Cành mang lá của cây Dây thìa canh lá to ñược rửa sạch, thái nhỏ, phơi, sấy khô ở 50ºC - 60ºC, sau ñó xay thành bột thô và tiến hành chiết xuất, phân lập các hợp chất. Lượng bột thô ñem chiết xuất là 5,0 kg.
Toàn bộ lượng bột thô Dây thìa canh lá to ñược cho vào bình chiết và làm ẩm bằng methanol tuyệt ñối, ñậy kín, ñể yên cho thấm ẩm và trương nở
hoàn toàn. Sau ñó thêm methanol tuyệt ñối ngập dược liệu và cách bề mặt dược liệu khoảng 3cm rồi ngâm ở nhiệt ñộ phòng. Tiến hành chiết 3 ñợt, mỗi
ñợt chiết trong 7 ngày. Dịch chiết thu ñược ñem cô quay hút chân không ở
50oC thu ñược cắn dạng cao ñặc.
Cao ñặc thu ñược từ dịch chiết của dược liệu ñược phân tán vào nước với tỷ lệ 1:2 thu ñược dịch nước. Sau ñó lần lượt lắc với các dung môi hữu cơ
có ñộ phân cực tăng dần từ n-hexan, chloroform, ethyl acetat, n-buthanol ñể
thực hiện phân tách các nhóm chất theo ñộ phân cực [7]. Cô quay các dịch chiết phân ñoạn thu ñược các cắn phân ñoạn tương ứng.
2.2.2. Nghiên cứu tác dụng hạñường huyết
2.2.2.1. Điều chế dạng thuốc nghiên cứu
Cao toàn phần và các cao phân ñoạn ñược phân tán bằng dung dịch NaCMC 0,5% trong nước cất theo tỉ lệ 1:1 ñể tạo thành hỗn dịch cho chuột uống.
Liều pha các cắn phân ñoạn tương ứng với hiệu suất chiết cắn phân ñoạn
ñó từ dược liệu quy ñổi tương ñương với 10g dược liệu khô/1kg khối lượng chuột.
2.2.2.2. Phương pháp ñịnh lượng glucose huyết [19], [49]
Máu ñể ñịnh lượng ñường huyết là máu toàn phần ñược lấy từ tĩnh mạch
ñuôi chuột. Giá trị glucose huyết ño lúc ñói là giá trị glucose huyết của chuột
20
Phương pháp ñịnh lượng glucose huyết của chuột bằng máy ño glucose huyết Accu - chek Active (Roche - Thụy Sĩ) ñược thực hiện theo nguyên tắc: enzym glucose oxidase (GOD) xúc tác cho phản ứng oxy hóa glucose thành acid gluconic và H2O2. Sau ñó, H2O2 tạo thành sẽ bị peroxidase phân hủy, giải phóng O2, oxy hóa chuyển O – dianisidin từ dạng khử thành dạng oxy hóa có màu vàng nâu. Cường ñộ màu ñược xác ñịnh bằng phương pháp ño quang tương ứng với lượng glucose huyết cần ñịnh lượng.
Phản ứng:
Glucose + H2O + O2 → Acid gluconic + H2O2 (1)
O-dianisidin (dạng khử) + H2O2 → O-dianisidin (dạng OXH) + H2O (2) (phức hợp màu vàng nâu)
2.2.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng dịch chiết Dây thìa canh lá to trên glucose huyết của chuột tiêm STZ
Sử dụng phương pháp nghiên cứu thực nghiệm có ñối chứng. Đánh giá tác dụng hạ glucose huyết của dịch chiết dược liệu trên mô hình chuột tăng glucose huyết thực nghiệm bằng STZ (tiêm màng bụng liều 150 mg/kg). Kết quả nghiên cứu ñược tiến hành so sánh giữa nhóm thử và nhóm ñối chứng trong cùng ñiều kiện.
Chuột thí nghiệm ñược tiêm màng bụng dung dịch STZ trong ñệm citrat pH 4,5 liều 150 mg/kg khối lượng chuột. Sau 72 giờ, rút thức ăn và ñể chuột nhịn ñói qua ñêm trong vòng 8 giờ, tiến hành ñịnh lượng ñường huyết lúc ñói của chuột. Chuột có mức glucose huyết ≥ 10 mmol/l ñược coi là bị Đái tháo
ñường và ñem chia lô thử nghiệm.
