Theo Hội Đái tháo đường Hoa Kỳ năm 2004 đã định nghĩa “Đái tháo
đường là một nhĩm các bệnh lý chuyển hĩa đặc trưng bởi tăng glucose huyết do khiếm khuyết tiết insulin, khiếm khuyết hoạt động insulin, hoặc cả hai” [52]. Một số lượng lớn các tác nhân dược lý và mơ hình động vật được sử
dụng trong nghiên cứu để tìm hiểu cơ chế bệnh sinh, biến chứng, ảnh hưởng di truyền và mơi trường; đồng thời tìm kiếm, sàng lọc các thuốc mới điều trị
bệnh Đái tháo đường [52]. Những năm gần đây, bệnh Đái tháo đường đã được nghiên cứu dựa trên mơ hình các động vật biến đổi gen, sử dụng hĩa chất, biện pháp phẫu thuật, virus và hoocmon gây Đái tháo đường. Ở thời điểm hiện tại, phương pháp tối ưu và nhanh nhất để tạo mơ hình Đái tháo đường trên thực nghiệm là sử dụng hĩa chất, virus và chuột bị Đái tháo đường bẩm sinh do di truyền [52]. Trong đĩ sử dụng hĩa chất là phương pháp cĩ thể áp dụng được trong các điều kiện thí nghiệm cơ bản. Và cho đến nay, tác nhân hĩa học được sử dụng phổ biến gây bệnh Đái tháo đường là alloxan và streptozotocin (STZ) [52]. Về mặt cơ chế, alloxan phá hủy tế bào β của đảo tụy gây nên tình trạng Đái tháo đường phụ thuộc insulin ở những động vật thực nghiệm với những đặc tính tương tự nhưĐái tháo đường tuýp 1 ở người. Cịn STZ thì phá hủy một phần đảo tụy hoặc ức chế khả năng tiết insulin các tế bào β của đảo tụy tùy theo liều sử dụng để gây Đái tháo đường trên động vật thí nghiệm tương tự tuýp 1 hoặc tuýp 2 ở người [52], và dần được sử dụng thay thế cho alloxan trong các thử nghiệm làm tăng đường huyết.
Theo khảo sát và nhận định của nhiều tác giả, tiêm STZ liều 150 mg/kg khối lượng chuột làm phá hủy khơng hồn tồn tiểu đảo tụy, gây được tình trạng glucose huyết tăng cao và ổn định trong nhiều ngày [8], [11], [18]. Trong các nghiên cứu về tác dụng hạđường huyết của các lồi trong chi
43
chuột, pha vào dung dịch đệm citrat pH 4 – 4,5, sau đĩ tiêm màng bụng [9], [15], [16]. Do đĩ, trong nghiên cứu này, chúng tơi lựa chọn mơ hình chuột bị
gây Đái tháo đường bởi STZ liều 150 mg/kg khối lượng chuột đểđánh giá tác dụng hạđường huyết của Dây thìa canh lá to.
Một nghiên cứu khảo sát sự phụ thuộc giữa liều dùng dịch chiết
Gymnema sylvestre (Retz) R. Br. Ex Schult và tác dụng hạ glucose máu trên mơ hình chuột tăng glucose máu thực nghiệm bởi STZ, đã chọn liều 10g dược liệu khơ/kg khối lượng chuột làm liều dùng tối ưu. Và cũng trong nghiên cứu này, sau khi áp dụng liều đã chọn, tiến hành so sánh một số mẫu các lồi thuộc chi Gymnema R.Br., lồi Gymnema latifolium Wall ex. Wight với 4 mẫu thu hái ở các địa điểm khác nhau cĩ tác dụng tương đương với gliclazid 20 mg/kg [15]. Do điều kiện thực hiện đề tài cĩ hạn, nên việc dị liều dịch chiết tồn phần cũng như cắn phân đoạn của Gymnema latifolium Wall ex. Wight chưa được thực hiện. Vì vậy, đề tài quyết định lựa chọn liều 10g dược liệu khơ/kg khối lượng chuột để tính lượng cắn tồn phần cũng như cắn phân
đoạn tương ứng, và bước đầu đánh giá lựa chọn được phân đoạn cĩ tác dụng
ưu thế. Đồng thời đề xuất hướng nghiên cứu thăm dị liều dùng các cắn tồn phần cũng như cắn phân đoạn của Gymnema latifolium Wall ex. Wight cho các nghiên cứu về sau.
