Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng hạ đường huyết của dây thìa canh lá to (gymnema latifolium wall ex wight)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐOÀN THỊ ÁI NGHĨA NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG HẠ ĐƯỜNG HUYẾT CỦA DÂY THÌA CANH LÁ TO GYMNEMA LATIFOLIUM WALL.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐOÀN THỊ ÁI NGHĨA

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC

VÀ TÁC DỤNG HẠ ĐƯỜNG HUYẾT CỦA

DÂY THÌA CANH LÁ TO (GYMNEMA

LATIFOLIUM WALL EX WIGHT)

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐOÀN THỊ ÁI NGHĨA

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC

VÀ TÁC DỤNG HẠ ĐƯỜNG HUYẾT CỦA

DÂY THÌA CANH LÁ TO (GYMNEMA

LATIFOLIUM WALL EX WIGHT)

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN

Em xin chân thành cảm ơn PGS.TS Trần Văn Ơn (Bộ môn Thực vật - Trường Đại học Dược Hà Nội) và TS Phùng Thanh Hương (Bộ môn Hóa

Sinh - Trường Đại học Dược Hà Nội) Thầy cô ñã luôn theo sát, cùng với thầy

cô hướng dẫn cố vấn cho em nhiều kỹ năng cần thiết ñể khắc phục các khó khăn xảy ra trong quá trình thực hiện nghiên cứu

Em xin chân thành cảm ơn ThS Hồ Việt Đức (Khoa Dược – Trường

Đại học Y Dược Huế) ñã chỉ dẫn cho em nhiều kinh nghiệm quý báu trong nghiên cứu phân lập và giải phổ xác ñịnh cấu trúc

Em xin chân thành cảm ơn các bạn sinh viên, các anh chị kỹ thuật viên

bộ môn Dược liệu (Khoa Dược – Trường Đại học Y Dược Huế), bộ môn Thực vật (Trường Đại học Dược Hà Nội), bộ môn Dược lý (Trường Đại học Dược Hà Nội) ñã nhiệt tình giúp ñỡ trong suốt quá trình em thực hiện luận văn này

Hà Nội, ngày 30 tháng 8 năm 2014

Học viên

Đoàn Thị Ái Nghĩa

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Chi Gymnemar R.Br 3

1.1.1.Đặc ñiểm thực vật và phân bố 3

1.1.2.Một số nghiên cứu về tác dụng sinh học 7

1.1.3.Một số nghiên cứu về thành phần hóa học 11

1.2 Loài dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall Ex Wight) 15

1.2.1.Đặc ñiểm thực vật và phân bố 15

1.2.2.Thành phần hóa học của loài Gymnema latifolium Wall Ex Wight 15

1.2.3.Tác dụng sinh học của loài Gymnema latifolium Wall Ex Wight 16

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Đối tượng và phương tiện nghiên cứu 17

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 17

2.1.2 Động vật thí nghiệm 17

2.1.3 Hóa chất, máy móc và thiết bị 18

2.2 Phương pháp nghiên cứu 19

2.2.1 Chiết xuất dược liệu và chiết phân ñoạn lỏng-lỏng 19

2.2.1 Nghiên cứu tác dụng hạ ñường huyết 19

2.2.2 Nghiên cứu về thành phần hóa học 22

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 24

3.1 Kết quả chiết xuất dược liệu và chiết phân ñoạn lỏng lỏng 24

3.2 Kết quả nghiên cứu về tác dụng hạ ñường huyết 26

3.3 Kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học 26

3.3.1 Quá trình phân lập 28

3.3.2 Nhận dạng cấu trúc các hợp chất phân lập ñược 33

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 40

4.1 Bàn luận về quá trình thử tác dụng hạ ñường huyết 42

4.1.1 Lựa chọn mô hình nghiên cứu 42

4.1.2 Tác dụng hạ ñường huyết của các thành phần hóa học 43

4.4 Bàn luận về quá trình nghiên cứu thành phần hóa học 45

4.4.1 Quá trình chiết xuất, phân lập 45

4.4.2 Các chất phân lập ñược 47

KẾT LUẬN 51

KIẾN NGHỊ 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

13C-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13

(Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy)

dd Double doublet

DEPT Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer

1H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

(Proton Magnetic Resonance Spectroscopy)

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Vị trí phân loại của chi Gymnema R.Br 3

Bảng 1.2 Các loài trong chi Gymnema ở Việt Nam 6

Bảng 1.3 Tóm tắt thành phần hóa học một số loài trong chi Gymnema R.Br 12

Bảng 3.1 Sự thay ñổi glucose máu của các lô chuột thí nghiệm 27

Bảng 3.2 Số liệu phổ NMR của hợp chất GLHE9 và chất tham khảo 34

Bảng 3.3 Số liệu phổ NMR của hợp chất GLHE7 và chất tham khảo 35

Bảng 3.4 Số liệu phổ NMR của hợp chất GLHE2 và chất tham khảo 38

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Dây thìa canh lá to 17

Hình 3.1 Sơ ñồ chiết xuất dược liệu và chiết phân ñoạn lỏng-lỏng 25

Hình 3.2 Sơ ñồ chiết pha rắn phân ñoạn Ethyl acetat 30

Hình 3.3 Sơ ñồ phân lập hợp chất 1 (GLHE9) và hợp chất 2 (GLHE7) từ phân ñoạn E1 31

Hình 3.4 Sơ ñồ phân lập hợp chất 3 (GLHE2) từ phân ñoạn E2 32

Hình 3.5 Cấu trúc của GLHE9 34

Hình 3.6 Cấu trúc của GLHE7 36

Hình 3.7 Cấu trúc của GLHE2 3

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Sự bùng phát của căn bệnh Đái tháo ñường trong vài năm gần ñây ñang

là mối lo ngại chung của toàn xã hội Theo thống kê của Hiệp hội Đái tháo ñường Quốc tế tính ñến năm 2013 có khoảng 382 triệu người mắc bệnh Đái tháo ñường, và con số này có xu hướng tăng lên gấp ñôi vào năm 2035 [23] Chi phí ñiều trị dành cho bệnh Đái tháo ñường ở nhóm bệnh nhân 20-79 tuổi trên thế giới tính ñến năm 2013 ñã ñạt mức 548 tỷ USD [23] Hiện nay trên thị trường các thuốc ñiều trị Đái tháo ñường có nguồn gốc tổng hợp hóa dược

và dược liệu tương ñối nhiều, tuy nhiên việc nghiên cứu các thuốc mới có nguồn gốc từ thiên nhiên vẫn ñược tiếp tục nhằm tìm kiếm các thuốc thực sự

có tác dụng hỗ trợ cho bệnh nhân trong quá trình ñiều trị kéo dài, giảm tác dụng không mong muốn, ñồng thời hạn chế chi phí ñiều trị