Chuột tăng glucose huyết thực nghiệm ñược chia thành các lô: Lô chứng âm uống dung dịch NaCMC 0,5%, Lô chứng dương uống gliclazid (20 mg/kg khối lượng chuột/ngày), các lô thử uống hỗn dịch cao chiết methanol toàn phần và cao các phân ñoạn dược liệu với liều tương ñương 10 g dược liệu khô/kg khối lượng chuột/ngày.
21
Cho chuột uống mẫu thử trong vòng 7 ngày (vào 8h sáng mỗi ngày), trong 7 ngày ñó cho chuột ăn uống bình thường. Ngày thứ 7, xác ñịnh lại glucose huyết lúc ñói của chuột vào cùng thời ñiểm với ngày ñầu. So sánh sự
thay ñổi glucose huyết của các lô thí nghiệm.
2.2.2.4. Xử lý số liệu
Số liệu ñược nhập và xử lý bằng phần mềm SPSS 20. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Trong kết quả nghiên cứu về tác dụng hạñường huyết, các số liệu ñược trình bày dưới dạng X ± SD (giá trị trung bình ± sai số chuẩn).
- Thông số ñược sử dụng ñể so sánh là tỷ lệ hạ glucose huyết (%) ñược tính theo công thức:
Tỷ lệ hạ glucose huyết (%) = (Gtr – Gs)/Gtr * 100
Trong ñó:
Gtr: giá trị glucose huyết ñược ñịnh lượng 72h sau khi tiêm STZ Gs: giá trị glucose huyết ñược ñịnh lượng sau 7 ngày uống thuốc - Các thao tác xử lý thống kê:
Dùng “One way ANOVA” chỉ ra có hay không sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các giá trị trung bình.
Dùng “One way ANOVA (Options – Homogeneity of variance test)” chỉ
ra có hay không sựñồng nhất giữa các phương sai của giá trị tỷ lệ hạ glucose máu (%) giữa các lô chuột – là cơ sở ñể chọn test hậu kiểm “Post Hoc Multiple Comparision”.
Dùng “One way ANOVA (Post Hoc Multiple Comparision) chỉ ra sự
khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các cặp giá trị trung bình tỷ lệ hạ glucose máu (%).
22
2.2.3. Nghiên cứu về thành phần hóa học
2.2.3.1. Phương pháp chiết xuất
Ngoài quá trình chiết xuất dược liệu tạo dịch chiết toàn phần và chiết xuất phân ñoạn lỏng - lỏng ñã ñược trình bày ở mục 2.2.1, quá trình chiết xuất dược liệu còn sử dụng phương pháp chiết pha rắn.
Chiết pha rắn ñược tiến hành trên cột sắc ký thủy tinh có kích cỡ khác nhau tùy thuộc vào lượng mẫu ñem chiết. Pha tĩnh hay sử dụng là silica gel pha thuận (Silica gel 60, 0,040 - 0,063 mm (230 - 400 mesh ASTM), Merck). Cao dược liệu ñược tẩm với lượng vừa ñủ silica gel rồi thực hiện cô loại dung môi thu ñược bột khô tơi. Chuẩn bị cột: cột sắc ký ñược rửa sạch, tráng bằng methanol, ñể khô tự nhiên. Lót bông ở ñáy cột và cố ñịnh chắc chắn trên giá. Cho silicagel pha thuận lên cột sao cho bề dày lớp silicagel khoảng 1 cm, sau
ñó ñưa lượng chất ñã tẩm silicagel nói trên lên cột, gõ nhẹñể bột phân bốñều. Sau ñó rửa giải bằng các hệ dung môi có ñộ phân cực tăng dần [14].
2.2.3.2. Phương pháp phân lập
Quá trình phân lập sử dụng phương pháp sắc ký cột với các cơ chế chủ
yếu là cột hấp phụ, cột trao ñổi ion và cột lọc qua gel. Sắc ký lớp mỏng ñược sử dụng ñể theo dõi quá trình rửa giải.
Thực hiện với bản mỏng tráng sẵn silica gel pha thuận (TLC-Silica gel 60 F254, Merck) và pha ñảo (RP18, Merck). Các chất ñược phát hiện bằng ñèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 366 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% (v/v) pha trong ethanol phun ñều lên bản mỏng rồi sấy ở nhiệt ñộ
cao trong vài phút cho ñến khi hiện màu [7].
