Nghiên cứu đặc điểm hình thái thực vật, trình tự ADN và hàm lượng rotundin trong một số loài stephania lour ở việt nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THU HẰNG NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI THỰC VẬT, TRÌNH TỰ ADN VÀ HÀM LƯỢNG ROTUNDIN TRONG MỘT SỐ LOÀI STEPHANIA LOUR..

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THU HẰNG

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI THỰC VẬT, TRÌNH TỰ ADN VÀ HÀM LƯỢNG ROTUNDIN TRONG MỘT SỐ

LOÀI STEPHANIA LOUR Ở VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THU HẰNG

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI

THỰC VẬT, TRÌNH TỰ ADN VÀ HÀM

LƯỢNG ROTUNDIN TRONG MỘT SỐ

LOÀI STEPHANIA LOUR Ở VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH DƯỢC LIỆU – DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN

MÃ SỐ: 60720406

Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Quốc Huy

HÀ NỘI 2014

Lời cảm ơn

Trong quá trình học tập và thực hiện luận văn, tôi thường xuyên nhận được sự ủng hộ, tạo điều kiện của Đảng ủy, Ban giám hiệu Trường Đại học Dược Hà Nội, Phòng Đào tạo sau đại học và Bộ môn Thực vật nơi tôi đang công tác và học tập

Hoàn thành luận văn này, trước hết tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và

biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Quốc Huy và ThS Phạm Hà Thanh Tùng

là những người Thầy đã chỉ bảo tận tình, trực tiếp hướng dẫn và nâng đỡ tôi rất nhiều trong thời gian qua

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới Tập thể bộ

môn Thực vật - Trường Đại học Dược Hà Nội đã nhiệt tình giúp đỡ, chia sẻ

và hỗ trợ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và công tác

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô, anh chị em kỹ thuật viên bộ môn Dược liệu, bộ môn Dược học cổ truyền – Trường Đại học Dược Hà Nội

đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong thời gian học tập tại bộ môn

Tôi xin cảm ơn SV Quách Thị Thúy Nga, SV Lương Thị Lan, ThS

Hoàng Văn Thủy cùng “nhóm nghiên cứu bình vôi” đã hỗ trợ tôi rất nhiều

trong suốt quá trình thực hiện nghiên cứu này

Tôi xin chân thành cảm ơn KS Nguyễn Trường Khoa và các thầy cô

bộ môn Kỹ thuật di truyền – Viện Di truyền nông nghiệp

Cuối cùng, tôi vô cùng cảm ơn chồng và hai con yêu quí, những người thân, bạn bè, các em sinh viên đã luôn bên cạnh chia sẻ, động viên tôi vượt qua mọi khó khăn để hoàn thành khóa học này

Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn tất cả sự hướng dẫn, giúp đỡ

và cộng tác quý báu này

Hà Nội, ngày 25 tháng 08 năm 2014

Nguyễn Thu Hằng

MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Chi Stephania Lour 3

1.1.1 Vị trí phân loại 3

1.1.2 Đặc điểm của chi Stephania Lour 3

1.1.3 Phân bố 4

1.1.4 Đặc điểm thực vật và phân bố các loài thuộc chi Stephania Lour ở Việt Nam 7

1.1.5 Tình hình nghiên cứu về thực vật của chi Stephania Lour ở Việt Nam 15

1.2 Acid deoxyribose nucleotide (ADN) và xác định trình tự ADN 16

1.2.1 Phân tử ADN 16

1.2.2 Xác định trình tự ADN 17

1.2.3 Tình hình nghiên cứu về di truyền chi Stephania Lour trên thế giới 19

1.2.4 Tình hình nghiên cứu về di truyền chi Stephania Lour ở Việt Nam 20

1.3 Rotundin 20

20

21

Stephania Nam 22

24

2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị 24

2.1.1 Nguyên liệu 24

25

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.2.1 Phương pháp nghiên cứu 26

2.2.2 Phương pháp n 26

2.2.3 Phương pháp đ 29

31

3.1 Đặc điểm hình thái thực vật và giám định tên khoa học của một số loài trong chi Stephania Lour ở Việt Nam 32

3.1.1 Loài B1 và B2 32

3.1.2 Loài B5 34

3.1.3 Loài B6 37

3.1.4 Loài B10 40

3.2 Xác định trình tự ADN các loài nghiên cứu 46

3.2.1 Kết quả tách chiết ADN 46

3.2.2 Kết quả khuếch đại vùng ITS1 – 5,8S – ITS2 46

3.2.3 Kết quả giải trình tự vùng ITS-rDNA 46

3.2.4 So sánh trình tự gen ITS giữa các mẫu nghiên cứu 51

3.2.5 So sánh trình tự gen các mẫu nghiên cứu với các trình tự đã công bố trên Genbank 52

3.2.6 So sánh trình tự gen giữa các mẫu nghiên cứu 52

3.3 Định lượng hàm lượng rotundin trong các loài Stephania Lour nghiên cứu 54

3.3.1 Đánh giá độ thích hợp và độ ổn định của hệ thống 54

3.3.2 Kết quả phân tích định lượng 55

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 56

4.1 Về đặc điểm hình thái 56

4.2 Về đặc điểm trình tự ADN 58

4.3 Về hàm lượng rotundin trong các mẫu nghiên cứu 59

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 60

23 S Stephania

DANH MỤC BẢNG

1 Bảng 1.1 Phân bố các loài thuộc chi Stephania Lour ở Việt Nam 5

2 Bảng 1.2 Nghiên cứu về đặc điểm thực vật các loài thuộc chi

Stephania Lour ở Việt Nam

15

6 Bảng 3.1 Thành phần bốn loại nucleotide của các mẫu nghiên cứu 50

7 Bảng 3.2 Trình tự mẫu nghiên cứu so sánh với trình tự công bố trên

DANH MỤC HÌNH

8 Hình 3.5 Hình ảnh loài Stephania hernandifolia (Willd.) Walp 37

9 Hình 3.6 Hình vẽ loài Stephania hernandifolia (Willd.) Walp 38

14 Hình 3.11 Băng điện di ADN tổng số của các mẫu nghiên cứu 45

15 Hình 3.12 Băng điện di sản phẩm PCR đoạn trình tự

ITS1-5.8S-ITS2 của các mẫu nghiên cứu

45

16 Hình 3.13 Sơ đồ mối quan hệ di truyền giữa các mẫu nghiên cứu 53

1

Chi bình vôi (Stephania Lour.) là một chi lớn, đa dạng thuộc họ Tiết dê

(Menispermaceae) với khoảng 107 loài [30], [35], [36] Các loài thuộc chi này đã được sử dụng từ lâu trong y học truyền thống để trị các bệnh như mất ngủ, hen suyễn, lao, tăng đường huyết, ung thư, sốt … và ngày nay vẫn có vị trí quan trọng

trong y dược hiện đại Ở Việt Nam, chi Stephania Lour có khoảng 20 loài, phân bố

rộng khắp các vùng, được sử dụng nhiều trong y học truyền thống [5], [6], [8], [14]

