2.1.3.1. Nghiên cứu đa dạng di truyền
- Thiết bị bảo quản mẫu: tủ lạnh sâu -23oC (Biomedical Freezer – Sanyo). - Dụng cụ tách chiết bao gồm: chày, cối sứ, máy ly tâm để bàn tốc độ cao Eppendorf 5415R, tủ lạnh sâu -30oC, ống eppendorf (0,2 ml; 1,5 ml), bể ổn nhiệt Memmert WNB10, máy lắc vortex IKA.
- Dụng cụ nhân gen: Eppendorf Mastercycler Pro S, máy soi chụp ảnh gen UVP Gel-docIt , máy điện di Consort EV 222.
- Dụng cụ giải trình tự gen: máy giải trình tự ABI 3730xl DNA Analyzer, máy nhân gen DNA Engine Tetrad 2 Peltier Therma Cycler (BIO-RAD).
2.1.3.2. Nghiên cứu hóa học
- Cân kỹ thuật sartorius, độ chính xác 0,01 g. - Máy xác định hàm ẩm AND MF-50.
19 - Hệ thống chiết hồi lƣu.
- Máy cô quay Buchi.
- Hệ thống máy sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao CAMAG gồm: máy chấm sắc ký Linomat 5, buồng triển khai ADC2, buồng phát hiện TLC Visualizer, phần mềm phân tích winCATS và VideoScan.
- Các dụng cụ thủy tinh: cốc có mỏ nhiều thể tích, bình định mức nhiều thể tích, ống nghiệm, pipet chính xác các loại, đũa thủy tinh, phễu thủy tinh, bình gạn.
2.2. P ƢƠN P ÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Nghiên cứu đặc điểm hình thái
2.2.1.1. Phân tích hình thái
Mô tả phân tích đặc điểm hình thái của các mẫu nghiên cứu theo phƣơng pháp mô tả phân tích [1], [3]. Trong nghiên cứu các đặc điểm đƣợc mô tả, thuộc các nhóm: Dạng sống, Thân, Lá, Hoa, Quả, Hạt (bảng 2.2). Dụng cụ sử dụng trong phân tích bao gồm: Kính lúp soi nổi Leica EZ4, máy ảnh kỹ thuật số chụp trực tiếp (Canon EOS 60D + Canon 100mm f2.8 Macro) hoặc máy ảnh chụp qua kính lúp soi nổi (Canon SD4500IS).
Bảng 2.2. ặc điểm hình thái mô tả các mẫu G.latifolium Wall. ex Wight
Stt Đặc điểm Các đặc điểm mô tả
1. Dạng sống Dạng sống, chiều cao
1. Thân Hình dạng thân già, bề mặt cành non, màu sắc nhựa mủ 2. Lá Cách mọc của lá, cuống lá, hình dạng phiến, hình dạng mép,
số cặp gân chính, chiều dài x chiều rộng, bề mặt trên, bề mặt dƣới
3. Hoa Kiểu cụm hoa, số hoa mỗi cụm, chiều dài cụm hoa, lá bắc, đài (hình dạng, bề mặt), tràng (hình dạng, tràng phụ), bộ nhị (trụ nhị nhụy, thể truyền phấn), bộ nhụy (hình dạng kích thƣớc lá noãn, núm nhụy.
4. Quả Loại quả, hình dạng quả, kích thƣớc dài x rộng
20
2.2.1.2. Xác định tên khoa học
Tên khoa học đƣợc xác định dựa trên khóa phân loại và mô tả loài trong các tài liệu thực vật trong nƣớc (Khóa phân loại của Trần Thế Bách [2] , các bản mô tả trong sách Cây cỏ Việt Nam (tập 2, 2000) của Phạm Hoàng Hộ [7], Từ điển thực vật thông dụng của Võ Văn Chi [5]) và các tài liệu ngoài nƣớc (Thực vật chí Trung Quốc [18], Thực vật chí Đài Loan [35], Thực vật chí Đông Dƣơng [23]). Các mẫu sau khi tra khóa đƣợc so sánh đối chiếu với các tiêu bản type hoặc isotype của loài tham khảo từ mẫu lƣu tại phòng tiêu bản Paris (phiên bản online) và các phòng tiêu bản trên thế giới (nếu có).
2.2.2. Nghiên cứu đa dạng di truyền
2.2.2.1. Tách chiết ADN tổng số
Quy trình tách chiết ADN sử dụng bộ kít chiết tách ADN thực vật GeneJET (Thermo Scientific) gồm các bƣớc sau:
- Nghiền mẫu trong nitơ lỏng bằng cối chày .