Chi Gymnema R.Br ñược biết ñến với loài Dây thìa canh (Gymnema

sylvestre (Retz.) R Br ex Schult) có tác dụng ñiển hình trong ñiều trị Đái tháo ñường Đã có nhiều công trình nghiên cứu cũng như các sản phẩm ñược phát triển từ loài Dây thìa canh sử dụng hỗ trợ ñiều trị Đái tháo ñường Dây

thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall ex Wight) cũng là một loài thuộc chi Gymnema R.Br Một nghiên cứu trên mô hình chuột bị gây tăng ñường

huyết thực nghiệm bằng Streptozotocin cho thấy dịch chiết ethanol của Dây thìa canh lá to có tác dụng mạnh hơn Dây thìa canh [16] Dây thìa canh lá to

là loài mới chưa ñược nghiên cứu trên thế giới Một số kết quả nghiên cứu sơ

bộ tại Việt Nam cho thấy dịch chiết ethanol của lá cây Dây thìa canh lá to có tác dụng hạ ñường huyết thực nghiệm ở cả chuột thường và chuột ñã gây tăng ñường huyết bằng Streptozotocin [9], so sánh tác dụng 4 loài thuộc chi

Gymnema R.Br thu hái tại Việt Nam cho thấy dịch chiết ethanol Dây thìa canh lá to có tác dụng mạnh hơn các loài còn lại [15] Do ñó, nếu ñược nghiên cứu ñầy ñủ và ñưa vào ứng dụng Dây thìa canh lá to có triển vọng tạo nên ñược sản phẩm có giá trị sử dụng thực tiễn và kinh tế

2

Hiện nay ở Việt Nam cũng như trên thế giới chưa có công bố nào về thành phần hóa học và tác dụng hạ ñường huyết các phân ñoạn dịch chiết của Dây thìa canh lá to Nhằm cung cấp cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo như một số chỉ tiêu cho việc tiêu chuẩn hóa dược liệu tiềm năng này, ñề tài

“Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng hạ ñường huyết của Dây

thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall ex Wight)” ñược thực hiện với

3

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Chi Gymnema R.Br

Lịch sử phân loại chi Gymnema R.Br gắn liền với lịch sử quan ñiểm

phân loại của hai họ Thiên lý (Asclepiadaceae) và họ Trúc ñào (Apocynaceae) Trong ña số các tài liệu phân loại thực vật kinh ñiển, chi

Gymnema R.Br ñược xếp trong họ Thiên lý (Asclepiadaceae) [55], [59] Tuy nhiên, theo hệ thống phân loại công bố năm 2009, Takhtajan ñã theo quan ñiểm của Hallier (1905, 1912), Stebbins (1974), Thorne (2006), Endress & Bruyns (2000) và Endress & Stevins (2001) ñể gộp Apocynaceae và

Asclepiadaceae thành một họ duy nhất, và Gymnema R.Br trở thành một chi

trong phân họ Asclepiadoideae của một họ lớn là Apocynaceae [47]

Cho ñến nay quan ñiểm này ñược thừa nhận rộng rãi trong các hệ thống phân loại quốc tế [60]

Bảng 1.1 Vị trí phân loại của chi Gymnema R.Br

Bậc phân

loại

Theo thực vật chí Trung Quốc [5], [55]

Hệ thống của Takhtajan (2009) [47]

Gymnema R.Br

Magnoliophyta Magnoliopsida Lamiidae Gentianales Apocynaceae Asclepiadoideae

Gymnema R.Br

1.1.1 Đặc ñiểm thực vật và phân bố của chi Gymnema R.Br

Các loài thuộc chi Gymnema R.Br là cây leo, không có rễ phụ trên thân

Lá mọc ñối, không nạc Cụm hoa xim, dạng tán hoặc chùm Hoa nhỏ Thùy

4

ñài nhỏ, hình trứng, ñầu tù, gốc ñài có tuyến, ít khi không có tuyến Tràng hình bánh xe, thùy tràng không gập trong nụ, tiền khai vặn phải Tràng phụ ñơn, vảy tràng phụ dính ở tràng, thường có các hàng lông xếp dọc theo tràng Chỉ nhị dính nhau, bao phấn 2 ô, có phần phụ ở ñỉnh, hạt phấn dính thành khối phấn và có sáp bao bên ngoài vách khối phấn, khối phấn không có mỏm ở ñỉnh, cơ quan truyền phấn có gót ñính và 2 chuôi, khối phấn hướng lên, chỉ có một khối phấn trong mỗi ô phấn Đầu nhụy phình lên hình trứng, ñỉnh bầu không thót lại thành dạng vòi nhụy Cột nhị - nhụy hình ống nhọn ñầu [17], [55]

Phân bố của chi Gymnema R.Br khá rộng, ở vùng Tây châu Phi ñến

Australia, châu Á [10]

1.1.1.1 Các loài thuộc chi Gymnema R.Br

Theo dự án “The plant list” thực hiện bởi Royal Botanic Gardens, Kew

và Missouri Botanical Garden khởi ñộng từ năm 2010 ñã xác ñịnh ñược 120

loài thuộc chi Gymnema R.Br thu thập từ các cơ sở dữ liệu khác nhau trên thế

giới trong ñó có 52 tên khoa học ñược chấp nhận (43,3%), 50 tên ñược xác ñịnh là tên ñồng nghĩa (41,67 %), và 18 tên chưa xác ñịnh ñược chính xác thông tin (15,0 %) [60]

Dưới ñây là 52 loài thuộc chi Gymnema R.Br ñã ñược chấp nhận theo

“The plant list” [60]

Gymnema acuminatum Wall

Gymnema albidum Decne

Gymnema albiflorum Costantin

Gymnema brevifolium Benth

Gymnema calycinum Schltr

Gymnema chalmersii Schltr

Gymnema cumingii Schltr

Gymnema longiretinaculatumTsiang

Gymnema lushaiense M.A.Rahman

& Wilcock

Gymnema macrothyrsa Warb

Gymnema maingayi Hook.f

Gymnema mariae Schltr

Gymnema micradenium Benth

5

Gymnema cuspidatum (Thunb.)