Theo các nghiên cứu trước đây, chi Stephania Lour là nguồn cung cấp nhiều

alcaloid có hoạt tính sinh học như: rotundin, cepharanthin, tetrandrin Đặc biệt là rotundin, một trong không nhiều nguyên liệu làm thuốc quan trọng mà Việt Nam tự sản xuất được từ nguồn nguyên liệu là các loài bình vôi trong nước Rotundin có tác dụng an thần gây ngủ, điều hòa tim, giãn cơ trơn, do đó làm giảm các cơn đau do co thắt cơ trơn… Trên thị trường có nhiều dược phẩm có tác dụng an thần chứa thành phần hoạt chất chính là rotundin như Rotundin TW3 (Công ty cổ phần Dược phẩm Trung ương 3), Stilux 60 (Traphaco), Rotunda (Công ty cổ phần Dược phẩm Trung ương 2), Là một nước đa dạng về tài nguyên cây thuốc nói chung và chi

Stephania Lour nói riêng nhưng qua khảo sát nguồn nguyên liệu rotundin sử dụng

để sản xuất chỉ có một số ít công ty tự sản xuất từ củ Bình vôi còn phần lớn các công ty nhập rotundin thô từ Trung Quốc Do đó việc tiếp tục nghiên cứu phân loại

các loài thuộc chi Stephania

rotundin cao là rất cần thiết

Các loài thuộc chi Stephania

hợp các đặc điểm về hình thái thực vật, di truyền… thành bộ dữ liệu về từng loài, phối hợp giữa các quốc gia thành ngân hàng dữ liệu trở nên rất quan trọng để xác

định chính xác tên các loài Chính vì vậy đề tài “Nghiên cứu đặc điểm hình thái

2

thực vật, trình tự ADN và hàm lƣợng rotundin trong một số loài Stephania

Lour ở Việt Nam” được thực hiện với các mục tiêu sau:

- Mô tả đặc điểm hình thái thực vật và giám định tên khoa học của một số loài

trong chi Stephania Lour ở Việt Nam

- Xác định trình tự ADN của các loài Stephania Lour nghiên cứu

- Định lượng hàm lượng rotundin trong các loài Stephania Lour nghiên cứu

3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Chi Stephania Lour

1.1.1 Vị trí phân loại

Theo hệ thống phân loại của Takhtajan năm 1996, chi Stephania Lour được

xếp vào họ Tiết dê (Menispermaceae) trong bộ Hoàng liên (Ranunculales), phân lớp Hoàng liên (Ranunculidae), lớp Ngọc lan (Magnoliopsida), ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) [41]

1.1.2 Đặc điểm của chi Stephania Lour

Chi Stephania Lour có các đặc điểm hình thái sau:

Dây leo sống lâu năm hoặc hàng năm, hầu hết mảnh khảnh Thân non thường nhẵn, xanh nhạt, xanh bóng hoặc xanh thẫm Thân già thường có rãnh dọc, mụn cóc sần sùi màu nâu xám, nâu đen hoặc màu nâu đất [20] Thân gỗ hay thân cỏ [37], [38] Rễ dạng sợi hoặc phình to thành rễ củ Rễ củ rất đa dạng về hình thái, kích thước và màu sắc Rễ củ thường có dạng hình cầu, hình trứng, hình trụ hay có hình dạng bất định Khối lượng của rễ củ thường từ 0,5- 2 (3) kg nhưng cũng có loài có thể nặng tới 50-70 kg, cá biệt có nơi đã thu được củ nặng 170 kg Màu sắc vỏ củ có nhiều thay đổi (nhẵn, xù xì, màu nâu sáng nhạt, xám tro hay đen ) tùy thuộc vào từng loài, tuổi cây và điều kiện môi trường sống Thịt củ nạc hoặc có lẫn những vằn

xơ, màu trắng ngà, vàng tươi, vàng nhạt hoặc đỏ nâu, đỏ tươi tùy theo loài [20]

Lá mọc cách Cuống lá thường mảnh, dài 2-15 cm, hai đầu phình lên [20], có khi gấp khúc ở gốc [33] Cuống lá đính vào phiến lá thường ở những vị trí cách xa mép dưới của gốc lá ở những khoảng cách nhất định tùy từng loài (có thể từ 1/15 đến 1/3 chiều dài phiến lá Phiến lá mỏng hoặc dày, nhẵn bóng hoặc rải rác có lông, hình khiên, hình lọng, hình tam giác rộng, hình trứng - tam giác, tam giác tròn hoặc gần tròn, mép lá nguyên hoặc chia thùy, gân lá dạng chân vịt gồm 8-10 gân lá xuất phát từ đỉnh cuống lá Chóp lá nhọn, thuôn nhọn, tù hoặc gần tròn Gốc lá gần tròn, phẳng hoặc gần hình tim Màu sắc của phiến lá tùy thuộc vào từng loài (màu xanh

nhạt, xanh vàng nhạt, xanh đậm, xanh nâu nhạt hoặc đốm tía- như ở loài S dielsiana) [20], [36]

4

Hoa đơn tính khác gốc Cụm hoa đực và cái thường mọc từ kẽ lá hay mọc

trên thân cây già không lá (S viridiflavens) [11], [36], thường có dạng tán đơn, tán

kép, xim tán kép, hình đầu đến tán ngù [20], có cuống, đơn độc hay xếp theo kiểu chùm ít nhất ở các nhánh của tán cấp 1 (2), các nhánh cuối cùng đôi khi không đều, hoặc đôi khi các xim tụ họp thành đầu hình đĩa [30] Hoa đực thường có cấu tạo đối xứng tỏa tròn; đài 6-8, rời, xếp thành 2 vòng, bằng nhau hay không bằng nhau, hoặc

chỉ 2-3 ở loài S capitata [33], đài ít nhiều hình trái xoan ngược; Cánh hoa rời nhau,

3 hay 4, hình trứng ngược, mép bên nhiều khi gập vào trong (hình vỏ sò) (S brachyandra), màu vàng hay trắng xanh Nhị 2-6, thường 4; chỉ nhị dính nhau tạo

thành ống hình trụ, bao phấn dính nhau thành hình đĩa với 4-8 ô nứt ngang Hoa cái

đối xứng hay bất đối xứng, đài thường 1, cánh hoa 2 (ít khi đài 3-4, cánh hoa 3-4 (S tetrandra), hình dạng giống như ở hoa đực Bầu hình trứng, lá noãn 2 (nhưng chỉ có

1 phát triển thành hạt, 1 lá noãn bị thoái hóa); vòi rất ngắn hoặc không có; núm nhụy từ 4-6 (7) chia thùy ngắn hoặc rách, choãi ra hình dùi [30], [36]

Quả hạch, hình gần tròn, hình trứng, hình trứng ngược, trứng bầu, 2 bên dẹt Quả trưởng thành cuống quả lệch về một phía gần với dấu vết còn lại của núm nhụy Quả chín màu vàng đậm hay đỏ tươi nhẵn bóng Hạt hình móng ngựa, trứng dẹt hoặc hơi tròn, lưng mang một dải hình móng ngựa gồm 2 hoặc 4 dãy dọc các

bướu (gai) hay những gờ ngang (vân) Giá noãn có lỗ thủng hoặc không (S subpeltata) Đặc điểm hình thái của hạt đặc trưng cho từng loài, là dấu hiệu quan

trọng để giám định tên loài [20] Cây mầm có lá mầm ít nhiều bằng rễ mầm, bao quanh bởi nội nhũ [30]

