Nghiên cứu đặc điểm hình thái thực vật, trình tự ADN và hàm lượng rotundin trong một số loài stephania lour ở việt nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THU HẰNG NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI THỰC VẬT, TRÌNH TỰ ADN VÀ HÀM LƯỢNG ROTUNDIN TRONG MỘT SỐ LOÀI STEPHANIA LOUR. Ở VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THU HẰNG NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI THỰC VẬT, TRÌNH TỰ ADN VÀ HÀM LƯỢNG ROTUNDIN TRONG MỘT SỐ LOÀI STEPHANIA LOUR. Ở VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH DƯỢC LIỆU – DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN MÃ SỐ: 60720406 Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Quốc Huy HÀ NỘI 2014 Lời cảm ơn Trong quá trình học tập và thực hiện luận văn, tôi thường xuyên nhận được sự ủng hộ, tạo điều kiện của Đảng ủy, Ban giám hiệu Trường Đại học Dược Hà Nội, Phòng Đào tạo sau đại học và Bộ môn Thực vật nơi tôi đang công tác và học tập. Hoàn thành luận văn này, trước hết tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Quốc Huy và ThS. Phạm Hà Thanh Tùng là những người Thầy đã chỉ bảo tận tình, trực tiếp hướng dẫn và nâng đỡ tôi rất nhiều trong thời gian qua. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới Tập thể bộ môn Thực vật - Trường Đại học Dược Hà Nội đã nhiệt tình giúp đỡ, chia sẻ và hỗ trợ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và công tác. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô, anh chị em kỹ thuật viên bộ môn Dược liệu, bộ môn Dược học cổ truyền – Trường Đại học Dược Hà Nội đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong thời gian học tập tại bộ môn. Tôi xin cảm ơn SV. Quách Thị Thúy Nga, SV. Lương Thị Lan, ThS. Hoàng Văn Thủy cùng “nhóm nghiên cứu bình vôi” đã hỗ trợ tôi rất nhiều trong suốt quá trình thực hiện nghiên cứu này. Tôi xin chân thành cảm ơn KS. Nguyễn Trường Khoa và các thầy cô bộ môn Kỹ thuật di truyền – Viện Di truyền nông nghiệp. Cuối cùng, tôi vô cùng cảm ơn chồng và hai con yêu quí, những người thân, bạn bè, các em sinh viên đã luôn bên cạnh chia sẻ, động viên tôi vượt qua mọi khó khăn để hoàn thành khóa học này. Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn tất cả sự hướng dẫn, giúp đỡ và cộng tác quý báu này. Hà Nội, ngày 25 tháng 08 năm 2014 Nguyễn Thu Hằng MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 3 1.1. Chi Stephania Lour. 3 1.1.1. Vị trí phân loại 3 1.1.2. Đặc điểm của chi Stephania Lour. 3 1.1.3. Phân bố 4 1.1.4. Đặc điểm thực vật và phân bố các loài thuộc chi Stephania Lour. ở Việt Nam 7 1.1.5. Tình hình nghiên cứu về thực vật của chi Stephania Lour. ở Việt Nam 15 1.2. Acid deoxyribose nucleotide (ADN) và xác định trình tự ADN 16 1.2.1. Phân tử ADN 16 1.2.2. Xác định trình tự ADN 17 1.2.3. Tình hình nghiên cứu về di truyền chi Stephania Lour. trên thế giới 19 1.2.4. Tình hình nghiên cứu về di truyền chi Stephania Lour. ở Việt Nam 20 1.3. Rotundin 20 20 21 Stephania Nam 22 24 2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị 24 2.1.1. Nguyên liệu 24 25 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.2.1. Phương pháp nghiên cứu 26 2.2.2. Phương pháp n 26 2.2.3. Phương pháp đ 29 31 3.1. Đặc điểm hình thái thực vật và giám định tên khoa học của một số loài trong chi Stephania Lour. ở Việt Nam 32 3.1.1. Loài B1 và B2 32 3.1.2. Loài B5 34 3.1.3. Loài B6 37 3.1.4. Loài B10 40 3.2. Xác định trình tự ADN các loài nghiên cứu 46 3.2.1. Kết quả tách chiết ADN 46 3.2.2. Kết quả khuếch