Kuntze

Gymnema decaisneanum Wight

Gymnema dissitiflorum Ridl

Gymnema dunnii (Maiden & Betche)

P.I.Forst

Gymnema elegans Wight & Arn

Gymnema erianthum Decne

Gymnema foetidum Tsiang

Gymnema glabrum Wight

Gymnema griffithii Craib

Gymnema hainanense Tsiang

Gymnema hirtum Ridl

Gymnema inodorum (Lour.) Decne

Gymnema javanicum Koord

Gymnema khandalense Santapau

Gymnema kollimalayanum

A.Ramach & M.B.Viswan

Gymnema lacei Craib

Gymnema lactiferum (L.) R.Br ex

Schult

Gymnema latifolium Wall ex Wight

Gymnema littorale Blume

Gymnema molle Wall ex Wight

Gymnema montanum Hook.f

Gymnema montanum var beddomei

Hook.f

Gymnema muelleri Benth

Gymnema pachyglossum Schltr

Gymnema piperii Schltr

Gymnema pleiadenium F.Muell

Gymnema recurvifolium Blume

Gymnema rotundatum Thwaites

Gymnema rufescens Decne

Gymnema schlechterianum Warb

Gymnema spirei Costantin

Gymnema suborbiculare K.Schum

Gymnema sylvestre (Retz.) R.Br ex

Gymnema yunnanense Tsiang

1.1.1.2 Các loài thuộc chi Gymnema R.Br ở Việt Nam

Tổng hợp thông tin các tài liệu thực vật trong nước của tác giả Phạm Hoàng Hộ (2000) [10], Võ Văn Chi (2004) [6] và Trần Thế Bách (2007) [1], ñồng thời với ñịa ñiểm thu mẫu của các nghiên cứu liên quan ñến chi

Gymnema R.Br., một số loài thuộc chi Gymnema R.Br phân bố ở Việt Nam

6

sẽ ñược liệt kê trong bảng 1.2 với tên chính thức ñã ñược ñối chiếu theo hệ thống danh pháp quốc tế

Bảng 1.2 Các loài trong chi Gymnema R.Br ở Việt Nam

to

- Nam Bộ, Nha Trang, Bắc Cạn, Thái Nguyên, Hòa Bình, Vĩnh Phúc

- Rộng khắp trên ñất rừng, cạnh suối và lùm bụi

[1], [6], [10], [15], [17]

Ninh

[1], [10], [15], [17]

4 Gymnema

yunnanense

Tsiang

Lõa ti Nam Vân Kiên Giang, Kom

Tum, Gia Lai, Đăk

Lăk

[1], [15], [17]

5 Gymnema

reticulatum

(Moon) Alst )

Lõa ti mạng, Dây thìa canh gân mạng

Núi Dinh, Tuyên Quang

[1], [6], [10]

Hà Bắc, Sầm Sơn, Thanh Hóa,Quảng Trị,Quảng Ninh, Phú Yên, Vĩnh Phúc, Nam Định, Quảng Trị, Khánh Hòa, Quảng Nam

Bờ bụi, hàng rào

[1], [6], [10], [15], [17]

7

1.1.2 Một số nghiên cứu về tác dụng sinh học

Nhiều loài thuộc chi Gymnema R.Br ñã ñược nghiên cứu về hoạt tính

sinh học bao gồm tác dụng của dịch chiết toàn phần, của cao phân ñoạn và của các hoạt chất ñược phân lập từ cây Theo tổng quan tài liệu, tác dụng nổi

bật của các loài thuộc chi Gymnema R.Br gồm hạ ñường huyết, chống béo

phì, chống oxy hóa, bảo vệ gan và nhiều tác dụng khác Dưới ñây là một số tác dụng sinh học ñiển hình

Tác dụng làm hạ ñường huyết

Trong nền Y học cổ truyền Ấn Độ Ayurveda, loài Gymnema sylvestre R

Br Ex Schult ñã ñược sử dụng ñể ñiều trị bệnh Đái tháo ñường [20] Trong y học hiện ñại, tác dụng hạ ñường huyết của Gymnema sylvestre R Br Ex

Schult ñã ñược chứng minh trên mô hình chuột bị gây Đái tháo ñường bằng alloxan [41] và streptozotocin (STZ) [44] Cho chuột bình thường và chuột bị

gây tăng ñường huyết bằng alloxan uống dịch chiết nước của Gymnema

sylvestre R Br Ex Schult với liều rất nhỏ 2 ml/kg, nồng ñộ glucose huyết sau khi uống thuốc thay ñổi không ñáng kể ñối với chuột bình thường nhưng làm giảm có ý nghĩa ñối với chuột bị Đái tháo ñường [41]

Khả năng làm hạ ñường huyết của phân ñoạn saponin thô và 5 triterpen glycosid (gymnemic acid I-IV và gymnemasaponin V) phân lập từ lá

Gymnema sylvestre R Br Ex Sm cũng ñã ñược chứng minh Một trong các

cơ chế tác ñộng của acid gymnemic là kích thích ñảo tụy tiết insulin ñồng thời

ức chế sự hấp thu glucose vào máu Sự sắp xếp các nguyên tử trong acid gymnemic tương tự như phân tử ñường sẽ cạnh tranh gắn với các recepter của

vị giác ñể các recepter này không bị kích hoạt bởi các phân tử ñường trong thực phẩm [50]

Ở Ấn Độ, một thử nghiệm tiến hành trực tiếp trên bệnh nhân bị Đái tháo ñường tuýp 2 ñược cho uống dịch chiết của Gymnema sylvestre R Br Ex Sm

8

cũng cho thấy tác dụng của dược liệu này trong ñiều trị bệnh Đái tháo ñường [31]

Đánh giá hai chỉ số hạ ñường huyết, giảm trọng lượng cơ thể của chuột

bị Đái tháo ñường và béo phì sau khi uống dịch chiết Gymnema yunnanense

Tsiang cho thấy cây này có khả năng giúp kiểm soát tốt ñường huyết ñối với bệnh Đái tháo ñường tuýp 2 [56]

Dịch chiết chứa hỗn hợp saponin thô của lá Gymnema inodorum (Lour)

Deene ức chế tái hấp thu glucose ở ñoạn ruột bị cô lập và ngăn chặn sự tăng glucose huyết trên chuột [42]

Trong một nghiên cứu thực nghiệm khác theo dõi nồng ñộ glucose huyết, nồng ñộ insulin huyết tương và các enzym chuyển hóa carbohydrat khi

uống dịch chiết ethanol Gymnema montanum Hook.f với liều 25, 50, 100 và

200 mg/kg/ngày trong 3 tuần cho thấy sự giảm ñáng kể nồng ñộ glucose huyết

và cải thiện nồng ñộ insulin huyết tương, ñặc biệt với liều 100 và 200

mg/kg/ngày Dịch chiết ethanol Gymnema montanum Hook.f làm tăng các

enzym hexokinase, glucose-6-phosphat dehydrogenase và glycogen trong gan của chuột bị Đái tháo ñường ñồng thời làm giảm các enzym glucose-6-phosphatase và fructose-1,6-bisphosphatase Nghiên cứu ñã chỉ rõ tác dụng

của dịch chiết Gymnema montanum Hook.f trong ñiều trị bệnh Đái tháo

ñường [37]

Ở Việt Nam, một nghiên cứu ñược tiến hành ñể ñánh giá ñược tác dụng

hạ ñường huyết lá của bốn loài Gymnema sylvestre (Retz.) R.Br ex Sm.,

Gymnema latifolium Wall ex Wight, Gymnema yunnanense Tsiang,

Gymnema inodorum (Lour.) Decne với liều tương ñương 10g dược liệu khô/kg khối lượng chuột trên mô hình gây tăng glucose máu thực nghiệm bằng STZ liều 150mg/kg Tất cả các mẫu thí nghiệm ñều thể hiện tác dụng hạ

glucose máu ở các mức ñộ khác nhau Trong ñó, loài Gymnema sylvestre

(Retz.) R.Br ex Schult thu hái ở Phú Yên, Quảng Ninh, Thái Nguyên cho tác

9

dụng hạ ñường huyết tương ñương gliclazid 20 mg/kg Tương tự, Gymnema

latifolium Wall ex Wight cũng có tác dụng tương ñương với gliclazid liều 20 mg/kg Trong khi ñó Gymnema yunnanense Tsiang và Gymnema inodorum