4.1.2. Tác dụng hạđường huyết của các phân đoạn nghiên cứu
Trước đây, Phạm Văn Hải đã đánh giá tác dụng hạ glucose máu của dịch chiết ethanol Dây thìa canh lá to sau 10 ngày trên mơ hình chuột bị gây Đái tháo đường bằng STZ thu được kết quả mức hạ glucose máu là 40,84% [9]. Trong nghiên cứu này, mức hạ glucose máu của cắn tồn phần methanol sau 7 ngày là 38,88%. Tuy điều kiện nghiên cứu và dung mơi chiết xuất dược liệu là khác nhau, nhưng kết quả của luận văn thu được đã một lần nữa khẳng định tác dụng hạđường huyết của dịch chiết Dây thìa canh lá to.
44
Trong nghiên cứu này, lơ chứng dương cho kết quả mức hạ glucose máu của chuột sau 7 ngày uống thuốc gliclazide (một thuốc đã biết cĩ tác dụng để
tham chiếu với các lơ thử) là 38,77% khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với lơ chứng âm. Điều này thể hiện được tính đúng đắn của mơ hình nghiên cứu, 8 lơ chuột trong cùng điều kiện thực nghiệm thì lơ chuột uống thuốc gliclazide với liều 20 mg/kg cho đáp ứng tốt.
Trong các cắn phân đoạn, chỉ cĩ 2 lơ ethyl acetat và buthanol làm hạ
glucose máu khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với lơ chứng âm.
Đồng thời 2 lơ này cũng làm hạ glucose máu khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với 3 lơ cịn lại. So sánh mức hạ glucose máu của 2 lơ ethyl acetat (42,38%) và buthanol (38,43%) với lơ tồn phần methanol (38,88%). Tất cả
những điều này chứng tỏ 2 phân đoạn ethyl acetat và buthanol tập trung hầu hết các chất cĩ khả năng gây hạđường huyết của Dây thìa canh lá to.
Trương Thị Tâm đã từng đánh giá tác dụng hạ đường huyết các dịch chiết phân đoạn Dây thìa canh sau 5 ngày trên mơ hình chuột bị gây đái tháo
đường bằng STZ cho kết quả 2 phân đoạn cĩ tác dụng là ethyl acetat và nước [13]. Như vậy, phân đoạn ethyl acetat của Dây thìa canh và Dây thìa canh lá to đều cho thấy tác dụng hạ đường huyết tốt. Trong khi đĩ, phân đoạn n-
hexan và chloroform cĩ tác dụng hạ đường huyết khơng cĩ ý nghĩa. Thành phần hĩa học được quan tâm gây hạ đường huyết của chi Gymnema R.Br. là các saponin cĩ độ phân cực cao do gắn với đường, nên các phân đoạn chiết bằng dung mơi cĩ độ phân cực thấp như n-hexan và chloroform sẽ cĩ rất ít các saponin này, các phân đoạn chiết bằng dung mơi cĩ độ phân cực cao như
buthanol và nước sẽ cĩ nhiều saponin hơn. Kết quả nghiên cứu của luận văn cho thấy 2 lơ n-hexan và chloroform làm hạ glucose máu khơng cĩ ý nghĩa thống kê so với chứng âm (p>0,05) tương đối hợp lý so với giải thích ở trên.
45
buthanol Dây thìa canh lá to do chứa nhiều các chất thuộc nhĩm saponin cĩ thể là một giảđịnh hợp lý.
Việc lựa chọn được phân đoạn cĩ tác dụng hạđường huyết vượt trội hơn các phân đoạn khác sẽ gĩp phần định hướng cho quá trình phân lập các hoạt chất đi từ các phân đoạn này. Mặt khác, trong sản xuất cơng nghiệp, việc lựa chọn cắn phân đoạn cĩ tác dụng so với cắn tồn phần sẽ đưa đến những ảnh hưởng nhất định đến năng suất và hiệu quả kinh tế. Phân đoạn ethyl acetat và buthanol cĩ mức hạ glucose máu khác nhau khơng cĩ ý nghĩa thống kê, tuy nhiên trong điều kiện cho phép, luận văn đã tiến hành chiết tách, phân lập các hợp chất phân đoạn ethyl acetat trước.