- Chuyển mẫu đã nghiền vào ống eppendorf 1,5 ml có chứa 350 µl Lysis Buffer A. Lắc vortex 10 – 20 giây để trộn đều hỗn hợp đảm bảo tất cả bột lá đƣợc tiếp xúc đều với Lysis Buffer A.
- Thêm 50 l Lysis Buffer B và 20 l RNase A. - Ủ ở 65o
C trong 10 phút, thỉnh thoảng lắc đảo ống trong lúc ủ. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Thêm 130 l Precipitation Solution và lắc đảo ống 2-3 lần. Ủ trong đá 5 phút. - Ly tâm với tốc độ 14000 vòng/phút trong 5 phút.
- Thu dịch nổi và chuyển sang ống eppendorf 1,5 ml mới. Thêm 400 l Plant gDNA Binding Solution và 400 l ethanol 96% và trộn đều.
- Chuyển hỗn hợp dịch trên vào ống spin column đƣợc cung cấp sẵn. Ly tâm với tốc độ 8000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ dịch.
- Thêm 500 l Wash Buffer I đã đƣợc thêm ethanol 96% vào ống spin column. Ly tâm với tốc độ 10000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ dịch nổi. Column đƣợc chuyển sang đặt trong ống eppendorf mới.
21
- Thêm 500 l Wash Buffer II đã đƣợc thêm ethanol 96%. Ly tâm với tốc độ 14000 vòng/phút trong 3 phút. Loại bỏ ống eppendorf chứa dịch nổi. Column chứa ADN đƣợc chuyển sang đặt trong ống eppendorf mới.
- Thêm 100 l Elution Buffer để hòa tan ADN, ủ trong 5 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó ly tâm với tốc độ 10000 vòng/phút trong 1 phút. Loại column, thu ống eppendorf có chứa ADN đã đƣợc hòa tan.
- Bảo quản ADN ở nhiệt độ -20oC để thực hiện các bƣớc tiếp theo.
2.2.2.2. Khuếch đại ADN (PCR)
Phản ứng PCR đƣợc thực hiện với hỗn hợp phản ứng đƣợc trình bày ở bảng 2.3.
Bảng 2.3. Các thành phần cơ bản của phản ứng PCR
Thành phần Thể tích (µl)/ 1 phản ứng
Nƣớc khử ion vô trùng 5,10
Dung dịch đệm cho Taq ADN polymerase (10X) 1,00
dNTP (2,5mM) 0,30
Mồi xuôi (10pmol/µl) 0,70
Mồi ngƣợc (10pmol/µl) 0,70
Taq ADN-polymerase (5U/µl) 0,25
ADN khuôn 2,00
Tổng thể tích 10,00
Khởi động nhiệt 95oC trong 5 phút. Tiến hành 38 chu kỳ:
+ Biến tính: 95oC trong 50 giây. + Bắt cặp: 57oC trong 50 giây. + Khuếch đại: 72oC trong 50 giây. Pha tổng hợp cuối cùng: 72oC trong 8 phút.
2.2.2.3. Điện di ADN trên gel agarose
Đặt bản gel agarose vào trong máy điện di có dung dịch đệm TAE 1X và đã đƣợc thêm ethidium bromid, tra mẫu ADN cùng với chất chỉ thị xanh bromophenol vào giếng trên bản gel. Chạy điện di ở điện thế 110V trong khoảng 30 phút. Sau đó nhấc bản gel ra và quan sát dƣới đèn tử ngoại ở bƣớc sóng 302 nm.
22
2.2.2.4. Tinh sạch và giải trình tự ADN
Các mẫu ADN sau khi đƣợc khuếch đại đƣợc tinh sạch sử dụng bộ kít tinh sạch GenJet Gel Extraction Kit (Thermo Scientific). Các mẫu ADN đã tinh sạch đƣợc gửi sang phòng thí nghiệm Macrogen (Hàn Quốc) để giải trình tự gen. Phƣơng pháp giải trình tự gen sử dụng bộ kít giải trình tự ADN BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kits (Applied Biosystems) trên máy giải trình tự ABI 3730xl DNA Analyzer và máy nhân gen DNA Engine Tetrad 2 Peltier Thermal Cycler (BIO-RAD).