Phương pháp nhồi cột ướt ñược sử dụng chủ yếu ñối với tất cả các loại sắc ký cột [7].
2.2.3.3. Phương pháp xác ñịnh cấu trúc
Việc xác ñịnh cấu trúc ñược thực hiện thông qua phân tích dữ liệu phổ
23
luận ñược khẳng ñịnh sau khi giải phổ và so sánh với chất tham khảo trong các nghiên cứu ñã ñược công bố.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân ñược ño gồm có NMR một chiều (1H-NMR,
13C-NMR, DEPT), thực hiện trên máy Bruker Avance AM500 FT-NMR tại Viện Hoá học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam với chất chuẩn nội là tetramethyl silan (TMS).
24
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Kết quả chiết xuất dược liệu và chiết phân ñoạn lỏng-lỏng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Dịch chiết thu ñược sau khi gộp dịch chiết 3 lần ngâm ở nhiệt ñộ phòng bột cành mang lá của cây Dây thìa canh lá to ñem cô quay ở áp suất giảm ở
50oC thu ñược cắn dạng cao ñặc, khối lượng là 585,8g, hàm ẩm cắn thu ñược là 12,84%.
Tiến hành chiết phân ñoạn lỏng-lỏng thu ñược các cắn phân ñoạn có khối lượng tương ứng: n-hexan (H, 65,5g), chloroform (C, 29,85g), ethyl
acetat (E, 36,05g), n-buthanol (B, 181,1g), và nước (N, 218,7g).
Sơ ñồ chiết xuất dược liệu và chiết phân ñoạn lỏng-lỏng ñược thể hiện ở
25
Hình 3.1. Sơñồ chiết xuất dược liệu và chiết phân ñoạn lỏng-lỏng
Dịch còn lại Dịch còn lại Dịch còn lại Dịch còn lại Cắn n-hexan (65,5g) Cắn Chloroform (29,85g) Cắn Ethyl acetat (36,05g) Cắn n-buthanol (181,1g) Cắn Nước (218,7g) n-hexan, lắc, gạn Chloroform , lắc, gạn Ethyl acetat, lắc, gạn n-buthanol, lắc, gạn Cô quay Áp suất giảm Bột dược liệu (5kg) Dịch chiết MeOH Cắn toàn phần Dịch nước MeOH, nhiệt ñộ phòng Bã Dược liệu Cô quay, áp suất giảm
26
3.2. Kết quả nghiên cứu về tác dụng hạñường huyết
Bốn lô chuột có mức hạ glucose máu khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với lô chứng âm gồm: lô chứng dương, lô uống cao chiết toàn phần methanol, phân ñoạn ethyl acetat và buthanol.
Khả năng làm hạ glucose máu của lô chứng dương khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với các lô n-hexan, chloroform và nước; không có ý nghĩa (p>0,05) so với các lô methanol, ethyl acetat và buthanol.
Mức hạ glucose máu của các lô uống cao dịch chiết toàn phần methanol, cao phân ñoạn ethyl acetat, buthanol có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với các lô chuột uống hỗn dịch cao phân ñoạn n-hexan, chloroform và cắn nước. Trong 5 phân ñoạn nghiên cứu, 2 phân ñoạn ethyl acetat và buthanol thể
hiện khả năng hạ ñường huyết mạnh hơn 3 phân ñoạn còn lại (phân ñoạn n- hexan, chloroform và cắn nước) với mức hạ glucose máu lần lượt là 42,38% và 38,43%.