4.2. Bàn luận về quá trình nghiên cứu thành phần hĩa học
4.2.1. Quá trình chiết xuất, phân lập
Bước đầu tiên trong quá trình chiết xuất là lựa chọn được dung mơi và các điều kiện chiết xuất liên quan. Trong nghiên cứu này, dung mơi methanol tuyệt đối được lựa chọn để thu dịch chiết thơ từ dược liệu bằng phương pháp ngâm ở nhiệt độ phịng. Methanol cĩ khả năng xuyên thấm qua màng tế bào thực vật, cũng như cĩ thể tạo cầu nối liên phân tử với các nhĩm phân cực khác, do đĩ methanol là dung mơi cĩ thể chiết được các hợp chất cĩ độ phân cực mạnh, vừa và yếu [12], từđĩ giúp chiết kiệt hoạt chất cĩ trong dược liệu. Hơn nữa, methanol cĩ giá thành rẻ, khơng quá dễ cháy, khơng quá dễ bay hơi và độ nhớt thấp. Phương pháp ngâm là phương pháp chiết xuất đơn giản, khơng địi hỏi thiết bị chiết xuất đắt tiền, hiệu suất chiết lại cao nếu tiến hành chiết nhiều lần. Quá trình ngâm chiết được tiến hành 3 lần, mỗi lần kéo dài 7 ngày với mục đích bảo đảm thời gian tiếp xúc giữa chất tan và dung mơi nhằm chiết được lượng hoạt chất tối đa.
Gộp các dịch chiết thu được và tiến hành cất quay thu hồi hết methanol tạo thành cao dược liệu tồn phần cĩ dạng sệt. Cao này được phân tán vào nước và tiếp tục giai đoạn tiếp theo là chiết phân đoạn lỏng – lỏng. Với mỗi
46
loại dung mơi, việc chiết được tiến hành nhiều lần. Tùy vào tỉ trọng so sánh giữa dung mơi và nước để xác định pha hữu cơ nằm ở trên hay dưới lớp nước. Quá trình phân lập hoạt chất tinh khiết từ lồi Gymnema latifolium Wall ex.
Wight đã trải qua nhiều cơng đoạn khác nhau và sử dụng phối kết hợp nhiều phương pháp chiết xuất và sắc ký như chiết xuất phân đoạn lỏng - lỏng với độ
phân cực của dung mơi tăng dần, chiết pha rắn, sắc ký cột với chất hấp phụ là silicagel pha thuận và pha đảo, sắc ký cột Sephadex LH 20, sắc ký lớp mỏng pha thường, pha đảo... Đây là các phương pháp thường quy và kinh điển được sử dụng trong phịng thí nghiệm. Cho đến nay, đây cũng là các phương pháp
được sử dụng hiệu quả trong nghiên cứu chiết tách các hợp chất từ thiên nhiên. Cơng đoạn quan trọng trong quá trình phân lập là xác định được hệ
dung mơi cĩ khả năng phân tách tối ưu các phân đoạn trên cột sắc ký. Sắc ký lớp mỏng đĩng vai trị định hướng, hệ dung mơi phân tách tốt trên sắc ký lớp mỏng sẽđược lựa chọn để triển khai trên sắc ký cột.
Các hợp chất phân lập được trước khi tiến hành đo phổ phải đảm bảo đạt
độ tinh khiết cần thiết. Tiến hành kiểm chứng bằng sắc ký lớp mỏng ít nhất với 2 hệ dung mơi pha thuận và 1 hệ dung mơi pha đảo, sau khi phun thuốc thử và đốt nĩng từ từ, hợp chất tinh khiết thể hiện trên bản mỏng là vết cĩ màu sắc đồng đều, hình dạng tương đối trịn, các mép viền của vết tương đối rõ nét, đồng thời khơng cĩ vết phụ nào xuất hiện trên hay dưới, trước hay sau, chồng lấp lên vết chính. Theo phương pháp này đã nhận định được 3 hợp chất GLHE2, GLHE7, GLHE9 đạt đủđộ tinh khiết cần thiết đểđo phổ.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều là những phương tiện hiện đại hiện nay trong nghiên cứu cấu trúc hợp chất tự nhiên, cung cấp những thơng tin chi tiết, chính xác, cho phép xác định cấu trúc phân tử của hợp chất hữu cơ [12]. Trên thực tế, dựa vào kinh nghiệm của người giải phổ
và mục đích tiết kiệm kinh phí, sau khi đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) nếu đã giải quyết được cấu trúc của chất
47
thì khơng cần tiến hành đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều nữa. Trong luận văn này, sau khi kết hợp các dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) đồng thời đối chiếu với các dữ liệu phổ
chuẩn đã cơng bố trên thế giới đã cho phép xác định GLHE2 là Stigmasterol,
GLHE7 là Lupeol acetat, GLHE9 là 3β-acetoxy – 22,23,24,25,26,27 – hexanordammaran – 20 – one. Đây là những cơng bố đầu tiên về các hợp chất này được phân lập từ lồi Gymnema latifolium Wall ex. Wight.