2.2.2.5. So sánh trình tự ADN
Trình tự ADN của 5 mẫu nghiên cứu đƣợc gửi đăng ký trình tự lên ngân hàng gen thế giới (Genbank) sử dụng phần mềm SEQUIN với các mã số KP126832 (GL1), KP126833 (GL2), KP126834 (GL3), KP163979 (GL4), KP126835 (GL5) và so sánh với trình tự tƣơng ứng của loài Gymnema sylvestre (Retz) R. Br. ex Schult đã công bố trên ngân hàng gen thế giới (Genbank – FM178492) bằng công cụ BLAST.
2.2.2.6. Xây dựng cây phân loại dựa trên trình tự ADN (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Trên cơ sở trình tự ADN của các mẫu nghiên cứu xây dựng cây phân loại bằng phần mềm Geneouis R8 phƣơng pháp UPGMA, với hệ số bootstrap 10.000 lần). Cây phân loại này sẽ phản ánh mức độ gần gũi về quan hệ di truyền của các mẫu.
2.2.3. Vân tay sắc ký Gymnema latifolium Wall. ex Wight
2.2.3.1. Chuẩn bị mẫu
a. Mẫu chuẩn
Hòa tan chính xác 15,0 mg Gymnemagenin chuẩn (hàm lƣợng 96,5 %) vào bình định mức 25,0 ml bằng methanol. Hút chính xác 2,0 ml dung dịch trên vào bình định mức 10,0 ml. Thêm methanol vừa đủ đến vạch, lắc đều.
b. Mẫu thử
10,0 g lá dƣợc liệu đƣợc chiết hồi lƣu trong 8h với 240 ml dd methanol – acid hydrochloric 2,5 N (1:1). Lọc thu dịch A. Đổ dịch chiết A vào cốc có mỏ chứa 600 ml nƣớc cất đã đƣợc làm lạnh, khuấy đều và để hỗn hợp này kết tủa qua đêm trong
23
ngăn mát tủ lạnh. Ly tâm thu tủa, rửa tủa bằng nƣớc cất đến pH 7. Đun hồi lƣu tủa thu đƣợc với 50 ml KOH 2% trong methanol trong 4h thu đƣợc dịch B. Cô dịch B tới cắn và hòa tan với 200 ml nƣớc cất, sau đó lắc với ethylacetat cho đến khi lớp ethylacetat không màu. Cất quay dịch chiết ethylacetat thu đƣợc đến cắn. Cắn này đƣợc hòa tan vào bình định mức 20,0 ml methanol và tiến hành xác định vân tay sắc ký và bán định lƣợng.
2.2.3.2. Lựa chọn điều kiện triển khai sắc ký
- Bản mỏng: bản mỏng TLC silica gel 60 F254 (Merck) hoạt hóa ở 110˚C trong 30 phút. Kích thƣớc bản mỏng 20 × 10 cm.
- Đƣa mẫu lên bản mỏng: mẫu đƣợc phun lên bản mỏng bằng máy chấm mẫu Linomat 5. Vị trí chấm mẫu cách mép dƣới bản mỏng là 7,5 mm, cách mép dung môi từ 3,0 – 5,0 cm. Khoảng cách giữa vết ngoài cùng và mép ngoài bản mỏng là 10,0 mm. Độ dài băng chấm 6,0 mm và thể tích chấm mỗi vết là 2,0 µl.
- Hệ dung môi khai triển: Toluen: Ethylacetat: Acid formic (20:16:4). - Điều kiện chạy HPTLC:
+ Điều kiện môi trƣờng: nhiệt độ 26oC; độ ẩm tƣơng đối 65%. + Thể tích dung môi bão hòa: 25,0 ml; dung môi khai triển: 10,0 ml. + Thời gian sấy bản mỏng: 5 phút.
+ Thời gian bão hòa dung môi: 20 phút. + Thời gian bão hòa bản mỏng: 4 phút.
+ Khoảng cách dịch chuyển của pha động: 80,0 mm.
- Bản mỏng đƣợc nhúng thuốc thử valinin/acid sulphuric (pha theo DĐVN IV), sau đó sấy ở 100oC trong 15 phút và hiện màu dƣới ánh sáng thƣờng.
2.2.3.3. Xác định vân tay sắc ký
Cách thực hiện:
- Chuẩn bị mẫu chuẩn và mẫu thử theo mục 2.2.3.1.
- Triển khai sắc ký các mẫu thử và mẫu chuẩn theo điều kiện ở phần 2.2.3.2. có bổ sung thêm phần hiện màu dƣới ánh sáng tử ngoại 254 nm và 366 nm.