Bảng giá trị chỉ số ñường huyết ngày 0 và ngày 7 của mỗi con chuột
ñược trình bày ở phụ lục 3. Sự thay ñổi glucose huyết của chuột sau 7 ngày và sự khác biệt về giá trị trung bình tỷ lệ hạ glucose máu (%) giữa 8 lô chuột
27
Bảng 3.1. Sự thay ñổi glucose máu của các lô chuột thí nghiệm Lô chuột (*) Chỉ số glucose máu
(mmol/l) Tỷ lệ hạ glucose máu (%) P value so với lô (**) 1 2 3 4 5 6 7 8
Số Tên Ngày 0 Ngày 7 Âm Dương Me H C E B W
1 Âm 12,32±1,10 13,37±2,05 -9,17±18,68 2 Dương 13,23±3,09 7,79±1,07 38,77±14,00 + 3 Methanol 12,96±4,32 7,51±2,13 38,88±19,02 + 0 4 n-hexan 13,80±2,13 12,30±2,13 11,08±1,62 0 + 0 5 Chloroform 13,65±1,15 12,15±1,15 11,05±0,89 0 + 0 0 6 Ethyl acetat 12,74±2,98 7,11±0,72 42,38±9,68 + 0 0 + + 7 n-buthanol 13,08±1,13 7,99±1,05 38,43±10,28 + 0 0 + + 0 8 HD Nước 13,89±1,63 17,01±1,92 -23,86±13,52 0 + + + + + +
Ghi chú: (*) Âm: Chứng âm (chuột uống dung dịch NaCMC 0,5%), Dương: Chứng dương (chuột uống gliclazid 20 mg/kg), Methanol (Me): Lô chuột uống hỗn dịch cao chiết toàn phần Methanol, n-hexan (H): Lô chuột uống hỗn dịch cao phân ñoạn n-hexan, Chloroform (C): Lô chuột uống hỗn dịch cao phân ñoạn Chloroform, Ethyl acetat (E): Lô chuột uống hỗn dịch cao phân ñoạn Ethyl acetat, n- buthanol (B): Lô chuột uống hỗn dịch cao phân ñoạn n-buthanol, HD Nước (W): Lô chuột uống cao phân ñoạn nước.
(**)+: p<0,05: mức giảm glucose máu giữa 2 lô khác biệt có ý nghĩa thống kê, 0: p>0,05: mức giảm glucose máu giữa 2 lô khác biệt không có ý nghĩa thống kê.
28
3.3. Kết quả nghiên cứu về thành phần hoá học
3.3.1. Quá trình phân lập
Cắn phân ñoạn E ñược hòa tan vào lượng methanol tối thiểu, sau ñó tẩm với silicagel pha thường, tỷ lệ khối lượng 1:1. Khối silicagel ẩm này ñược quay cất thu hồi dung môi ñến thể chất tơi mịn. Bột khô thu ñược dùng ñể
chiết pha rắn trong bước tiếp theo.
Chuẩn bị cột: cột sắc ký ñược rửa sạch, tráng bằng methanol, ñể khô tự
nhiên. Lót bông ở ñáy cột và cố ñịnh chắc chắn trên giá. Cho silicagel pha thuận lên cột sao cho bề dày lớp silicagel khoảng 1 cm, sau ñó ñưa lượng chất (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
ñã tẩm silicagel nói trên lên cột, gõ nhẹñể bột phân bốñều.
Rửa giải gradient bằng n-hexan–aceton (100:0, 40:1, 20:1, 10:1 và
0:100, v/v, mỗi hệ 1,5 lít). Hứng các phân ñoạn, cô quay cất thu hồi dung môi thu ñược các cắn dạng cao ñặc ký hiệu lần lượt từ E1 ñến E5.
Phân ñoạn E1 ñược triển khai trên sắc ký cột pha thuận với hệ dung môi
n-hexan–ethyl acetat (40:1, v/v, 1,5 lít) thu ñược 2 phân ñoạn ký hiệu là E1A và E1B.
Phân ñoạn E1A ñược tiếp tục phân lập trên cột sắc ký pha thuận với hệ
dung môi n-hexan–chloroform (20:1, v/v, 1,5 lít) thu ñược các phân ñoạn
ñược ñánh số từ E1A1 ñến E1A7.
Phân ñoạn E1A6 với các cụm vết xuất hiện khá rõ ñược chọn tiếp tục phân lập trên cột sắc ký pha ñảo với hệ dung môi aceton–methanol–nước (1:1:0,2, v/v/v, 1,5 lít) thu ñược các phân ñoạn ñược ñánh dấu từ E1A6A ñến E1A6E. Phân ñoạn E1A6E ñược ñưa lên cột sắc ký pha thuận với hệ dung môi chloroform–methanol (5:1, v/v, 1,5 lít) thu ñược hợp chất 1 (ký hiệu là
GLHE9). Kiểm tra trên sắc ký bản mỏng pha thuận với 2 hệ dung môi n-
hexan–ethyl acetat (6:1, v/v) và n-hexan–ethyl acetat–methanol (10:1:0,1,
29
methanol–nước (5:1:0,1, v/v/v) nhận thấy ñây là một chất sạch, tiến hành ño phổñể xác ñịnh cấu trúc.