1.1.3 Phân bố

Theo các tài liệu [30],[35] chi Stephania Lour trên thế giới có khoảng 107

loài, phân bố ở vùng nhiệt đới, á nhiệt đới ở các nước châu Á là chủ yếu như: Lào (2 loài), Campuchia (3 loài), Việt Nam (14 loài), Indonesia (17 loài), Đông Timor (1 loài), Myanma (5 loài), Malaysia (10 loài), Thái Lan (18 loài), Philippin (8 loài), Papua New Guinea (8 loài), Quần đảo Solomon (1 loài), Trung Quốc (42 loài), Đài Loan (4 loài), Ấn Độ (11 loài), Sri Lanka (2 loài), Banglades (1 loài), khu vực

loài mọc ngay trên bãi cát hoặc gò hoang vùng ven biển (S pierrei) Phân bố rộng

khắp trên cả 3 miền, từ miền Bắc (Cao Bằng, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Hải Phòng,

Hà Nội, Hà Tây, Hòa Bình, Yên Bái, Lào Cai, Thái Nguyên, Tuyên Quang, Phú Thọ, Hà Giang, Sơn La, Nam Định, Ninh Bình) đến miền Trung (Thanh Hóa, Nghệ

An, Lâm Đồng, Đắc Lắc, Ninh Thuận, Quảng Nam, Đà Nẵng, Thừa Thiên Huế, Bình Định, Phú Yên) và miền Nam (An Giang, Đồng Nai, Sông Bé, Bà Rịa-Vũng

Tàu) [18], [19], [23], [29] Phân bố của các loài thuộc chi Stephania Lour ở Việt

Nam được trình bày ở Bảng 1.1

Bảng 1.1 Phân bố các loài thuộc chi Stephania Lour ở Việt Nam

1 S brachyandra Diels Lai Châu, Lào Cai [8], [20], [22]

2 S cambodica Gagnep Đắc Lắc, Lâm Đồng [8], [28]

3 S cepharantha Hayata Quảng Ninh (Cẩm Phả, Hòn Gai),

Hòa Bình (Kỳ Sơn)

[8], [20], [22], [28]

4

S dielsiana Y.C.Wu Lào Cai, Yên Bái, Bắc Cạn, Thái

Nguyên, Sơn La, Hòa Bình, Phú Thọ, Hà Tây, Bắc Giang, Bắc Ninh, Quảng Ninh

[8], [20], [22], [28]

5

S glabra (Roxb.) Hà Tây, Hòa Bình, Hà Giang, Tuyên

Quang, Nam Định, Hà Nam, Ninh Bình, Cao Bằng, Lạng Sơn, Thanh Hóa, Côn Đảo

12 S longa Lour Vùng đất thấp từ Cao Bằng, Lạng

Sơn tới Thừa Thiên Huế

[8], [18]

13

S pierrei Diels Ninh Bình, Bình Định, Phú Yên,

Khánh Hòa, Bình Thuận, Ninh Thuận, Bà Rịa- Vũng Tàu

[8], [14], [20], [28]

14

S sinica Diels Lạng Sơn, Quảng Ninh, Hà Tây, Hòa

Bình, Hà Nam, Ninh Bình tới Bà Rịa-Vũng Tàu

[8], [14], [20], [28]

15 S tetrandra S Moore Lào Cai, Yên Bái, Hà Bắc, Hà

Giang, Hà Tây, Quảng Ninh

7

1.1.4 Đặc điểm thực vật và phân bố các loài thuộc chi Stephania Lour ở Việt

Nam

- S brachyandra Diels

Tên thường dùng: Bình vôi núi cao [20], bình vôi nhị ngắn [22]

Thân leo nhỏ, yếu Toàn cây không lông Rễ củ to màu vàng nhạt Lá đơn, mọc so le Cuống lá dài; phiến hình trứng nhọn hoặc tam giác tròn [22]; gốc lá bằng hoặc hơi lõm; ngọn lá nhọn; gân 10, hình chân vịt, phát xuất từ đỉnh của cuống lá [8] Cụm hoa đực dạng xim tán kép, cuống chung dài 3-5 cm, mỗi cuống thứ cấp mang 5-15 hoa; đài 6, dài mảnh, màu xanh nhạt, xếp 2 vòng; cánh hoa 3, màu vàng cam, cong dạng vỏ hến và ngắn hơn nhiều so với đài; nhị dính nhau thành ống, bao phấn dính nhau thành dạng đĩa tròn [20] Cụm hoa cái dạng đầu, do 7-9 xim tán có cuống rất ngắn tạo thành [22] Cuống cụm hoa dài 2-3 cm Hoa nhỏ Đài 1, màu lục nhạt, nhỏ, hình mác rộng nhọn đầu Cánh hoa 2, màu vàng cam, hình trứng ngược, dày, nạc, rộng 0,8-0,9 mm, cao 1 mm Hai cánh hoa và đài mọc cùng về một phía của hoa Bầu hình trứng ngược, cuống ngắn, núm nhụy 4-5 thùy Quả hình trứng ngược, dài 0,7-0,8 cm, rộng 0,7 cm, hơi dẹt Vỏ quả trong hình trứng ngược, trên lưng có 4 hàng gai, đỉnh gai phồng to dạng đầu hoặc dạng mũ đinh Giá noãn có lỗ hình trứng đảo ở giữa [8]

- S cambodica Gagnep

Tên thường dùng: Bình vôi Campuchia [6]

Thân leo, sống nhiều năm Rễ củ dạng cầu, sần sùi Thân leo, hóa gỗ, không lông Lá đơn, mọc sole; cuống dài 6-7,5 cm; phiến lá hình tim dạng tam giác, dài 8-9,5 cm, rộng 6-8,4 cm; mép nguyên; đầu nhọn; gốc lõm hoặc gần bằng Gân chính 9-11, xếp hình chân vịt Hoa đơn tính khác gốc Hoa ở phần thân già ra trước khi ra

lá [6] Cụm hoa đực tán kép, cuống cụm hoa và cuống tán dài hơn bất kỳ loài nào khác, cuống cụm hoa gầy, dài 7-12 cm Cuống tán nhỏ dài 4-6,2 cm Hoa đực, đài 6, cánh hoa 3, ôm lấy đĩa nhị Tuyến 2, dạng đệm phía trong gốc cánh hoa [29]

- S cepharantha Hay

Tên đồng nghĩa: S tetrandra S Moore var glabra Maxim; S disciflora Hand Mazz [8], [20] Tên thường dùng: Bình vôi hoa đầu [20]

mm, cong dạng vỏ hến Bầu hình trứng, núm nhụy 4-5 thùy dạng sợi hoặc hình dùi [8] Quả hình trứng đảo, cao 0,7 cm, rộng 0,5 cm, dày 0,3-0,4 cm Vỏ quả trong hình móng ngựa tròn dẹp Trên lưng có 4 hàng vân hạt, mỗi hàng có 15-16 vân dạng hạt Giá noãn không có lỗ [20]

- S dielsiana Y.C.Wu

Tên thường dùng: Củ dòm [20], [22] Tên khác: Bình vôi nhựa tím, cà tòm

(Tày, Tuyên Quang), củ gà ấp [20], [22]