đại vùng ITS1 – 5,8S – ITS2 46 3.2.3. Kết quả giải trình tự vùng ITS-rDNA 46 3.2.4. So sánh trình tự gen ITS giữa các mẫu nghiên cứu 51 3.2.5. So sánh trình tự gen các mẫu nghiên cứu với các trình tự đã công bố trên Genbank 52 3.2.6. So sánh trình tự gen giữa các mẫu nghiên cứu 52 3.3. Định lƣợng hàm lƣợng rotundin trong các loài Stephania Lour. nghiên cứu 54 3.3.1. Đánh giá độ thích hợp và độ ổn định của hệ thống 54 3.3.2. Kết quả phân tích định lượng 55 CHƢƠNG 4. BÀN LUẬN 56 4.1. Về đặc điểm hình thái 56 4.2. Về đặc điểm trình tự ADN 58 4.3. Về hàm lƣợng rotundin trong các mẫu nghiên cứu 59 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 60 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT STT Chữ viết tắt Chú giải 1 ADN Acid Deoxyribose Nucleotid 2 ADNr ADNribosom 3 BLAST Basic Local Alignmet Search Tool 4 bp Base pair 5 CTAB Cethyltrimethylamonium bromide 6 DALP Direct amplification of length polymorphism 7 dATP 2’ – desoxyadenosine – 5’ – triphosphate 8 dCTP 2’ – desoxycytidine – 5’ – triphosphate 9 dGTP 2’ – desoxyguanosine – 5’ – triphosphate 10 dTTP 2’ – desoxythymidine – 5’ – triphosphate 11 dNTPs hỗn hợp gồm các nucleotide dATP, dCTP,dGTP, dTTP 12 ddATP 2’ – didesoxyadenosine – 5’ – triphosphate 13 ddCTP 2’ – didesoxycytidine – 5’ – triphosphate 14 ddGTP 2’ – didesoxyguanosine – 5’ – triphosphate 15 ddTTP 2’ – didesoxythymidine – 5’ – triphosphate 16 EDTA Ethylendiamin tetraacetic acid 17 HPLC High performance liquid chromatography 18 ISSR Inter-simple sequence repeat 19 ITS Internal Transcribed Spacer 20 PCR Polymerase Chain Reaction 21 PVP Polyvinylpyrrolidone 22 RAPD Random amplified polymorphic DNA 23 S. Stephania DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 1 Bảng 1.1. Phân bố các loài thuộc chi Stephania Lour. ở Việt Nam 5 2 Bảng 1.2. Nghiên cứu về đặc điểm thực vật các loài thuộc chi Stephania Lour. ở Việt Nam 15 3 3 rotundin Stephania 22 4 Bảng 2.1.Các mẫu nghiên cứu 24 5 Bảng 2.2. Tóm tắt chu trình nhiệt của phản ứng PCR 27 6 Bảng 3.1. Thành phần bốn loại nucleotide của các mẫu nghiên cứu 50 7 Bảng 3.2. Trình tự mẫu nghiên cứu so sánh với trình tự công bố trên Genbank 51 8 Bảng 3.3. Mức tương đồng giữa các mẫu nghiên cứu 52 9 Bảng 3.4. Đánh giá độ thích hợp và độ ổn định của hệ thống 53 10 Bảng 3.5. Kết quả định lượng L-tetrahydropalmatin trong các mẫu nghiên cứu. 54 11 Bảng 4.1. So sánh các đặc điểm khác nhau về hình thái giữa các mẫu nghiên cứu 55 DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 1 Hình 1.1. Cấu trúc của vùng ADN ribosom ITS 17 2 Hình 1.2. Công thức cấu tạo của L-tetrahydropalmatin 20 3 Hình 1.3. Sơ đồ oxy hóa của L-tetraydropalmatin 21 4 Hình 3.1. Hình vẽ loài Stephania brachyandra Diels 31 5 Hình 3.2. Hình vẽ loài Stephania dielsiana Y. C. Wu. 32 6 Hình 3.3. Hình ảnh loài Stephania kwangsiensis H. S. Lo. 34 7 Hình 3.4. Hình vẽ loài Stephania kwangsiensis H. S. Lo. 35 8 Hình 3.5. Hình ảnh loài Stephania hernandifolia (Willd.) Walp 37 9 Hình 3.6. Hình vẽ loài Stephania hernandifolia (Willd.) Walp 38 10 Hình 3.7. Hình ảnh loài Stephania venosa (Bl.) Spreng 40 11 Hình 3.8. Hình vẽ loài Stephania venosa (Bl.) Spreng 41 12 Hình 3.9. Hình ảnh loài Stephania pierrei Diels 43 13 Hình 3.10. Hình vẽ loài Stephania pierrei Diels 44 14 Hình 3.11. Băng điện di ADN tổng số của các mẫu nghiên cứu 45 15 Hình 3.12. Băng điện di sản phẩm PCR đoạn trình tự ITS1-5.8S- ITS2 của các mẫu nghiên cứu 45 16 Hình 3.13. Sơ đồ mối quan hệ di truyền giữa các mẫu nghiên cứu 