(Lour) Deene cho tác dụng thấp hơn có ý nghĩa so với gliclazid 20 mg/kg

[15]

Tác dụng chống béo phì

Gymnema sylvestre (Retz.) R.Br ex Schult có tác dụng giảm cân nặng

cơ thể thông qua khả năng làm giảm cảm giác thèm ngọt và kiểm soát nồng

ñộ ñường trong máu Gumarin phân lập từ Gymnema sylvestre (Retz.) R.Br

ex Schult ngăn chặn khả năng cảm nhận vị ngọt và vị ñắng, do ñó làm giảm

cảm giác thèm ngọt [20] Một nghiên cứu khác khi cho chuột sử dụng dịch

chiết Gymnema sylvestre (Retz.) R.Br ex Schult với hỗn hợp crom-niacin và

acid hydroxycitric; tiến hành theo dõi các chỉ số: khối lượng cơ thể, chỉ số khối lượng cơ thể (BMI), sự chán ăn, lipid, leptin huyết thanh và bài tiết chuyển hóa mỡ tại thận, cho thấy ñây là một sự kết hợp làm giảm cân an toàn

và hiệu quả, ñồng thời cải thiện ñược lượng mỡ trong máu [20]

Tác dụng bảo vệ gan

Tác dụng bảo vệ gan của dịch chiết ethanol Gymnema sylvestre (Retz.)

R.Br ex Schult ñược ñánh giá bởi Srividya và cộng sự bằng các thử nghiệm

in vitro trên tế bào gan chuột Các tế bào biểu hiện sự phục hồi ñáng kể các chỉ số sinh hóa theo hướng bình thường so với nhóm ñiều trị D-galactosamin (p<0,001) ở các mức liều phụ thuộc [50]

Một số diglycosid phân lập từ Gymnema inodorum (Lour) Deene ñược

chứng minh có tác dụng bảo vệ gan chống lại sự phá hủy tế bào HL-7702 gây

ra bởi D-galactosamin [48]

Khả năng gây ñộc tế bào khối u

Gymnema sylvestre (Retz.) R.Br ex Schult có khả năng ức chế sự phát

triển của khối u trong giai ñoạn 2 của chuột bị ung thư da [57] và chống lại

10

các tế bào u ác tính A357 ở người [21] Một số saponin chiết xuất từ

Gymnema sylvestre (Retz.) R.Br ex Schult như ginsenosid, soyasaponin, saikosaponin ñược chứng minh có khả năng chống ung thư Khả năng ức chế

tế bào ung thư của gymnemagenol trên dòng HeLa trong thử nghiệm in vitro

với giá trị IC50 là 37 µg/mL Sau 96 giờ, dịch chiết ứng với nồng ñộ 50 µg/mL gymnemagenol sẽ gây ñộc tế bào tốt nhất với khả năng ức chế 73% tế bào

HeLa Do ñó, việc phân lập gymnemagenol có ý nghĩa quan trọng trong ức

chế dòng tế bào ung thư HeLa [50]

Một nghiên cứu với mục tiêu ñánh giá hiệu quả ñiều trị ung thư và cơ

chế phân tử của dịch chiết ethanol Gymnema montanum Hook.f trên dòng tế

bào ung thư bạch cầu người HL-60 ñã ñược thực hiện Kết quả cho thấy, dịch

chiết này có khả năng gây ñộc tế bào mạnh trên dòng tế bào HL-60 với giá trị

IC50 là 20 µg/mL nhưng lại không gây ñộc ñối với các tế bào ñơn nhân trong

máu ngoại vi Gymnema montanum Hook.f gây ra apoptosis (quá trình diệt tế

bào theo một chu trình) cho các tế bào ung thư bạch cầu người, gián tiếp thông qua khả năng làm phá hủy màng ty thể, sự tạo thành các phản ứng oxy hóa và sự suy giảm khả năng chống oxy hóa nội tế bào [38]

Hoạt tính kháng khuẩn

Trong nghiên cứu in vitro, dịch chiết ethanol của lá Gymnema sylvestre

(Retz.) R.Br ex Schult cho thấy hoạt tính kháng khuẩn với các chủng vi

khuẩn Bacillus puntilis, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa và

Staphylococus aureus mà không có tác dụng với Escherichia coli và Proteus

vulgaris [50]

Tác dụng khác

Ngoài các tác dụng trên, một số tác dụng khác của Gymnema sylvestre

(Retz.) R.Br ex Schult ñã ñược nghiên cứu sơ bộ gồm có tác dụng giảm ñau, chống viêm, chữa sâu răng, kích thích miễn dịch, ñiều trị vết thương [50]

11

Bên cạnh tác dụng dược lý, người ta cũng ñã xác ñịnh ñộc tính của một số

loài trong chi Gymnema R.Br ñể chứng minh tính an toàn của các loài này

trong ñịnh hướng sử dụng làm thuốc

Độc tính bán trường diễn của dịch chiết Dây thìa canh (Gymnema

sylvestre (Retz) R.Br ex Schult.) trong 52 tuần với liều tỷ lệ từ 0,01; 0,1; 1% cao chiết với tổng lượng thức ăn ñịnh mức hàng ngày trên cả chuột ñực và chuột cái Wista, so với lô chứng âm Trọng lượng cơ thể, lượng thức ăn tiêu thụ ñược theo dõi hàng tuần cho tới 12 tuần Sau ñó chu kì ñược theo dõi dài hơn, nghiên cứu giữa kì vào tuần thứ 26 và lần cuối cùng vào tuần 52 Động vật thí nghiệm ñược xét nghiệm về huyết học, sinh hoá và bệnh học Kết quả cho thấy, không có chuột chết trong khoảng thời gian 52 tuần, không có hiện tượng thay ñổi về cân nặng, khả năng ăn uống, huyết học, sinh hóa và bệnh học Kết luận: không có ñộc tính trên chuột dùng dịch chiết lá Dây thìa canh ñến mức liều 1% trong 52 tuần [35] Độc tính cấp của Dây thìa canh

(Gymnema sylvestre (Retz) R.Br ex Schult.) ñã ñược xác ñịnh là LD50 =

250,00 (209,21-298,75) g/kg [16] Độc tính cấp của Dây thìa canh lá to

(Gymnema latifolium Wall ex Wight) ñã ñược nghiên cứu và xác ñịnh không

phát hiện thấy LD50 [16]