Dây leo nhỏ, sống nhiều năm Rễ củ to Thân leo cuốn dài khoảng 3 m Thân non màu tím hồng nhạt Toàn cây không có lông Lá đơn nguyên, mọc so le, có cuống dài 4,5-8,5 cm Phiến lá hình tam giác tròn, 9-13 x 8-13,5 cm Mép lá hơi lượn sóng có răng tù rất thưa ở ngọn; ngọn lá nhọn; gốc bằng hoặc hơi lõm; gân chính xếp chân vịt, xuất phát từ chỗ đính của cuống lá Ngon non, cuống lá và cuống cụm hoa có màu tím hồng [19], [20] Hoa đơn tính khác gốc Cụm hoa đực

do 3-5 xim nhỏ hợp thành xim tán kép Hoa nhỏ, có cuống ngắn; đài 6, màu tím, xếp 2 vòng, cánh hoa 3, hình quạt tròn, màu vàng cam Cột nhị ngắn, bao phấn 6, dính thành đĩa 6 ô [7] Cụm hoa cái gồm 7-8 đầu nhỏ, cuống rất ngắn, xếp thành dạng đầu Hoa nhỏ; đài 1, màu tím hồng; cánh hoa 2, hình quạt tròn, màu vàng cam

và có các vân tím; bầu hính trứng, đầu nhụy có 4-5 thùy dạng dùi Quả hình trứng

9

đảo, hơi dẹt, cỡ 0,8-0,9 x 0,7-0,75 cm Hạt hình trứng ngược cụt đầu, có lỗ thủng ở giữa, trên lưng hạt có 4 hàng gai nhọn, cong [22]

- S excentrica H.S.Lo:

Tên thường dùng: Bình vôi

Thân leo thảo Toàn cây không có lông, có rễ củ Lá đơn nguyên, cuống lá dài 7-10 cm, có khi đến 14 cm [28], [29] Phiến lá gần như dạng tam giác tròn, dài

và rộng khoảng 5-10 cm Ngọn lá nhọn Gốc lá lõm đến hình tim rộng Gân 10-11, xuất phát từ chỗ đính của cuống lá Cụm hoa đực do các xim nhỏ tạo thành Cuống cụm hoa dài 2-5 cm, cuống tán nhỏ, dài 1-3 cm Hoa đực: đài 6, hình trứng, hoặc hình elip rộng, cao 1-2 mm, xếp 2 vòng; cánh hoa 3, hình nêm rộng, cong dạng vỏ hến, cao gần 0,5 mm, rộng 0,7-0,9 mm Cột nhị dài hơn cánh hoa Cụm hoa cái gần đồng hình với cụm hoa đực Hoa cái: đài 1, hình trứng rộng, cao khoảng 1 mm; cánh hoa 2, gần hình tròn, màu hồng cam, đường kính khoảng 0,6 mm Quả hạch,

vỏ quả trong gần như tròn, đường kính 0,6 cm, trên lưng có 4 hàng gai mỗi hàng gai

có 16-18 gai, đỉnh gai cong dạng móc câu Giá noãn có lỗ lệch một bên [8]

- S glabra (Roxb.) Miers

Tên đồng nghĩa: Cissampelos glabra Roxb., S rotunda Lour [20] Tên thường dùng: Bình vôi Tên khác: Củ một, củ thiên đầu thống, củ ngếch, củ mối tròn, ngải

tượng [20]

Dây leo, cây lâu năm có thể dài tới 5-15m, hoặc hơn Toàn thân nhẵn, nhựa

từ thân và lá không mang màu Rễ phình to thành củ, dạng hình cầu hay bất định, kích thước lớn đường kính thân có thể lên tới 60 cm, khối lượng có thể đến 30 (-80)-170 kg [20] Lá đơn, mọc so le, mép lá nguyên, đôi khi hơi chia thùy phần ngọn lá Toàn thân và lá không có lông Cuống lá dài 5-10 cm, gốc cuống lá hơi phình lên và cong Phiến lá hình tim với gốc lá phẳng hoặc hơi lõm hình tim, ngọn

lá thuôn nhọn, mặt dưới xanh lợt Gân lá 11, xếp tỏa tròn do cuống lá đính vào 1/3 phiến lá tính từ gốc lá Cụm hoa đực dạng xim tán kép, cụm hoa càng về gốc cuống càng dài (3-12 cm) Mỗi cuống cụm hoa mang từ 5-8 tán, mỗi tán mang 8 tán cấp 2, mỗi cuống tán cấp 2 lại mang 4 tán cấp 3, kết thúc gồm 3 hoa với cuống của mỗi hoa rất ngắn (1-2 mm) Hoa đực: đài 6, rời, hình trứng hẹp (phía móng hơi thu hẹp

và hầu như không có vòi nhụy Quả hạch, hình trứng ngược dài 5-6 m, rộng 4-5

mm Vỏ quả ngoài nhẵn, lúc non màu xanh, chuyển sang màu vàng đến đỏ sẫm khi chín Hạt hình trứng ngược, cụt một đầu vỏ hạch cứng chia nhiều vạch (17-20 vạch) Giá noãn có lỗ thủng ở giữa [30]

- S hainanensis H.S.Lo et Y Tsoong

Tên thường dùng: Bình vôi [8]

Dây leo, thảo Toàn thân không lông Cành non và cuống lá có dịch màu trắng hoặc vàng nhạt Lá đơn nguyên mọc cách Cuống lá dài gần bằng phiến lá Phiến lá hình tròn dạng tam giác, dài và rộng xấp xỉ nhau từ 5-8 cm, cũng có khi đạt đến 10-16 cm Chóp lá nhọn, ngắn Gốc lá tròn bằng Gân 10-11, xuất phát từ đỉnh cuống lá Cụm hoa đực dạng tán kép, cuống cụm hoa dài 3-7 cm Cuống tán giả dài 2-4,5 cm Cuống hoa dài 1-3 mm Hoa đực: đài 6, hình thìa, xếp 2 vòng; cánh hoa 3, màu vàng cam, cao 1,5-2 mm, rộng 2-2,5 mm Cột nhị cao 1mm Cụm hoa cái dạng đầu, cuống cụm hoa dài 2,5-5 cm Hoa cái: đài 1, gần như hình trứng, dài khoảng 0,4 mm; cánh hoa 2, hình trứng rộng Vỏ quả trong có 4 hàng gai dạng móc Mỗi hàng có khoảng 20 gai Giá noãn có lỗ [8]

- S hernandifolia (Willd.) Walp

Tên đồng nghĩa: S intertexta Miers., S latifolia Miers, S hypoglauca Miers, Cissampelos discolor DC , Cissampelos hexandra Roxb., Clypea hernandifolia W.,

11

Cissampelos harnadifolia Will [8], [35] Tên thường dùng: Dây mối [5], [6]; Xạ chen [8] Tên khác: Lõi tiền

Dây leo, thân nhỏ, nhẵn hay hơi có lông Không có rễ củ Lá mọc so le, hình

ba cạnh, gốc cụt, đầu hơi nhọn Gân 10, hình chân vịt từ đỉnh của cuống; cuống nhẵn hay hơi có lông, đính ở cách mép lá khoảng 2 cm Hoa mọc thành tán kép, các tán con dày đặc Hoa đực đài 6, có nhú ở mặt lưng hình bầu dục; cánh hoa 2-3, ngắn hơn lá đài 2-3 lần, nhẵn Nhị đính thành một đĩa có cuống, bao phấn 6 Lá noãn 1-2, hình trứng, núm nhụy 3-5, xếp thành vòng ở đỉnh bầu Quả chín màu đỏ tươi, hình

thấu kính Hạt có 9-10 đường nổi, 4 hàng u [8]