53 1 Chi bình vôi (Stephania Lour.) là một chi lớn, đa dạng thuộc họ Tiết dê (Menispermaceae) với khoảng 107 loài [30], [35], [36]. Các loài thuộc chi này đã được sử dụng từ lâu trong y học truyền thống để trị các bệnh như mất ngủ, hen suyễn, lao, tăng đường huyết, ung thư, sốt … và ngày nay vẫn có vị trí quan trọng trong y dược hiện đại. Ở Việt Nam, chi Stephania Lour. có khoảng 20 loài, phân bố rộng khắp các vùng, được sử dụng nhiều trong y học truyền thống [5], [6], [8], [14]. Theo các nghiên cứu trước đây, chi Stephania Lour. là nguồn cung cấp nhiều alcaloid có hoạt tính sinh học như: rotundin, cepharanthin, tetrandrin Đặc biệt là rotundin, một trong không nhiều nguyên liệu làm thuốc quan trọng mà Việt Nam tự sản xuất được từ nguồn nguyên liệu là các loài bình vôi trong nước. Rotundin có tác dụng an thần gây ngủ, điều hòa tim, giãn cơ trơn, do đó làm giảm các cơn đau do co thắt cơ trơn… Trên thị trường có nhiều dược phẩm có tác dụng an thần chứa thành phần hoạt chất chính là rotundin như Rotundin TW3 (Công ty cổ phần Dược phẩm Trung ương 3), Stilux 60 (Traphaco), Rotunda (Công ty cổ phần Dược phẩm Trung ương 2), Là một nước đa dạng về tài nguyên cây thuốc nói chung và chi Stephania Lour. nói riêng nhưng qua khảo sát nguồn nguyên liệu rotundin sử dụng để sản xuất chỉ có một số ít công ty tự sản xuất từ củ Bình vôi còn phần lớn các công ty nhập rotundin thô từ Trung Quốc. Do đó việc tiếp tục nghiên cứu phân loại các loài thuộc chi Stephania rotundin cao là rất cần thiết. Các loài thuộc chi Stephania trong việc thực vật với các đang được ứng dụng rộng rãi. Hơn nữa, xu hướng hiện nay là tập hợp các đặc điểm về hình thái thực vật, di truyền… thành bộ dữ liệu về từng loài, phối hợp giữa các quốc gia thành ngân hàng dữ liệu trở nên rất quan trọng để xác định chính xác tên các loài. Chính vì vậy đề tài “Nghiên cứu đặc điểm hình thái 2 thực vật, trình tự ADN và hàm lƣợng rotundin trong một số loài Stephania Lour. ở Việt Nam” được thực hiện với các mục tiêu sau: - Mô tả đặc điểm hình thái thực vật và giám định tên khoa học của một số loài trong chi Stephania Lour. ở Việt Nam. - Xác định trình tự ADN của các loài Stephania Lour. nghiên cứu. - Định lượng hàm lượng rotundin trong các loài Stephania Lour. nghiên cứu. [...]... Trung Quốc [36], [45] thì các đặc điểm cơ quan sinh sản là tiêu chí quan trọng nhất để xác định tên khoa học các loài thuộc chi Stephania Lour Các loài đã được nghiên cứu về đặc điểm thực vật trong chi Stephania Lour ở Việt Nam được trình bày ở Bảng 1.2 Bảng 1.2 Tổng hợp các nghiên cứu về đặc điểm thực vật các loài thuộc chi Stephania Lour ở Việt Nam STT 1 2 3 4 5 6 Tên loài S brachyandra Diels S cambodica... chất lượng thuốc [42] 19 1.2.4 Tình hình nghiên cứu về di truyền chi Stephania Lour ở Việt Nam Việt Nam đã có nhiều nghiên cứu chi Stephania Lour được tiến hành từ lâu và gần đây cũng đã có nhiều nghiên cứu được công bố nhưng chủ yếu là các nghiên cứu về thực vật, hóa học và các tác dụng sinh học Tháng 12 năm 2000, nhóm tác giả thuộc Viện Khoa học công nghệ Việt Nam đã tiến hành nghiên cứu giải trình tự. .. có khoảng 17 loài, các loài bình vôi thường có đặc điểm hình thái khá giống nhau Ở Việt Nam đã có một số nghiên cứu về thực vật của chi này tuy nhiên các nghiên cứu này mới chỉ tập trung ở một số loài, hầu như chưa có hình ảnh màu và mô tả cơ quan sinh sản đầy đủ thậm chí có loài mới chỉ được mô tả mà chưa xác định được tên do chưa thu được hoa Theo Thực vật chí Thái Lan [33] và Thực vật