Phân ñoạn E1A7 ñược ñưa lên cột sắc ký pha thuận với hệ dung môi n- hexan–ethyl acetat (10:1, v/v, 1,5 lít) thu ñược hợp chất 2 (ký hiệu là
GLHE7). Kiểm tra trên sắc ký bản mỏng pha thuận với 2 hệ dung môi chloroform–methanol (6:1, v/v) và n-hexan–aceton (3:1, v/v), ñồng thời trên sắc ký bản mỏng pha ñảo với hệ dung môi aceton–nước (15:1, v/v) nhận thấy
ñây là một chất sạch, tiến hành ño phổñể xác ñịnh cấu trúc.
Phân ñoạn E2 ñược triển khai trên sắc ký cột pha thuận với hệ dung môi
n-hexan–ethyl acetat–methanol (7:1:1, v/v/v, 1,5 lít) thu ñược các phân ñoạn ký hiệu là E2A và E2H.
Phân ñoạn E2H ñược ñưa lên cột Shephadex LH20, giải ly bằng dung môi methanol 90% thu ñược hợp chất 3 (ký hiệu là GLHE2). Kiểm tra trên sắc ký bản mỏng pha thuận với 2 hệ dung môi chloroform–methanol (10:1, v/v) và n-hexan–aceton (5:1, v/v), ñồng thời trên sắc ký bản mỏng pha ñảo với hệ dung môi aceton–nước (5:1, v/v) nhận thấy ñây là một chất sạch, tiến hành ño phổñể xác ñịnh cấu trúc.
Sơ ñồ chiết pha rắn cắn ethyl acetat ñược thể hiện ở hình 3.2, sơ ñồ phân lập các hợp chất 1 (GLHE9) và hợp chất 2 (GLHE7) từ phân ñoạn E1 ñược thể hiện ở hình 3.3, sơ ñồ phân lập hợp chất 3 (GLHE2) từ phân ñoạn E2
30
Hình 3.2. Sơñồ chiết pha rắn phân ñoạn Ethyl acetat E n-hexan 100% n-hexan:aceton (40:1) n-hexan:aceton (20:1) n-hexan:aceton (10:1) E1 E2 E3 E4 E5 aceton 100% Chiết pha rắn
31
Hình 3.3. Sơñồ phân lập hợp chất 1 (GLHE9) và hợp chất 2 (GLHE7) từ phân ñoạn E1
SKC pha ñảo Aceton:methanol:nước (1:1:0,2)
E1A6A E1A6B E1A6C E1A6D E1A6E
SKC pha thuận n-hexan: ethyl acetat (40:1)
E1
SKC pha thuận n-hexan: chloroform (20:1)
E1A E1B (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
E1A1 E1A2 E1A3 E1A4 E1A5 E1A6 E1A7
SKC pha thuận
Chloroform:methanol (5:1)
Hợp chất 1
GLHE9 HGLHE7 ợp chất 2
SKC pha thuận
32
Hình 3.4. Sơñồ phân lập hợp chất 3 (GLHE2) từ phân ñoạn E2
E2A E2B E2C E2E E2F E2G E2H
Hợp chất 3 (GLHE2) E2D
E2
SKCpha thuận n-hexan:ethylacetat:methanol (7:1:1)
33
3.3.2. Nhận dạng cấu trúc các hợp chất phân lập ñược
3.3.2.1. Hợp chất 1 (GLHE9)
Hợp chất 1 (ký hiệu là GLHE9) ñược tách ra dưới dạng bột kết tinh trắng hình kim, khi kiểm tra bằng sắc ký bản mỏng pha thuận với dung môi n- hexan:ethyl acetat (10:1, v/v) hiện vết màu hồng với thuốc thử H2SO4 10%, Rf = 0,47.
Phổ 1H-NMR của GLHE9 chỉ ra tín hiệu singlet ñặc trưng của 7 nhóm methyl tại δH 2,13, 2,04, 0,98, 0,87 (x2), 0,85 (x2); 1 tín hiệu proton của nhóm oxymethin tại δH 4,48 (dd, 10,0; 6 Hz). Từ giá trị của hằng số tương tác J suy ra proton của nhóm oxymethin phải có cấu hình α (chiếm vị trí axial trong