1.1.3 Một số nghiên cứu về thành phần hóa học

Các nghiên cứu hóa học ñầu tiên về chi Gymnema R.Br là ở trên loài

Gymnema sylvestre (Retz) R.Br ex Schult ñược thực hiện vào ñầu thế kỷ XX tập trung chủ yếu vào quá trình chiết xuất, phân lập, xác ñịnh cấu trúc hóa học của các chất ñã phân lập ñược

Ngoài thành phần hóa học của loài Gymnema latifolium Wall ex Wight

sẽ ñược trình bày riêng, bảng 1.3 sẽ tóm tắt thành phần hóa học một số loài

khác trong chi Gymnema R.Br

3-O-beta-D-Gymnema sylvestre

(Retz) R Br

Ex Schult

[58]

21 beta-benzoylsitakisogenin beta-D-glucuronopyranosid

3-O-3-O-beta-D-glucopyranosyl(1 beta-D-glucopyranosyl oleanolic acid 28-O-beta-D-glucopyranosyl este

6)-Oleanolic acid xylopyranosyl(16)-beta-D-glucopyranosyl(16)-beta-D- glucopyranosid

3-O-beta-D-beta-D-glucopyranosyl (16)-beta-D-glucopyranosyl oleanolic acid 28-O-beta-D-glucopyranosyl este 3-O-beta-D-glucopyranosyl(1 6)-beta-D-glucopyranosyl oleanolic acid 28-beta-D-glucopyranosyl(1

3-O-beta-D-xylopyranosyl(16)-6)-beta-D-glucopyranosyl este 2α, 3β-dihydroxy-olean-12-ene-23, 28-dioic acid-3-O-β-D-glucopyrano-

(Lour) Deene

[53] 2α, 3β, 15β-trihydroxy-olean-12-

ene-23, 28-dioic gluco-pyranosid

acid-3-O-β-D-Dẫn xuất của (3 beta,4 alpha,16 beta)-16,23,28-trihydroxyolean-12-

Gymnema inodorum [42]

13

en-3-yl-beta-D-glucopyranosiduroic

Gymnemasins A: glucopyranosyl(13) – beta – D-glucopyranosyl] – 22 – O-tiglyol-gymnemanol

3-O-[beta-D-Gymnema sylvestre

(Retz) R.Br

ex Schult

[20]

Gymnemasins B: glucopyranosyl(13) - beta-D-glucuro - nopyranosyl] - gymnemanol

3-O-[beta-D-Gymnemasins C: glucuronopyranosyl-22-O-tigloyl-gymnemanol

3-O-beta-Gymnemasins D: 3-O-beta - glucopyranosyl -gymnemanol

Gymnemasid IV: 19-Aldehyde, beta-D-glucopyranosid, 20-O-[beta-D-xylopyranosyl-(1-6)-beta-D-glucopyranosid]

Gymnemasid V: 19-Aldehyd, [beta-D-glucopyranosyl-(1-2)-beta-D-glucopyranosid], 20-O-[ beta -D-xylopyranosyl-(1-6)- beta -D-glucopyranosid]

3-O-Gymnemasid VI: Rhamnopyranosyl-(1-6)-beta-D-glucopyranosid]

20-O-[alpha-L-14

Gymnemasid VII: 25-Hydroperoxid,

20 – O-[beta – D – (1-6) – beta – D-glucopyranosid]

3-O-beta-D-Gymnema sylvestre

và dẫn xuất

Acid tartaric, acid butyric, acid

Diglycosid

Gymnetinosids A-F

Gymnema inodorum

(Lour)

Deene)

[48]

Sequinosid K Khaephuosid B Albibrissinosid A

Các chất

khác

Resin, albumin, chlorophyll, carbohydrates, anthraquinon, alkaloid, inositole, parabin, calci oxalate, lignin, cellulose

Gymnema sylvestre

mới ñược nghiên cứu trong thời gian gần ñây, theo ñó các loài trong chi

Gymnema R.Br.cho thấy phần lớn là các saponin triterpenoid, với cấu trúc chủ yếu là khung olean và dammaran

15

1.2 Loài Dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall Ex Wight)

1.2.1 Đặc ñiểm thực vật và phân bố

Thân leo tới 6m Thân có lỗ vỏ, các nhánh có nhiều lông tơ Cuống lá 1,5

- 4 cm, có lông tơ dày ñặc; phiến lá 8-13 × 5-8 cm, lông dày ñặc, càng xa trục càng dày ñặc, gốc tròn, ngọn nhọn, gân bên 6-7 cặp Cụm hoa xim dạng ñầu thành từng ñôi ở mấu, có lông dày Một cụm mang rất nhiều hoa, mùi thơm Cuống cụm hoa 1-1,5 cm, cuống hoa 3-8 mm Đài hình trứng, phủ lông măng Tràng hoa vàng, hình chuông, nhẵn ở mặt ngoài Ống hoa có 5 cặp gờ mang lông ở họng tràng, các thùy hình trứng, khoảng 1,2 × 1,2 mm, phủ lông dày ñặc hướng trục, ngắn hơn so với ống tràng Khối nhị nhụy dạng hình trụ, phần phụ nhị dạng màng ngắn hơn so với ñầu núm nhụy Khối phấn hình thuôn Đầu núm nhụy hình nón, ñỉnh phân ñôi [17]

Quả ñại hình mác nhọn, 4,5-5,5 × 1,5-2 cm Hạt hình trứng thuôn, dài khoảng 1,1 cm × 5 mm, mép dạng màng; mào lông dài 3 cm [17]

Loài Gymnema latifolium Wall Ex Wight ñược phân bố ở ñảo Andaman

và Nicobar, Bangladesh, Trung Quốc (Quảng Đông, Quảng Tây, Vân Nam),

Ấn Độ (Arunachal Pradesh, Assam, Kerala, Maharashtra, Tamil Nadu), Myanmar, Thailand [51], Việt Nam (Gia Lai, Tây Ninh, Tuyên Quang, Hoà Bình, Thái Nguyên) [17]

1.2.2 Thành phần hóa học

Cho ñến nay theo tổng quan tài liệu, loài Gymnema latifolium Wall Ex

Wight chỉ mới ñược nghiên cứu rất sơ lược về thành phần hóa học Các nhóm chất chứa trong cây này chỉ mới ñược ñề cập ñến trong rất ít các tài liệu, bao gồm: HCN-glucosid [33], saponin, flavonoid, tanin, sterol, chất béo acid

amin, ñường khử và coumarin trong loài Gymnema latifolium Wall Ex Wight

thu hái tại Hòa Bình [9]

16

Sản phẩm thuỷ phân phân ñoạn ethyl acetat của Dây thìa canh lá to

(Gymnema latifolium Wall ex Wight) có píc tương ứng với gymnemagenin

trên sắc ký ñồ [17]