chí Trung Quốc... bảo quản ở -40C - Mẫu để nghiên cứu đặc điểm hình thái và làm tiêu bản mẫu khô: mẫu cây tươi mang lá, hoa (cây đực và cây cái) - Mẫu để nghiên cứu hàm lượng rotundin: m rửa sạch thái mỏng, sấy khô, tán nhỏ Mẫu để định lượng rotundin được thu hái vào tháng 8 năm 2013 24 2.1.2 Thiết bị và dung môi hóa chấ 2.1.2.1 Thiết bị Thiết bị nghiên cứu đặc điểm thực vật - Kính lúp soi nổi - Máy ảnh kỹ thuật số IXY... Stephania Lour trên thế giới có khoảng 107 loài, phân bố ở vùng nhiệt đới, á nhiệt đới ở các nước châu Á là chủ yếu như: Lào (2 loài) , Campuchia (3 loài) , Việt Nam (14 loài) , Indonesia (17 loài) , Đông Timor (1 loài) , Myanma (5 loài) , Malaysia (10 loài) , Thái Lan (18 loài) , Philippin (8 loài) , Papua New Guinea (8 loài) , Quần đảo Solomon (1 loài) , Trung Quốc (42 loài) , Đài Loan (4 loài) , Ấn Độ (11 loài) ,... cam hình quạt tròn, ở phần trên 2 mép cong vào phía trong sát phần bụng cánh hoa và dày lên thành 2 thể tuyến dạng đệm ở phần giữa cánh hoa Nhị 6, dính thành cột cao 1mm; bao phấn 6, hàn liền thành đĩa tròn, có vành trắng ở ngoài, đường kính 0,6 mm [11] 1.1.5 Tình hình nghiên cứu về thực vật của chi Stephania Lour ở Việt Nam Theo các tài liệu tham khảo trong nước chi Stephania Lour có khoảng 17 loài, ... được trình tự trên mạch còn lại [10], [26] Trong cả chuỗi ADN nhân của tế bào thực vật, khu vực được nghiên cứu nhiều nhất là vùng ADN ribosom 18S-26S và vùng phiên mã nội (Internal Transcribed Spacer – ITS) với nhiều đoạn lặp về trình tự nucleotide Vùng phiên mã nội ITS của ADN ribosom (ITS-ADNr) được sử dụng phổ biến trong các nghiên 16 cứu phân loại loài của thực vật Vùng ITS có 3 phần: ITS1, 5.8S và. .. ITS2 (Hình 1.1) với kích thước thay đổi từ 500 đến 700bp [25] Hình 1.1 Cấu trúc của vùng ADN ribosom ITS Trình tự nucleotide vùng ITS đã được nghiên cứu nhiều và số lượng các trình tự nucleotide của vùng này đã được công bố trong ngân hàng gen quốc tế khá phong phú, thuận lợi cho phân tích so sánh Vùng ITS có ưu điểm là: Vùng ITS có độ lặp lại cao trong ADN nhân của thực vật, sản phẩm PCR của ADN nhân... cũng đã có một số nghiên cứu trên chi Stephania Lour Năm 2006, ZuoYan và cộng sự đã thực hiện nghiên cứu đa dạng di truyền của loài S kwangsiensis H.S.Lo bằng các chỉ thị ISSR và RAPD Nghiên cứu được tiến hành với mục tiêu góp phần bảo vệ và nhân rộng nguồn tài nguyên này trước tình trạng nguồn dự trữ giảm đáng kể do sự tác động của con người [43] Một nghiên cứu khác về đa dạng di truyền và cấu trúc... tin nghiên cứu phát sinh loài của nhiều loài và vùng ITS có kích thước nhỏ nên dễ dàng khuếch đại [25] 1.2.2 Xác định trình tự ADN Phương pháp giải trình tự gen là phương pháp xác định vị trí sắp xếp các nucleotid trong phân tử ADN [24] 1.2.2.1 Nguyên tắc Dựa trên 1 trong 2 nguyên tắc sau: - Nguyên tắc hóa học: Dựa vào các phản ứng hóa học, sử dụng hóa chất phân giải đặc hiệu phân tử ADN, tạo thành một . Nghiên cứu đặc điểm hình thái 2 thực vật, trình tự ADN và hàm lƣợng rotundin trong một số loài Stephania Lour. ở Việt Nam được thực hiện với các mục tiêu sau: - Mô tả đặc điểm hình thái. thái thực vật và giám định tên khoa học của một số loài trong chi Stephania Lour. ở Việt Nam. - Xác định trình tự ADN của các loài Stephania Lour. nghiên cứu. - Định lượng hàm lượng rotundin trong. DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THU HẰNG NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI THỰC VẬT, TRÌNH TỰ ADN VÀ HÀM LƯỢNG ROTUNDIN TRONG MỘT SỐ LOÀI STEPHANIA LOUR.