24
- Chụp ảnh bản mỏng, xác định các vết chính trên sắc ký đồ và tính toán giá trị Rf tƣơng ứng của từng vết. Thực hiện 5 lần để tính giá trị trung bình và giá trị RSD của Rf .Các vết đƣợc lựa chọn là các vết xuất hiện ở đa số các mẫu thử.
Công thức tính:
Trong đó:
n: số lần triển khai sắc ký. Xi: giá trị Rf tại lần thứ i.
: giá trị trung bình của Rf.
RSD: độ lệch chuẩn của các giá trị Rf.
2.2.4. Bán định lƣợng bằng phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) (HPTLC) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.2.4.1. Quy trình bán định lượng
a. Mẫu chuẩn: từ mẫu chuẩn đã chuẩn bị theo mục a phần 2.2.3.1, pha dãy chuẩn gồm các nồng độ nhƣ bảng 2.4.
Bảng 2.4. Các dãy nồng độ của dung dịch mẫu chuẩn (mg/ml).
GMG1 GMG2 GMG3 GMG4 GMG5 GMG6
Nồng độ 0,096 0,192 0,288 0,384 0,480 0,576
b. Mẫu thử: chuẩn bị theo mục b phần 2.2.3.1.
c. iều kiện triển khai sắc ký: theo phần 2.2.3.2.
Triển khai sắc ký lớp mỏng các mẫu thử và các mẫu chuẩn trên cùng một bản mỏng. Xây dựng đƣờng chuẩn bán định lƣợng dựa trên diện tích pic và nồng độ Gymnemagenin của các mẫu chuẩn. Từ đƣờng chuẩn bán định lƣợng, khảo sát đƣợc khoảng nồng độ Gymnemagenin trong các mẫu thử. Từ đó tính hàm lƣợng % Gymnemagenin trong dƣợc liệu theo công thức sau :
25
% GMG = × 100
Trong đó :
% GMG: tỷ lệ % Gymnemagenin có trong dƣợc liệu. C: là nồng độ dung dịch thử (mg/ml).
m: là khối lƣợng bột dƣợc liệu (g). f: là hệ số pha loãng của mẫu thử. h: là độ ẩm của bột dƣợc liệu.
2.2.4.2. Thẩm định phương pháp bán định lượng
a. ộ đặc hiệu
Cách tiến hành: chuẩn bị 3 mẫu sau:
Mẫu trắng: dung dịch MeOH
Mẫu thử: mẫu GL3 đƣợc chuẩn bị theo phần b mục 2.2.3.1.
Mẫu chuẩn: chuẩn Gymnemagenin (GMG4) đƣợc chuẩn bị theo phần a mục 2.2.3.1.
Triển khai sắc ký với điều kiện đã đƣợc mô tả ở mục 2.2.3.2, quan sát số lƣợng vết, hình dáng các vết và so sánh giá trị RSD của Rf [12].
Đánh giá kết quả: đánh giá dựa trên giá trị RSD của Rf. Công thức tính RSD đƣợc ghi ở mục 2.2.3.3. Phƣơng pháp HPTLC đƣợc coi là có tính đặc hiệu hay chọn lọc đối với chất cần phân tích nếu: (i) Sắc ký đồ của mẫu thử cho các vết chính có cùng hình dạng, màu sắc, giá trị Rf với các vết chính trong sắc ký đồ của mẫu chuẩn; (ii) Sắc ký đồ các mẫu trắng không xuất hiện các vết tƣơng ứng với các vết chính trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn.
Giá trị đề nghị chấp nhận khi so sánh trị số Rf: độ lệch chuẩn tƣơng đối của giá trị Rf các vết trên sắc ký đồ dung dịch thử không quá 5%. Độ lệch giá trị Rf trên vết mẫu thử so với vết mẫu chuẩn không quá 5% [12].
b. Tính tuyến tính
Cách tiến hành: Chuẩn bị mẫu chuẩn theo mục a phần 2.2.3.1, dãy mẫu chuẩn đƣợc pha theo mục a phần 2.2.4.1. Tiến hành triển khai HPTLC với dãy dung
26
dịch chuẩn trên. Xây dựng phƣơng trình biểu diễn mối quan hệ tuyến tính giữa nồng độ chất chuẩn có trong mẫu và đáp ứng pic thu đƣợc trên các sắc ký đồ bằng phƣơng pháp bình phƣơng tối thiểu.
Đánh giá: Dựa vào hệ số tƣơng quan R2 của đƣờng chuẩn để đánh giá độ tuyến tính. Trong nghiên cứu chấp nhận phƣơng pháp có độ tuyến tính tốt với R2>0,99.
c. ộ thích hợp của hệ thống
Cách tiến hành: Tiêm 6 lần dung dich chuẩn GMG3 đƣợc chuẩn bị theo mục a phần 2.2.4.1, triển khai HPTLC theo điều kiện đƣợc mô tả ở mục 2.2.3.2.