1.2.3 Tác dụng sinh học

Theo Trần Văn Ơn, Phùng Thanh Hương và cộng sự [16], dịch chiết lá

Dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall ex Wight) ở Việt Nam có tác

dụng hạ ñường huyết trên chuột bình thường (24,07 %), tác dụng cao nhất thể hiện sau 4 giờ, kéo dài ñến 5 giờ và trên chuột gây tăng ñường huyết bởi STZ (36,31%) sau 10 ngày cho uống dịch chiết Liều dùng thích hợp là cắn toàn phần ñược pha thành hỗn dịch trong nước cất với tỉ lệ 1:1, liều 0,5ml/25g, tương ứng với 10g lá khô/kg khối lượng chuột Kết quả thử nghiệm cho thấy

tác dụng hạ ñường huyết của dịch chiết lá Dây thìa canh lá to (Gymnema

latifolium Wall ex Wight) mạnh hơn Dây thìa canh (Gymnema sylvestre

(Retz) R.Br ex Schult.) Ngoài các công bố trên, cho ñến nay trên thế giới cũng như ở Việt Nam chưa có một công bố chính thức nào về tác dụng sinh

học của Dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall ex Wight)

17

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng và phương tiện nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là cành mang lá của cây Dây thìa canh lá to

(Gymnema latifolium Wall ex Wight) Cây ñược thu hái vào tháng 06/2013

tại xã Yên Ninh, huyện Phú Lương, tỉnh Thái Nguyên Cây ñã ñược giám ñịnh tên khoa học và lưu giữ mẫu tại bộ môn Thực vật – Trường Đại học Dược Hà Nội, mã số tiêu bản HNIP/18068/14

Hình 2.1 Hình ảnh của Dây thìa canh lá to

(Gymnema latifolium Wall Ex Wight) 2.1.2 Động vật thí nghiệm

Chuột nhắt trắng trưởng thành chủng Swiss, khỏe mạnh, cân nặng 22 -

25 g do Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp

Chuột ñược nuôi ổn ñịnh trong ñiều kiện phòng thí nghiệm 5 ngày trước khi thực hiện nghiên cứu

- Dinh dưỡng:

+ Thức ăn: Thức ăn viên tổng hợp (làm từ bột bắp, ñậu nành, bột cá, thóc mầm…) dành cho chuột nhắt trắng thí nghiệm của Viện vệ sinh dịch tễ trung ương có chứa tỷ lệ thích hợp protein, carbonhydrat, mỡ, chất khoáng, vitamin, chất xơ

18

+ Nước uống: Nước máy sinh hoạt

- Ánh sáng: Chiếu sáng với chu kì 12 giờ sáng, 12 giờ tối

2.1.3 Hóa chất, máy móc và thiết bị

2.1.3.1 Hóa chất

Thuốc Gliclazid STADA 80mg

Dung môi ñược sử dụng: methanol, ethanol, n-buthanol, ethyl acetat, chloroform, n-hexan, aceton, toluen, acid formic, amoniac, dichloromethan,

nước cất, acid acetic… Thuốc thử: dung dịch H2SO4 10%/ethanol tuyệt ñối.Chất nhồi cột sắc ký: silicagel pha thuận (silicagel 60, 0,040 – 0,063mm Merck) và pha ñảo (YMC, 30-50 µm, FuJisilisa Chemical Ltd.), Sephadex LH-20, Dianion HP-20

Bản sắc ký lớp mỏng pha thuận (TLC - silicagel 60 F254, Merck) và pha ñảo (RP18, F254, Merck)

Các hoá chất và thuốc thử ñạt tiêu chuẩn phân tích theo quy ñịnh của Dược Điển Việt Nam IV [4]

Cân phân tích hiện số Mettler Toledo AB204-S, ñộ chính xác 0,0001 g Micropipette 100, 200, 500 µl (Human), micropipette 50 µl (Excel monopette 8000) Bếp ñiện, tủ sấy Memmert, máy cô quay Yamato, bình chiết, máy lọc hút chân không, máy chiết siêu âm, máy hòa tan cánh khuấy

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân ñược ño trên máy Bruker Avance AM500 FT-NMR tại Viện hoá học, Viện khoa học và công nghệ Việt Nam Chất chuẩn nội là tetramethyl silan

19

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Chiết xuất dược liệu và chiết phân ñoạn lỏng- lỏng

Cành mang lá của cây Dây thìa canh lá to ñược rửa sạch, thái nhỏ, phơi, sấy khô ở 50ºC - 60ºC, sau ñó xay thành bột thô và tiến hành chiết xuất, phân lập các hợp chất Lượng bột thô ñem chiết xuất là 5,0 kg

Toàn bộ lượng bột thô Dây thìa canh lá to ñược cho vào bình chiết và làm ẩm bằng methanol tuyệt ñối, ñậy kín, ñể yên cho thấm ẩm và trương nở hoàn toàn Sau ñó thêm methanol tuyệt ñối ngập dược liệu và cách bề mặt dược liệu khoảng 3cm rồi ngâm ở nhiệt ñộ phòng Tiến hành chiết 3 ñợt, mỗi ñợt chiết trong 7 ngày Dịch chiết thu ñược ñem cô quay hút chân không ở

50oC thu ñược cắn dạng cao ñặc

Cao ñặc thu ñược từ dịch chiết của dược liệu ñược phân tán vào nước với tỷ lệ 1:2 thu ñược dịch nước Sau ñó lần lượt lắc với các dung môi hữu cơ

có ñộ phân cực tăng dần từ n-hexan, chloroform, ethyl acetat, n-buthanol ñể thực hiện phân tách các nhóm chất theo ñộ phân cực [7] Cô quay các dịch chiết phân ñoạn thu ñược các cắn phân ñoạn tương ứng

2.2.2 Nghiên cứu tác dụng hạ ñường huyết

2.2.2.1 Điều chế dạng thuốc nghiên cứu

Cao toàn phần và các cao phân ñoạn ñược phân tán bằng dung dịch NaCMC 0,5% trong nước cất theo tỉ lệ 1:1 ñể tạo thành hỗn dịch cho chuột uống

Liều pha các cắn phân ñoạn tương ứng với hiệu suất chiết cắn phân ñoạn

ñó từ dược liệu quy ñổi tương ñương với 10g dược liệu khô/1kg khối lượng chuột

2.2.2.2 Phương pháp ñịnh lượng glucose huyết [19], [49]

Máu ñể ñịnh lượng ñường huyết là máu toàn phần ñược lấy từ tĩnh mạch ñuôi chuột Giá trị glucose huyết ño lúc ñói là giá trị glucose huyết của chuột

ñã ñược cho nhịn ñói 8 giờ

20

Phương pháp ñịnh lượng glucose huyết của chuột bằng máy ño glucose huyết Accu - chek Active (Roche - Thụy Sĩ) ñược thực hiện theo nguyên tắc: enzym glucose oxidase (GOD) xúc tác cho phản ứng oxy hóa glucose thành acid gluconic và H2O2 Sau ñó, H2O2 tạo thành sẽ bị peroxidase phân hủy, giải phóng O2, oxy hóa chuyển O – dianisidin từ dạng khử thành dạng oxy hóa có

màu vàng nâu Cường ñộ màu ñược xác ñịnh bằng phương pháp ño quang tương ứng với lượng glucose huyết cần ñịnh lượng

