGTTAGGCCGAGGGCACGTCTGCCTGGGCGTCACGC ITS2 (1 phần): ATCGCGTCGCCCCCCGCTCGCCCCGTCCCGAGGGGGATGCGGGCGTAGAGGAGGGGCGG AAGTTGGCTTCCCGTGCTCCGTCGCGGCCAGCCTAAAACAAGGTTCCCTCGCCGCGGACG TCGCGACAAGTGGTGGTCGTCGAGATTGAACGCGCGTCGTCGGCAGGACGCGTCGAGGGG AGCGTTTGGACCCCGTGCGCGTGAGTCCCTCGTCCGTCGGGGG
PHỤ LỤC 2g: TRÌNH TỰ GIÓNG HÀNG ĐOẠN GEN ITS1-5,8S-ITS2