- S japonica (Thunb.) Miers

Tên đồng nghĩa: Menispernum japonicum Thunb [14], [20], Cissampelos harnadifolia Willd., Clypea discolor Blume, S hernandifolia (Willd.) Walp [20] Tên thường dùng: Dây lõi tiền [5], Thiên kim đằng [20] Tên khác: Lõi tiền, dây

mối, dây lõi tiền [20]

Dây leo không lông, thân mảnh Không có rễ củ [20] Lá có phiến hình lọng, xoan rộng, đầu tù, mặt trên nhẵn, mặt dưới không mốc, không lông, gân gốc 6-7 tỏa hình chân vịt, cuống dài 4-12 cm Cụm hoa tán kép xuất hiện trên thân có lá Cuống cụm hoa và cuống hoa không lông Tán hoa hình cầu cuống dài 2,5-4 cm; hoa đực: đài 6-8, không lông; cánh hoa 3-4 Hoa cái: lá đài 3-4; cánh hoa 3-4; lá noãn 1, đầu nhụy chẻ 3-5 Quả hạch tròn to 6-8 mm, màu đỏ [6] Hạt hình móng ngựa, có 4 dãy gai chạy dọc theo chiều lưng bụng, hai gờ phía ngoài rộng và có núm dạng móc, 2

gờ phía trong với các núm thường nhỏ hơn [20]

- S kuinanensis H.S.Lo et M.Yang

Tên thường dùng: Bình vôi

Dây leo dài Bề mặt củ có nhiều nốt sần Toàn cây không lông Lá có cuống, phiến lá gần hình tròn dạng tam giác Ngọn lá nhọn sắc, gốc lá thay đổi từ tù đến gần bằng, ít khi hơi lõm nông và rộng Gân chính 9-10 chiếc, xếp dạng chân vịt, hệ gân phụ mạng rõ Cụm hoa đực xim tán kép, mọc ở nách lá hoặc trên chồi nách ngắn, mập, không có lá Đỉnh cuống cụm hoa có 6-7 cuống tán giả (xim tán) Gốc mỗi cuống tán có 1 lá bắc hình mác nhỏ dạng vạch Mỗi tán giả có 5-6 xim nhỏ

12

Mỗi xim nhỏ có 5-6 hoa Hoa đực nhỏ có cuống ngắn 0,5 mm; đài 6, xếp 2 vòng, 3

lá đài vòng ngoài hình mác đảo hẹp, dài khoảng 1 mm, rộng 0,3 mm, 3 lá đài vòng trong hình thìa dài khoảng 1,5 mm, rộng 0,5 mm; cánh hoa 3, hình quạt gần tròn, cong, lõm đều, cao khoảng 0,8-1 mm, rộng 1-1,5 mm, phía trong gốc cánh hoa có 2 tuyến Nhị đính thành cột ngắn Bao phấn liền thành đĩa nứt ngang Hoa cái gần dạng đầu, có cuống dạng sợi nhỏ Đỉnh cuống cụm hoa có khoảng 6-7 xim nhỏ Ở gốc mỗi xim nhỏ có 1 lá bắc dạng gai nhỏ mềm Mỗi xim có 6 hoa Hoa cái nhỏ gần như không cuống; đài 1, hình trứng ngược cao 1-1,2 mm, rộng 0,5-0,7 mm; cánh hoa 2, hình tròn cong dạng vỏ hến, đường kính 1,5 mm Bầu hình trứng, đường kính 4-5 mm, núm nhụy có 5 thùy, dạng gai, ngả ra phía ngoài Quả hạch hình trứng đảo, khi chín màu hồng, khó nhìn thấy cuống quả Vỏ quả trong hình trứng đảo dài 5,5-6,5 mm, rộng 5,5 mm Trên lưng có 2 hàng vân ngang dạng trụ, hai đầu trụ tù

tròn, tạo thành 4 hàng vân hạt trên lưng vỏ quả trong Giá noãn có lỗ [31]

biển, củ bình vôi, củ một, bình vôi trắng [20]

Rễ phình thành củ to Dây leo cao 2m, có khi dài hơn Thân hình trụ mảnh, xoắn có rãnh nhẵn Ngọn non có nhiều chấm màu tím hồng Lá hình khiên nhỏ, đường kính 2-3,5 cm, rất nhẵn, mặt dưới nhạt màu hơn; gân 9, toả tia không đều nhau, các gân con thành mạng ít dày đặc, cuống mảnh dài 10-25 mm, rất nhẵn [23] Cụm hoa tán đơn mang khoảng 10 hoa, cuống hoa chung dài 10-25 mm, cuống hoa 1-2 mm, rồi dài đến 4 mm ở dưới quả Hoa đực: đài 6 Hoa cái: đài 1, cánh hoa 2

Quả tròn dẹp, dài 7 mm đỏ, hạt hình móng ngựa, có sóng theo tia [6]

- S sinica Diels

Tên đồng nghĩa: S rotunda Lour [8] Tên thường dùng: Bình vôi [7], bình vôi tán ngắn [6], bình vôi trung quốc [20] Tên khác: Củ một Trung quốc, dây lõi

tiền bắc, bình vôi tán ngắn [20]

Dây leo cuốn, thân có rãnh dọc [6] Rễ củ to, mọc đơn độc hoặc thành đám

Lá có phiến hình lọng, không lông, mặt dưới màu nhạt, cuống dài đến 30 cm Cụm

Tên thường dùng: Phấn phòng kỷ [5] Tên khác: Củ dòm, củ gà ấp [5]

Dây leo sống nhiều năm có rễ củ nằm ngang mặt đất, thuôn dài hơn củ bình vôi, hình giống tư thế con gà mái đang ấp trứng, khi cắt ngang có màu vàng rõ hơn,

ít xơ hơn dường kính tới 6 cm Thân mềm có thể dài tới 2,5-4 m Vỏ thân màu xanh nhạt, gốc hơi đỏ Lá mọc so le hình khiên, dài 4-6 cm, rộng 4,5-6 cm, gốc lá hình tim, ngọn lá nhọn, mép nguyên, hai mặt lá đều có lông mềm, toàn màu lục mặt dưới màu tro Hoa nhỏ mọc thành tán đơn, khác gốc, hoa đực: đài 4, cánh hoa 4, nhị 4 Hoa cái có bao hoa nhỏ như hoa đực, lá noãn 1 Quả hạch hình cầu, hơi dẹt, khi chín màu đỏ

- S venosa (Bl.) Spreng

Tên đồng nghĩa: Clypea venosa Bl [14], [20] Tên thường dùng: Bình vôi đỏ [20] Tên khác: Lõi tiền đỏ [20]