Phản ứng:

Glucose + H2O + O2 → Acid gluconic + H2O2 (1)

O-dianisidin (dạng khử) + H2O2 → O-dianisidin (dạng OXH) + H2O (2) (phức hợp màu vàng nâu)

2.2.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng dịch chiết Dây thìa canh lá to trên glucose huyết của chuột tiêm STZ

Sử dụng phương pháp nghiên cứu thực nghiệm có ñối chứng Đánh giá tác dụng hạ glucose huyết của dịch chiết dược liệu trên mô hình chuột tăng glucose huyết thực nghiệm bằng STZ (tiêm màng bụng liều 150 mg/kg) Kết quả nghiên cứu ñược tiến hành so sánh giữa nhóm thử và nhóm ñối chứng trong cùng ñiều kiện

Chuột thí nghiệm ñược tiêm màng bụng dung dịch STZ trong ñệm citrat

pH 4,5 liều 150 mg/kg khối lượng chuột Sau 72 giờ, rút thức ăn và ñể chuột nhịn ñói qua ñêm trong vòng 8 giờ, tiến hành ñịnh lượng ñường huyết lúc ñói của chuột Chuột có mức glucose huyết ≥ 10 mmol/l ñược coi là bị Đái tháo ñường và ñem chia lô thử nghiệm

Chuột tăng glucose huyết thực nghiệm ñược chia thành các lô: Lô chứng

âm uống dung dịch NaCMC 0,5%, Lô chứng dương uống gliclazid (20 mg/kg khối lượng chuột/ngày), các lô thử uống hỗn dịch cao chiết methanol toàn phần và cao các phân ñoạn dược liệu với liều tương ñương 10 g dược liệu khô/kg khối lượng chuột/ngày

GOD

21

Cho chuột uống mẫu thử trong vòng 7 ngày (vào 8h sáng mỗi ngày), trong 7 ngày ñó cho chuột ăn uống bình thường Ngày thứ 7, xác ñịnh lại glucose huyết lúc ñói của chuột vào cùng thời ñiểm với ngày ñầu So sánh sự thay ñổi glucose huyết của các lô thí nghiệm

Gtr: giá trị glucose huyết ñược ñịnh lượng 72h sau khi tiêm STZ

Gs: giá trị glucose huyết ñược ñịnh lượng sau 7 ngày uống thuốc

- Các thao tác xử lý thống kê:

Dùng “One way ANOVA” chỉ ra có hay không sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các giá trị trung bình

Dùng “One way ANOVA (Options – Homogeneity of variance test)” chỉ

ra có hay không sự ñồng nhất giữa các phương sai của giá trị tỷ lệ hạ glucose máu (%) giữa các lô chuột – là cơ sở ñể chọn test hậu kiểm “Post Hoc Multiple Comparision”

Dùng “One way ANOVA (Post Hoc Multiple Comparision) chỉ ra sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các cặp giá trị trung bình tỷ lệ hạ glucose máu (%)

22

2.2.3 Nghiên cứu về thành phần hóa học

2.2.3.1 Phương pháp chiết xuất

Ngoài quá trình chiết xuất dược liệu tạo dịch chiết toàn phần và chiết xuất phân ñoạn lỏng - lỏng ñã ñược trình bày ở mục 2.2.1, quá trình chiết xuất dược liệu còn sử dụng phương pháp chiết pha rắn

Chiết pha rắn ñược tiến hành trên cột sắc ký thủy tinh có kích cỡ khác nhau tùy thuộc vào lượng mẫu ñem chiết Pha tĩnh hay sử dụng là silica gel pha thuận (Silica gel 60, 0,040 - 0,063 mm (230 - 400 mesh ASTM), Merck) Cao dược liệu ñược tẩm với lượng vừa ñủ silica gel rồi thực hiện cô loại dung môi thu ñược bột khô tơi Chuẩn bị cột: cột sắc ký ñược rửa sạch, tráng bằng methanol, ñể khô tự nhiên Lót bông ở ñáy cột và cố ñịnh chắc chắn trên giá Cho silicagel pha thuận lên cột sao cho bề dày lớp silicagel khoảng 1 cm, sau

ñó ñưa lượng chất ñã tẩm silicagel nói trên lên cột, gõ nhẹ ñể bột phân bố ñều Sau ñó rửa giải bằng các hệ dung môi có ñộ phân cực tăng dần [14]

2.2.3.2 Phương pháp phân lập

Quá trình phân lập sử dụng phương pháp sắc ký cột với các cơ chế chủ yếu là cột hấp phụ, cột trao ñổi ion và cột lọc qua gel Sắc ký lớp mỏng ñược

sử dụng ñể theo dõi quá trình rửa giải

Thực hiện với bản mỏng tráng sẵn silica gel pha thuận (TLC-Silica gel

60 F254, Merck) và pha ñảo (RP18, Merck) Các chất ñược phát hiện bằng ñèn

tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 366 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% (v/v) pha trong ethanol phun ñều lên bản mỏng rồi sấy ở nhiệt ñộ cao trong vài phút cho ñến khi hiện màu [7]

Phương pháp nhồi cột ướt ñược sử dụng chủ yếu ñối với tất cả các loại sắc ký cột [7]

2.2.3.3 Phương pháp xác ñịnh cấu trúc

Việc xác ñịnh cấu trúc ñược thực hiện thông qua phân tích dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance, NMR) Kết quả biện

23

luận ñược khẳng ñịnh sau khi giải phổ và so sánh với chất tham khảo trong các nghiên cứu ñã ñược công bố

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân ñược ño gồm có NMR một chiều (1H-NMR,

13C-NMR, DEPT), thực hiện trên máy Bruker Avance AM500 FT-NMR tại Viện Hoá học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam với chất chuẩn nội là tetramethyl silan (TMS)

24

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 Kết quả chiết xuất dược liệu và chiết phân ñoạn lỏng-lỏng

Dịch chiết thu ñược sau khi gộp dịch chiết 3 lần ngâm ở nhiệt ñộ phòng bột cành mang lá của cây Dây thìa canh lá to ñem cô quay ở áp suất giảm ở

50oC thu ñược cắn dạng cao ñặc, khối lượng là 585,8g, hàm ẩm cắn thu ñược

là 12,84%

Tiến hành chiết phân ñoạn lỏng-lỏng thu ñược các cắn phân ñoạn có

khối lượng tương ứng: n-hexan (H, 65,5g), chloroform (C, 29,85g), ethyl acetat (E, 36,05g), n-buthanol (B, 181,1g), và nước (N, 218,7g)