Đánh giá: Tính RSD của diện tích pic, chiều cao pic. Giá trị RSD của diện tích (chiều cao) pic giữa các lần tiêm mẫu (n > 5) nên nhỏ hơn 2,0% (đối với phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [12]. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
27
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. ẶC ỂM THỰC VẬT CÁC MẪU GYMNEMA LATIFOLIUM
WALL. EX WIGHT
Trong 5 mẫu nghiên cứu, chỉ có mẫu GL3 thu hái ở Hoà Bình đã thu đƣợc đầy đủ tất cả các bộ phận cơ quan sinh dƣỡng (thân, lá) và cơ quan sinh sản (hoa, quả, hạt). Các mẫu còn lại chỉ thu đƣợc các bộ phận là cơ quan sinh dƣỡng (thân, lá). Riêng mẫu GL1 (Tây Ninh) thu thêm đƣợc đặc điểm cụm hoa và GL2 (Gia Lai) thu đƣợc quả và hạt (bảng 3.1).
3.1.1. Các đặc điểm hình thái đặc trƣng của các mẫu
a. Mẫu GL1: Thân già phình không dạng cánh rõ rệt, thân non có nhiều lỗ vỏ, toàn thân có nhựa mủ màu vàng và phủ lông màu sét. Lá mọc đối, chiều dài cuống lá 2,5 – 4 cm. Phiến lá hình trứng, gốc lá hình tim, ngọn lá nhọn lá dày, chỉ số lá chiều dài/chiều rộng (1 – 1,5), kích thƣớc là 8-13 cm × 5-8 cm. Gân bên 6 cặp dạng lông chim, mép lá phủ lông mịn. Cụm hoa xim dạng đầu thành đôi ở mấu, có lông dày, thƣa (hình 3.1).
28
b. Mẫu GL2: Thân già phình dạng cánh, thân non có nhiều lỗ vỏ, toàn thân có nhựa mủ màu vàng và phủ lông màu sét. Lá mọc đối, chiều dài cuống lá 1,5 – 3 cm. Phiến lá hình trứng, gốc lá nhọn gần tròn, ngọn lá nhọn lá dày, chỉ số lá chiều dài/chiều rộng (1,5 – 1,7), kích thƣớc là 8-13 cm × 5-8 cm. Gân bên 5 cặp dạng lông chim, mép lá phủ lông mịn. Quả đại hình mác nhọn, 5,5 x 1,5 cm. Hạt hình trứng, có túm lông ở đầu (hình 3.2).
Hình 3.2. Mẫu L2 (Gia Lai; 13o59’44.5”N - 108o26’58.3”E).
c. Mẫu GL3: Thân leo tới 6 m. Thân già phình dạng cánh, thân non có nhiều lỗ vỏ, các nhánh có nhiều lông tơ. Cuống lá 1,5-4 cm, có lông tơ dày đặc; phiến lá 8-13×5- 8 cm, lông dày đặc, càng xa trục càng dày đặc, gốc tròn, ngọn nhọn, gân bên 5-6 cặp. Cụm hoa xim dạng đầu thành từng đôi ở mấu, có lông dày đặc. Một cụm mang
29
rất nhiều hoa, mùi thơm. Cuống cụm hoa 1-1,5 cm, cuống hoa 3-8 mm. Đài hình trứng, phủ lông măng. Tràng hoa vàng, hình chuông, nhẵn ở mặt ngoài. Ống hoa có 5 cặp gờ mang lông ở họng tràng, các thùy hình trứng, khoảng 1,2 ×1,2 mm, phủ lông dày đặc hƣớng trục, ngắn hơn so với ống tràng. Trụ nhị nhụy dạng hình trụ, phần phụ nhị dạng màng ngắn hơn so với đầu núm nhụy. Khối phấn hình thuôn. Đầu núm nhụy hình nón, đỉnh phân đôi. Quả đại hình mác nhọn, mũi cong, 4,5- 5,5×1,5-2 cm, có lông dày đặc. Hạt hình trứng thuôn, dài khoảng 1,1 cm×5 mm, mép dạng màng; mào lông dài 3 cm (hình 3.3).
30
d. Mẫu GL4: Thân leo tới 6 m. Thân có lỗ vỏ, các nhánh có nhiều lông tơ. Cuống lá