Dây leo có củ, mủ đỏ Rễ củ to trồi lên mặt đất, đường kính có thể lên tới 40

cm Thân màu rơm đo đỏ, không lông, nhẵn, lúc khô màu lục Lá mọc cách, phiến

lá hình trứng rộng tam giác, kích thước 6-11(-19) x 12 (-20) cm, gốc lá lõm hình tim, ngọn lá nhọn hay tù, mép lá nguyên hoặc hơi chia thùy [20] Gân đỏ, cuống 6-8

cm Phát hoa ở nách lá, mang vài tán dày Hoa đực: đài 6, cánh hoa 3 Hoa cái có cuống; đài 1, màu cam; cánh hoa 2 [14] Quả hạch hình gần trứng, dẹp nhỏ Hạt hình trứng bầu, dẹt, dọc chiều lưng bụng có 4 hàng gai, mỗi hàng có 12-20 gai nhỏ

[20]

- S viridiflavens H.S.Lo et M Yang

Tên thường dùng: Bình vôi

Thân leo, hơi hóa gỗ Phiến lá tròn dạng tam giác, dài rộng từ 8-15 cm, hiếm khi đạt đến 20 cm Chóp lá nhọn, ngắn hoặc hơi tù Gốc lá gần bằng, tròn hoặc hơi lõm Mép lá nguyên hay có gợn sóng Hai mặt lá không có lông Cuống lá gần bằng hoặc dài hơn phiến lá, khi khô màu vàng [9] Cụm hoa đực dạng xim tán kép, ngắn

15

thường mọc sớm ở thân già không có lá hoặc các cành nhỏ, sau đó mới ra hoa ở phần ngọn thân Cuống cụm hoa nhỏ dài 2,5-5 cm, ở đỉnh mang 6-8 xim tán, tạo thành tán kép Hoa đực nhỏ, có cuống dài khoảng 2 mm Đài 6, màu lục nhạt, xếp 2 vòng; 3 lá đài vòng ngoài dạng mác đảo đầu hơi tù cong dạng thìa, dài gần 1 mm; 3

lá đài vòng trong to hơn, dài, rộng khoảng 1 mm, phần đỉnh rộng, phần gốc thót lại Cánh hoa 3, nhỏ hơn lá đài, màu hồng cam hình quạt tròn, ở phần trên 2 mép cong vào phía trong sát phần bụng cánh hoa và dày lên thành 2 thể tuyến dạng đệm ở phần giữa cánh hoa Nhị 6, dính thành cột cao 1mm; bao phấn 6, hàn liền thành đĩa tròn, có vành trắng ở ngoài, đường kính 0,6 mm [11]

1.1.5 Tình hình nghiên cứu về thực vật của chi Stephania Lour ở Việt Nam

Theo các tài liệu tham khảo trong nước chi Stephania Lour có khoảng 17

loài, các loài bình vôi thường có đặc điểm hình thái khá giống nhau Ở Việt Nam đã

có một số nghiên cứu về thực vật của chi này tuy nhiên các nghiên cứu này mới chỉ tập trung ở một số loài, hầu như chưa có hình ảnh màu và mô tả cơ quan sinh sản đầy đủ thậm chí có loài mới chỉ được mô tả mà chưa xác định được tên do chưa thu được hoa Theo Thực vật chí Thái Lan [33] và Thực vật chí Trung Quốc [36], [45] thì các đặc điểm cơ quan sinh sản là tiêu chí quan trọng nhất để xác định tên khoa

học các loài thuộc chi Stephania Lour Các loài đã được nghiên cứu về đặc điểm

thực vật trong chi Stephania Lour ở Việt Nam được trình bày ở Bảng 1.2

Bảng 1.2 Tổng hợp các nghiên cứu về đặc điểm thực vật các loài thuộc chi

Stephania Lour ở Việt Nam

STT Tên loài

Đã có phân tích bằng hình ảnh màu

mô tả cơ quan sinh

16

STT Tên loài

Đã có phân tích bằng hình ảnh màu

mô tả cơ quan sinh

Trong cả chuỗi ADN nhân của tế bào thực vật, khu vực được nghiên cứu nhiều nhất là vùng ADN ribosom 18S-26S và vùng phiên mã nội (Internal Transcribed Spacer – ITS) với nhiều đoạn lặp về trình tự nucleotide Vùng phiên mã nội ITS của ADN ribosom (ITS-ADNr) được sử dụng phổ biến trong các nghiên

17

cứu phân loại loài của thực vật Vùng ITS có 3 phần: ITS1, 5.8S và ITS2 (Hình 1.1) với kích thước thay đổi từ 500 đến 700bp [25]

Hình 1.1 Cấu trúc của vùng ADN ribosom ITS

Trình tự nucleotide vùng ITS đã được nghiên cứu nhiều và số lượng các trình

tự nucleotide của vùng này đã được công bố trong ngân hàng gen quốc tế khá phong phú, thuận lợi cho phân tích so sánh Vùng ITS có ưu điểm là: Vùng ITS có độ lặp lại cao trong ADN nhân của thực vật, sản phẩm PCR của ADN nhân có thể sử dụng cho thông tin nghiên cứu phát sinh loài của nhiều loài và vùng ITS có kích thước

nhỏ nên dễ dàng khuếch đại [25]

1.2.2 Xác định trình tự ADN

Phương pháp giải trình tự gen là phương pháp xác định vị trí sắp xếp các

nucleotid trong phân tử ADN [24]

1.2.2.1 Nguyên tắc

Dựa trên 1 trong 2 nguyên tắc sau:

- Nguyên tắc hóa học: Dựa vào các phản ứng hóa học, sử dụng hóa chất phân giải đặc hiệu phân tử ADN, tạo thành một tập hợp nhiều phân đoạn có kích thước

19

1.2.2.3 Các bước của phương pháp xác định trình tự gen [12]

Các bước của phương pháp xác định trình tự gen được tóm tắt như sau:

- Thực hiện phản ứng PCR ngoài các thành phần thông thường còn bổ sung bốn loại dideoxynucleotit: ddATP, ddCTP, ddGTP và ddTTP đã đánh dấu bằng thuốc nhuộm huỳnh quang

- Điện di sản phẩm PCR trên gel polyacrylamid

- Dùng tia laze quét để phát hiện dideoxynucleotide đánh dấu

- Xử lý kết quả bằng các chương trình phần mềm máy tính

1.2.3 Tình hình nghiên cứu về di truyền chi Stephania Lour trên thế giới

Trong nhiều năm trở lại đây, kỹ thuật di truyền đã được áp dụng rộng rãi

trong nghiên cứu trên thực vật, cũng đã có một số nghiên cứu trên chi Stephania

Lour Năm 2006, ZuoYan và cộng sự đã thực hiện nghiên cứu đa dạng di truyền

của loài S kwangsiensis H.S.Lo bằng các chỉ thị ISSR và RAPD Nghiên cứu được

tiến hành với mục tiêu góp phần bảo vệ và nhân rộng nguồn tài nguyên này trước tình trạng nguồn dự trữ giảm đáng kể do sự tác động của con người [43] Một

nghiên cứu khác về đa dạng di truyền và cấu trúc gen của 10 quần thể S yunnanensis và ba quần thể S epigaea thu thập ở tỉnh Vân Nam, Trung Quốc bằng

chỉ thị DALP (Direct amplification of length polymorphism – khuếch đại trực tiếp

độ dài đa hình) đã được Ma YS, Yu H, và các cộng sự tiến hành Mục đích của nghiên cứu là cung cấp các bằng chứng về di truyền để có các kế hoạch bảo vệ và

khai thác hợp lý các loài Stephania Lour [39] Ngoài ra, chỉ thị phân tử RAPD cũng