Sơ ñồ chiết xuất dược liệu và chiết phân ñoạn lỏng-lỏng ñược thể hiện ở hình 3.1

Cô quay, áp suất giảm

Phân tán trong nước

26

3.2 Kết quả nghiên cứu về tác dụng hạ ñường huyết

Bốn lô chuột có mức hạ glucose máu khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với lô chứng âm gồm: lô chứng dương, lô uống cao chiết toàn phần methanol, phân ñoạn ethyl acetat và buthanol

Khả năng làm hạ glucose máu của lô chứng dương khác biệt có ý nghĩa

thống kê (p<0,05) so với các lô n-hexan, chloroform và nước; không có ý

nghĩa (p>0,05) so với các lô methanol, ethyl acetat và buthanol

Mức hạ glucose máu của các lô uống cao dịch chiết toàn phần methanol, cao phân ñoạn ethyl acetat, buthanol có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với các

lô chuột uống hỗn dịch cao phân ñoạn n-hexan, chloroform và cắn nước

Trong 5 phân ñoạn nghiên cứu, 2 phân ñoạn ethyl acetat và buthanol thể

hiện khả năng hạ ñường huyết mạnh hơn 3 phân ñoạn còn lại (phân ñoạn

n-hexan, chloroform và cắn nước) với mức hạ glucose máu lần lượt là 42,38%

27

Bảng 3.1 Sự thay ñổi glucose máu của các lô chuột thí nghiệm

Lô chuột (*) Chỉ số glucose máu

(mmol/l)

Tỷ lệ hạ glucose máu (%)

P value so với lô (**)

(C): Lô chuột uống hỗn dịch cao phân ñoạn Chloroform, Ethyl acetat (E): Lô chuột uống hỗn dịch cao phân ñoạn Ethyl acetat,

n-buthanol (B): Lô chuột uống hỗn dịch cao phân ñoạn n-n-buthanol, HD Nước (W): Lô chuột uống cao phân ñoạn nước

(**) +: p<0,05: mức giảm glucose máu giữa 2 lô khác biệt có ý nghĩa thống kê, 0: p>0,05: mức giảm glucose máu giữa 2 lô khác biệt không

có ý nghĩa thống kê

Chuẩn bị cột: cột sắc ký ñược rửa sạch, tráng bằng methanol, ñể khô tự nhiên Lót bông ở ñáy cột và cố ñịnh chắc chắn trên giá Cho silicagel pha thuận lên cột sao cho bề dày lớp silicagel khoảng 1 cm, sau ñó ñưa lượng chất

ñã tẩm silicagel nói trên lên cột, gõ nhẹ ñể bột phân bố ñều

Rửa giải gradient bằng n-hexan–aceton (100:0, 40:1, 20:1, 10:1 và

0:100, v/v, mỗi hệ 1,5 lít) Hứng các phân ñoạn, cô quay cất thu hồi dung môi thu ñược các cắn dạng cao ñặc ký hiệu lần lượt từ E1 ñến E5

Phân ñoạn E1 ñược triển khai trên sắc ký cột pha thuận với hệ dung môi

n-hexan–ethyl acetat (40:1, v/v, 1,5 lít) thu ñược 2 phân ñoạn ký hiệu là E1A

và E1B

Phân ñoạn E1A ñược tiếp tục phân lập trên cột sắc ký pha thuận với hệ

dung môi n-hexan–chloroform (20:1, v/v, 1,5 lít) thu ñược các phân ñoạn

ñược ñánh số từ E1A1 ñến E1A7

Phân ñoạn E1A6 với các cụm vết xuất hiện khá rõ ñược chọn tiếp tục phân lập trên cột sắc ký pha ñảo với hệ dung môi aceton–methanol–nước (1:1:0,2, v/v/v, 1,5 lít) thu ñược các phân ñoạn ñược ñánh dấu từ E1A6A ñến E1A6E Phân ñoạn E1A6E ñược ñưa lên cột sắc ký pha thuận với hệ dung

môi chloroform–methanol (5:1, v/v, 1,5 lít) thu ñược hợp chất 1 (ký hiệu là

GLHE9) Kiểm tra trên sắc ký bản mỏng pha thuận với 2 hệ dung môi

n-hexan–ethyl acetat (6:1, v/v) và n-n-hexan–ethyl acetat–methanol (10:1:0,1,

v/v/v), ñồng thời trên sắc ký bản mỏng pha ñảo với hệ dung môi aceton–

29

methanol–nước (5:1:0,1, v/v/v) nhận thấy ñây là một chất sạch, tiến hành ño phổ ñể xác ñịnh cấu trúc

Phân ñoạn E1A7 ñược ñưa lên cột sắc ký pha thuận với hệ dung môi

n-hexan–ethyl acetat (10:1, v/v, 1,5 lít) thu ñược hợp chất 2 (ký hiệu là GLHE7) Kiểm tra trên sắc ký bản mỏng pha thuận với 2 hệ dung môi

chloroform–methanol (6:1, v/v) và n-hexan–aceton (3:1, v/v), ñồng thời trên

sắc ký bản mỏng pha ñảo với hệ dung môi aceton–nước (15:1, v/v) nhận thấy ñây là một chất sạch, tiến hành ño phổ ñể xác ñịnh cấu trúc

Phân ñoạn E2 ñược triển khai trên sắc ký cột pha thuận với hệ dung môi

n-hexan–ethyl acetat–methanol (7:1:1, v/v/v, 1,5 lít) thu ñược các phân ñoạn

ký hiệu là E2A và E2H

Phân ñoạn E2H ñược ñưa lên cột Shephadex LH20, giải ly bằng dung

môi methanol 90% thu ñược hợp chất 3 (ký hiệu là GLHE2) Kiểm tra trên

sắc ký bản mỏng pha thuận với 2 hệ dung môi chloroform–methanol (10:1,

v/v) và n-hexan–aceton (5:1, v/v), ñồng thời trên sắc ký bản mỏng pha ñảo

với hệ dung môi aceton–nước (5:1, v/v) nhận thấy ñây là một chất sạch, tiến hành ño phổ ñể xác ñịnh cấu trúc

Sơ ñồ chiết pha rắn cắn ethyl acetat ñược thể hiện ở hình 3.2, sơ ñồ phân lập các hợp chất 1 (GLHE9) và hợp chất 2 (GLHE7) từ phân ñoạn E1 ñược thể hiện ở hình 3.3, sơ ñồ phân lập hợp chất 3 (GLHE2) từ phân ñoạn E2 ñược thể ở hình 3.4

E1 E2 E3 E4 E5

aceton 100%

Chiết pha rắn

31

Hình 3.3 Sơ ñồ phân lập hợp chất 1 (GLHE9)

và hợp chất 2 (GLHE7) từ phân ñoạn E1

SKC pha ñảo Aceton:methanol:nước (1:1:0,2)

SKC pha thuận n-hexan: ethyl acetat (40:1)

E2

SKCpha thuận n-hexan:ethylacetat:methanol (7:1:1)

Shephadex Giải ly bằng methanol 90%