4.2.2. Các chất phân lập được
Hợp chất 1: 3β-acetoxy-22,23,24,25,26,27-hexanordammaran-20-on
là dẫn chất nordammaran triterpenoid, đã từng được phân lập trước đĩ từ lồi
Ficus pumila L. [29]. Sản phẩm thủy phân liên kết ester của hợp chất 1 là 3β- hydroxy-22,23,24,25,26,27-hexanordammaran-20-one đã được phân lập từ
lồi Euphorbia subina [39]. Một hợp chất khác cĩ cấu trúc tương tựhợp chất 1 là 3β-O-acetyl-12β-hydroxy-23,24,25,26,27-hexanordammaran-20-on cùng với các trinordammaran và octanordammanrane được phân lập từ lồi
Viburnum mongolicum được thử nghiệm invitro cho thấy cĩ khả năng gây độc tế bào trên 7 dịng tế bào khối u và chống lại các gốc tự do [54]. Tuy nhiên về
tác dụng dược lý của riêng hợp chất 1 thì vẫn chưa cĩ bất kì cơng bố nào do
đĩ cĩ thểđặt ra hướng nghiên cứu tiếp theo về tác dụng của hợp chất này, đặc biệt là tác dụng hạđường huyết để cĩ thể kết luận sự cĩ mặt của hợp chất này cĩ hỗ trợ cho khả năng làm hạđường huyết của dược liệu hay khơng. Và nếu
đây là hoạt chất mang lại tác dụng thì cần phải tiến hành định lượng để đánh giá xem hàm lượng của nĩ cĩ ý nghĩa trong thực tế sử dụng hay khơng.
Hợp chất 2: Lupeol acetat là triterpenoids nhĩm lupan, đã được phân lập từ nhiều lồi như Phoenix dactylifera, Alstonia scholaris, Mangifera indica, Thevetia neriifolia, Elephantopus scaber [28], Himatanthus drasticus
48
Lupeol acetat là dạng muối của lupeol cũng là một triterpenoid đã được phân lập từ rất nhiều lồi thực vật. Trong cùng chi Gymnema R.Br., Lupeol đã
được phân lập từ Gymnema sylvestre (Retz) R. Br. Ex Schult [40]. Trong suốt 3 thập kỉ qua, các tác dụng sinh học của Lupeol đã được các nhà khoa học nghiên cứu bao gồm: kháng viêm, điều trị bệnh thận, giải độc gan, kháng khuẩn, viêm khớp, bệnh tim mạch, bệnh ung thư và hạđường huyết [43].
Trong tài liệu bách khoa tồn thư các cây thuốc dân tộc Trung Quốc, Lupeol acetat được phân lập từ các lồi Phoenix dactylifera, Alstonia scholaris, Mangifera indica, Thevetia neriifolia, Elephantopus scaber cĩ tác dụng làm hạ đường huyết, chống ung thư và ức chế hoạt động chống lại các NFAT (yếu tố nhân của các tế bào T hoạt hĩa) [28]. Lupeol acetat phân lập từ
lồi Himatanthus drasticus được thử nghiệm in vitro và in vivo trên các mơ
hình viêm, chất đối chứng dương là naloxon cho thấy hợp chất này cĩ tác dụng chống viêm cĩ thể liên quan đến hệ thống opioid [32]. Lupeol acetat phân lập từ rễ của lồi Alstonia boonei cũng đã được thử nghiệm in vivo trên mơ hình chuột gây đau bởi CFA cho thấy tác dụng làm giảm đau tốt [24]. Ngồi ra, Lupeol acetat cịn một số tác dụng khác như kháng khuẩn [25], trung hịa nọc độc rắn [27] và ức chế sự phát triển của khối u trong ung thư da giai đoạn 2 ở chuột [30].
Đặc biệt, Lupeol và Lupeol acetat đều cho thấy khả năng làm hạ đường huyết [22]. Do đĩ, việc phân lập được Lupeol acetat trong Dây thìa canh lá to
đã gĩp phần vào giải thích và dự đốn được cơ chế tác dụng hạ đường huyết của dược liệu.
Hợp chất 3: Stigmasterol là một phytosterol được phân lập đầu tiên vào năm 1906 từ lồi Physostigma venenosum. Sau đĩ, Stigmasterol được phân lập từ nhiều lồi khác. Trong cùng chi Gymnema R.Br., Stigmasteol đã
được phân lập từ Gymnema sylvestre (Retz) R. Br. Ex Schult [40]. Đây là một hợp chất cĩ mặt khá phổ biến trong thực vật.
49
Stigmasterol là nguyên liệu để tổng hợp, bán tổng hợp trong cơng nghệ