được Vijayan Deepu và cộng sự dùng để xác định ba dược liệu làm thuốc Ayurveda

ở Ấn Độ Trong đó, Cissampelos pereira (Menispermaceae) là dược liệu chính

được sử dụng điều trị các bệnh như đau bụng, sốt và bệnh ngoài da Ngoài ra, các

vùng khác nhau còn sử dụng hai loài khác cùng họ Cyclea peltata và S japonica

Nghiên cứu sử dụng hai mươi mồi ngẫu nhiên, cho tỉ lệ đa hình cao (95,68%) Tỉ lệ này giúp xác định được dược liệu chính của nguyên liệu, đảm bảo chất lượng thuốc [42]

20

1.2.4 Tình hình nghiên cứu về di truyền chi Stephania Lour ở Việt Nam

Việt Nam đã có nhiều nghiên cứu chi Stephania Lour được tiến hành từ lâu

và gần đây cũng đã có nhiều nghiên cứu được công bố nhưng chủ yếu là các nghiên cứu về thực vật, hóa học và các tác dụng sinh học Tháng 12 năm 2000, nhóm tác giả thuộc Viện Khoa học công nghệ Việt Nam đã tiến hành nghiên cứu giải trình tự

gen của loài S longa Lour [46] và đã được công bố trên ngân hàng gen thế giới

Năm 2000 Nguyễn Tiến Vững [30] đã tiến hành định lượng rotundin trong một số loài bình vôi bằng phương pháp đo mật độ quang Hàm lượng rotundin trong

S glabra (Roxb.) Mier là 0,59% và S kuinanensis H.S Lo et M Yang là 3,06%

(Bảng 1.3) gồm các bước:

- Chiết alcaloid toàn phần từ bình vôi

- Tiến hành sắc ký lớp mỏng hệ Cloroform – Methanol (9:1) đối với mẫu thử, chuẩn rotundin và mẫu trắng

- Xác định vết có hệ số Rf tương ứng với rotundin chuẩn ở bước sóng 366nm, cạo vết và phản hấp phụ bằng Ethanol

- Xác định mật độ quang của mẫu thử, mẫu chuẩn, mẫu trắng tại bước sóng

289 nm

- Tính % rotundin có trong dược liệu

22

Năm 2008, Mai Thị Hằng [13] đã xây dựng phương pháp định lượng nhanh rotundin trong viên Sen vông - R bằng phương pháp đo diện tích vết Tóm tắt các bước như sau :

- Chiết alcaloid toàn phần từ củ bình vôi

- Tiến hành sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi Chloroform: Aceton:

Diethylamin (10:10:2) song song với chuẩn rotundin ở nồng độ phù hợp

- Phun thuốc thử hiện màu Dragendoff lên bản mỏng

- Bản mỏng sau khi hiện màu được đưa lên máy quét ảnh để thu được hình ảnh các vết, đo diện tích (độ rộng và chiều cao) vết bằng phần mềm photoshop

- Lập tương quan giữa diện tích vết và logarit nồng độ mẫu bằng phần mềm excel

- Nồng độ mẫu thử được tính theo công thức:

(Với Cx , Co lần lượt là nồng độ của mẫu thử và mẫu chuẩn; Vx, Vo lần lượt là tích độ rộng và chiều cao của các vết)

1 S pierrei Diels 0,21 Tây Nguyên [1]

2 S cepharantha Hay 0,29 Hà Sơn Bình [1]

3 S dielsiana Y C Wu 0,41 [15]

4 S glabra (Roxb.) Mier 0,59 [30]

23

STT

(%) rotundin trong TLTK

5 S cambodica Gagnep 0,62 Lâm Đồng [1]

24

2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị

2.1.1 Nguyên liệu

Stephania Lour được thu

hái tại nơi sống tự nhiên đem về trồng tại 03 vườn lưu mẫu là Vườn Thực Vật – Đại học Dược Hà Nội (VTV), Vườn Bắc Giang (BG) và vườn Ba Vì (BV) từ năm 2008 Khi tiến hành nghiên cứu, đề tài đã thu mẫu tại các vườn lưu mẫu, mỗi loài được thu thập ở 02 địa điểm khác nhau, một mẫu thu tại Vườn Thực vật, mẫu còn lại thu tại vườn Bắc Giang hoặc Ba Vì (bảng 2.1)

Bảng 2.1 Các mẫu nghiên cứu

STT Ký hiệu Nơi sống tự nhiên Nơi trồng lưu mẫu Mã số tiêu bản (*)

(*)Giấy chứng nhận mẫu lưu tiêu bản lưu ở phụ lục 3

- Mẫu để nghiên cứu trình tự ADN: mẫu lá non sau khi thu thập được rửa sạch, thấm khô nước bảo quản ở -40C

- Mẫu để nghiên cứu đặc điểm hình thái và làm tiêu bản mẫu khô: mẫu cây tươi mang lá, hoa (cây đực và cây cái)

sấy khô, tán nhỏ Mẫu để định lượng rotundin được thu hái vào tháng 8 năm 2013

Thiết bị nghiên cứu đa dạng di truyền

- Máy PCR: Eppendorf MasterCycler Pro – S

- điều nhiệt (Memmert)

- Máy điện di ngang Eppendoff Midi HU 13

- Hệ thống soi và chụp ảnh bản điện di: Photo Doc-it Imaging system LM-20

- Máy lắc rung Vortex, máy khuấy từ gia nhiệt IKA

- Cột QIAquick

2.1.2.2 Dung môi, hóa chất

- Một số hóa chất thông dụng dùng trong nghiên cứu sinh học phân tử của các hãng Sigma, Pharmacia, Merck, như Tris-bazơ, agarose, isopropanol, Ethanol, chloroform, isoamylalcohol, CH3COONa, NaCl, EDTA, TEA, Đệm QG

- Các hóa chất cho phản ứng PCR: bốn loại deoxynucleotit triphosphat (dNTPs) của Sigma, Taq-ADN polymerase của Fermentas

- Mồi ITS4, ITS5 cung cấp bởi hãng Bioneer

26

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Phương pháp nghiên cứu

[21], [27], giám định tên khoa học bằng phương pháp So sánh hình thái dựa vào các tài liệu Cây cỏ Việt Nam [14], Từ điển Thực vật thông dụng [6], Từ điển cây thuốc Việt Nam [5], Thực vật chí tổng quát Đông Dương (Flora Générale de l’Indochine) [44], Thực vât chí Trung Quốc [36], [45], Thực vật chí Thái Lan [33] và các mẫu tiêu bản lưu tại Phòng tiêu bản trường Đại học Dược

Hà Nội (HNIP)

-o

2.2.2 Phương pháp n

2.2.2.1 Phương pháp tách chiết ADN

Nghiên cứu này lựa chọn phương pháp tách bằng Kit Qiagen để tiến hành

Quy trình:

- Nghiền mẫu trong nitơ lỏng bằng cối chày

- Chuyển mẫu đã nghiền vào ống eppendorf 1,5mL

- Thêm 300 L dung dịch phân giải tế bào

- Ly tâm với tốc độ 12.000 vòng/ phút trong 5 phút

- Chuyển dịch trong sang ống eppendoff 1,5 mL có chứa sẵn 300 L isopropanol Lắc vortex 10 giây

27

- Ly tâm với tốc độ 12.000 vòng/ phút trong 5 phút (các vi hạt ADN sẽ tạo thành và lắng xuống)

- Loại bỏ dịch nổi, làm khô ống bằng giấy thấm sạch

- Thêm 500 L ethanol 700 và lắc đảo vài lần để rửa sạch hạt ADN

- Ly tâm với tốc độ 12.000 vòng/ phút trong 5 phút Đổ từ từ dịch ethanol

- Làm khô trong không khí ở nhiệt độ phòng trong 15 phút

- Thêm 100 L dung dịch ADN hydrat hóa

- Ủ mẫu ở 650 C trong 1h

Bảo quản ADN ở -200 C đến -800 C

2.2.2.2 Phương pháp nhân gen bằng kỹ thuật PCR

Muốn khuếch đại một đoạn gen nào đó bằng kỹ thuật PCR cần phải thiết lập một phản ứng gồm: ADN khuôn, dNTPs đã được hoạt hoá, enzym Taq- polymerase chịu nhiệt và mồi ITS đặc hiệu [10] Thành phần của hỗn hợp phản ứng PCR bao gồm:

Bảng 2.2 Tóm tắt chu trình nhiệt của phản ứng PCR

Bước Phản ứng Nhiệt độ ( o C) Thời gian Chu kỳ

28

2.2.2.3 Phương pháp điện di trên gel agarose

Phương pháp điện di trên gel agarose để phát hiện ADN gồm các bước như sau [10]:

- Cân 0,4g agarose cho vào 40 ml TAE 1X, đun đến sôi để agarose tan hoàn toàn Để nguội 45 - 500C bổ sung 2,5µl Ethidium Bromide (EtBr), đổ vào khuôn gel

đã được chuẩn bị sẵn Sau 30 - 60 phút, khi gel đã nguội và đông cứng thì chuyển khay chứa bản gel vào máy điện di và cho đệm chạy TAE 1X vào buồng điện di sao cho đệm ngập bản gel khoảng 0,5 - 1 cm

- Tra mẫu: Sản phẩm PCR được trộn với 10µl loading dye và tra vào các giếng trên gel

- Chạy điện di: Sau khi tra mẫu điện di xong, máy điện di được kết nối với bộ nguồn Đặt 50V, 90mA

- Quan sát: gel được soi dưới đèn tử ngoại, ADN sẽ được phát sáng nhờ liên kết với EtBr

- Chụp ảnh gel

2.2.2.4 Phương pháp thôi gel theo kit Qiagen

Để tinh sạch ADN tiến hành thôi gel bằng kit Qiagen theo các bước:

- Cắt lấy đoạn ADN mong muốn từ gel agarose, cho đoạn gel vừa cắt vào ống eppendorf 2ml

- Bổ sung đệm QG theo tỷ lệ 3 thể tích QG : 1 thể tích gel (100 mg ~100 μl)

- Ủ ở nhiệt độ 50°C trong khoảng 10 phút cho đến khi gel tan hoàn toàn

- Sau khi gel tan hoàn toàn, kiểm tra màu của dung dịch phải là màu vàng, nếu màu của dung dịch là màu cam hoặc màu tím xanh thì phải bổ sung 10 μl Natri acetate 3M, pH 5

- Cho dung dịch mẫu đã hoà tan ở trên vào cột QIAquick và ly tâm tốc độ 13.000 vòng trong 1 phút

- Bổ sung 500 μl đệm QG vào cột QIAquick và ly tâm tốc độ 13.000 vòng trong 1 phút để loại hết agarose dư thừa

29

- Bổ sung 750 μl đệm PE vào cột QIAquick, để cột thẳng đứng 5 phút sau đó

ly tâm tốc độ 13.000 vòng trong 1 phút

- Chuyển cột QIAquick sang ống microcentrifuge 1,5ml sạch

- Để hoà tan ADN, bổ sung 30 μl nước (pH 7 – 8,5) vào giữa màng của cột QIAquick và ly tâm tốc độ 13.000 vòng trong 1 phút, thu lượng ADN tinh sạch

2.2.2.5 Phương pháp xác định trình tự acid nucleic

Sau khi tinh sạch sản phẩm PCR, trình tự ADN được xác định theo phương pháp tổng hợp của Sanger và cộng sự [10] với bộ Kit xác định trình tự BigDye Terminator 3.1 và máy đọc trình tự ABI PRISM 3700 DNA Analyzer (Applied Biotech) tại công ty Macrogen (Hàn Quốc) (http://www.macrogen.com/eng/)

2.2.2.6 Phương pháp phân tích số liệu

Trình tự ADN thu được tổng hợp, phân tích so sánh với nhau trên phần mềm MEGA6 và so sánh với trình tự ADN đã công bố trên ngân hàng gen GenBank sử dụng công cụ Blast (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)

2.2

Trong 06 mẫu nghiên cứu, loài B6 không có củ và loài B16 sau khi định tính sơ bộ không có rotundin nên đề tài chỉ tiến hành định lượng hàm lượng rotundin trong 04 loài còn lại

Quy trình tiến hành định lượng rotundin theo chuyên luận trong Dược điển Việt Nam IV năm 2009 [3]

Pha động: Hỗn hợp dung dịch KH2PO4 (0,05M) 62,5 ml, Acetonitril 37,5

ml, Trimethylamin 0,5 ml Điều chỉnh pH pha động đến 4,5 bằng dung dịch acid phosphoric đặc Lọc qua màng lọc 0,45 µm, lắc siêu âm để loại hết bọt khí

Hòa tan 0,0556 g rotundin chuẩn trong pha động để

thu được dung dịch có nồng độ 0,0556 mg/ ml

Ch

2SO4

- Tiêm mẫu chuẩn, đánh giá độ ổn định và độ thích hợp của hệ thống dựa vào

hệ số đối xứng, số đĩa lý thuyết, độ lặp lại của các lần tiêm mẫu

Yêu cầu:

+ Hệ số đối xứng từ (T) 0,8 ≤ T ≤ 1,5

+ Số đĩa lý thuyết (H) ≥ 3000

+ Giá trị RSD của các lần tiêm chuẩn ≤ 2,0%

- Tiêm dung dịch thử Dựa vào diện tích (hay chiều cao) pic thu được của dung dịch thử, dung dịch chuẩn và nồng độ rotundin (C21H25NO4) của dung dịch chuẩn, tính hàm lượng rotundin (C21H25NO4) trong dược liệu

+ Công thức tính hàm lượng rotundin:

Trong đó: C%: hàm lượng rotundin trong mẫu thử (%)

Cc : nồng độ của dung dịch chuẩn (mg/ml)

S : diện tích pic của mẫu thử

Sc : diện tích pic của mẫu chuẩn

31

f : hệ số pha loãng của mẫu thử

m : khối lượng của mẫu thử (g)

h : độ ẩm của mẫu thử (%)

+ Mỗi mẫu nghiên cứu được định lượng 03 lần sau đó lấy giá trị trung bình của 03

lần định lượng.