Phương pháp giải trình tự gen là phương pháp xác định vị trí sắp xếp các nucleotid trong phân tử ADN [24].
1.2.2.1. Nguyên tắc
Dựa trên 1 trong 2 nguyên tắc sau:
- Nguyên tắc hóa học: Dựa vào các phản ứng hóa học, sử dụng hóa chất phân giải đặc hiệu phân tử ADN, tạo thành một tập hợp nhiều phân đoạn có kích thước
18
khác nhau. Điện di các đoạn ADN này và nhận biết chúng nhờ đánh dấu phóng xạ. Dựa vào đó có thể xác định trình tự ADN.
- Nguyên tắc enzym học: dựa trên vai trò của enzyme ADN polymerase trong quá trình tổng hợp mạch bổ sung cho trình tự cần xác định. Enzyme này xúc tác gắn các deoxynucleotid theo nguyên tắc bổ sung. Nếu bổ sung thêm các dideoxynucleotide (nucleotide mất cả 2 nhóm OH ở vị trí C số 2 và 3) cùng với các deoxynucleotide thông thường thì khi ADN polymerase gặp một dideoxynucleoitde quá trình tổng hợp sẽ ngừng lại. Kết quả của quá trình tổng hợp cũng là sự hình thành một tập hợp nhiều đoạn ADN có kích thước khác nhau. Điện di các đoạn ADN này và nhận biết chúng nhờ đánh dấu phóng xạ. Dựa vào đó có thể xác định trình tự ADN [10], [12].
1.2.2.2. Các phƣơng pháp xác định trình tự gen [12]
- Phương pháp Maxam và Gilbert: là phương pháp dựa trên nguyên tắc hóa học do Maxam và Gilbert đề xuất năm 1977.
- Phương pháp Sanger hay phương pháp dideoxynucleotide dựa trên nguyên tắc enzyme của Frederick Sanger và cộng sự (1977).
- Giải trình tự ADN bằng máy tự động là phương pháp tự động hóa dựa trên nguyên tắc của phương pháp Sanger. Máy giải trình tự gen bán tự động hoặc tự động hoàn toàn được thiết kế trên nguyên tắc sử dụng dideoxynucleotide do F. Sanger và cộng sự phát minh. Tổng hợp ADN bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction). Trong quá trình tổng hợp ADN có sử dụng các mồi và các dideoxynucleotide đánh dấu huỳnh quang thay cho đánh dấu phóng xạ, mỗi loại dideoxynucleotide được đánh dấu huỳnh quang khác nhau, biểu thị các màu sắc khác nhau. Do đó có thể thực hiện giải trình tự gen trong cùng 1 phản ứng thay vì làm 4 phản ứng với 4 loại dideoxynucleotit: ddATP, ddCTP, ddGTP và ddTTP được đánh dấu phóng xạ như phương pháp Sanger. Máy thực hiện tổng hợp các mạch đơn ADN mới trên cả 2 mạch khuôn ADN đồng thời sử dụng các phần mềm tính toán trên máy tính để xử lý kết quả giúp kiểm soát được các sai sót, đảm bảo độ chính xác cao.
19
1.2.2.3. Các bƣớc của phƣơng pháp xác định trình tự gen [12]
Các bước của phương pháp xác định trình tự gen được tóm tắt như sau:
- Thực hiện phản ứng PCR ngoài các thành phần thông thường còn bổ sung bốn loại dideoxynucleotit: ddATP, ddCTP, ddGTP và ddTTP đã đánh dấu bằng thuốc nhuộm huỳnh quang.
- Điện di sản phẩm PCR trên gel polyacrylamid.
- Dùng tia laze quét để phát hiện dideoxynucleotide đánh dấu. - Xử lý kết quả bằng các chương trình phần mềm máy tính.