Cắn phân ñoạn E ñược hòa tan vào lượng methanol tối thiểu, sau ñó tẩm với silicagel pha thường, tỷ lệ khối lượng 1:1. Khối silicagel ẩm này ñược quay cất thu hồi dung môi ñến thể chất tơi mịn. Bột khô thu ñược dùng ñể
chiết pha rắn trong bước tiếp theo.
Chuẩn bị cột: cột sắc ký ñược rửa sạch, tráng bằng methanol, ñể khô tự
nhiên. Lót bông ở ñáy cột và cố ñịnh chắc chắn trên giá. Cho silicagel pha thuận lên cột sao cho bề dày lớp silicagel khoảng 1 cm, sau ñó ñưa lượng chất
ñã tẩm silicagel nói trên lên cột, gõ nhẹñể bột phân bốñều.
Rửa giải gradient bằng n-hexan–aceton (100:0, 40:1, 20:1, 10:1 và
0:100, v/v, mỗi hệ 1,5 lít). Hứng các phân ñoạn, cô quay cất thu hồi dung môi thu ñược các cắn dạng cao ñặc ký hiệu lần lượt từ E1 ñến E5.
Phân ñoạn E1 ñược triển khai trên sắc ký cột pha thuận với hệ dung môi
n-hexan–ethyl acetat (40:1, v/v, 1,5 lít) thu ñược 2 phân ñoạn ký hiệu là E1A và E1B.
Phân ñoạn E1A ñược tiếp tục phân lập trên cột sắc ký pha thuận với hệ
dung môi n-hexan–chloroform (20:1, v/v, 1,5 lít) thu ñược các phân ñoạn
ñược ñánh số từ E1A1 ñến E1A7.
Phân ñoạn E1A6 với các cụm vết xuất hiện khá rõ ñược chọn tiếp tục phân lập trên cột sắc ký pha ñảo với hệ dung môi aceton–methanol–nước (1:1:0,2, v/v/v, 1,5 lít) thu ñược các phân ñoạn ñược ñánh dấu từ E1A6A ñến E1A6E. Phân ñoạn E1A6E ñược ñưa lên cột sắc ký pha thuận với hệ dung môi chloroform–methanol (5:1, v/v, 1,5 lít) thu ñược hợp chất 1 (ký hiệu là
GLHE9). Kiểm tra trên sắc ký bản mỏng pha thuận với 2 hệ dung môi n-
hexan–ethyl acetat (6:1, v/v) và n-hexan–ethyl acetat–methanol (10:1:0,1,
29
methanol–nước (5:1:0,1, v/v/v) nhận thấy ñây là một chất sạch, tiến hành ño phổñể xác ñịnh cấu trúc.
Phân ñoạn E1A7 ñược ñưa lên cột sắc ký pha thuận với hệ dung môi n- hexan–ethyl acetat (10:1, v/v, 1,5 lít) thu ñược hợp chất 2 (ký hiệu là
GLHE7). Kiểm tra trên sắc ký bản mỏng pha thuận với 2 hệ dung môi chloroform–methanol (6:1, v/v) và n-hexan–aceton (3:1, v/v), ñồng thời trên sắc ký bản mỏng pha ñảo với hệ dung môi aceton–nước (15:1, v/v) nhận thấy
ñây là một chất sạch, tiến hành ño phổñể xác ñịnh cấu trúc.
Phân ñoạn E2 ñược triển khai trên sắc ký cột pha thuận với hệ dung môi
n-hexan–ethyl acetat–methanol (7:1:1, v/v/v, 1,5 lít) thu ñược các phân ñoạn ký hiệu là E2A và E2H.
Phân ñoạn E2H ñược ñưa lên cột Shephadex LH20, giải ly bằng dung môi methanol 90% thu ñược hợp chất 3 (ký hiệu là GLHE2). Kiểm tra trên sắc ký bản mỏng pha thuận với 2 hệ dung môi chloroform–methanol (10:1, v/v) và n-hexan–aceton (5:1, v/v), ñồng thời trên sắc ký bản mỏng pha ñảo với hệ dung môi aceton–nước (5:1, v/v) nhận thấy ñây là một chất sạch, tiến hành ño phổñể xác ñịnh cấu trúc.
Sơ ñồ chiết pha rắn cắn ethyl acetat ñược thể hiện ở hình 3.2, sơ ñồ phân lập các hợp chất 1 (GLHE9) và hợp chất 2 (GLHE7) từ phân ñoạn E1 ñược thể hiện ở hình 3.3, sơ ñồ phân lập hợp chất 3 (GLHE2) từ phân ñoạn E2
30
Hình 3.2. Sơñồ chiết pha rắn phân ñoạn Ethyl acetat E n-hexan 100% n-hexan:aceton (40:1) n-hexan:aceton (20:1) n-hexan:aceton (10:1) E1 E2 E3 E4 E5 aceton 100% Chiết pha rắn
31
Hình 3.3. Sơñồ phân lập hợp chất 1 (GLHE9) và hợp chất 2 (GLHE7) từ phân ñoạn E1
SKC pha ñảo Aceton:methanol:nước (1:1:0,2)
E1A6A E1A6B E1A6C E1A6D E1A6E
SKC pha thuận n-hexan: ethyl acetat (40:1)
E1
SKC pha thuận n-hexan: chloroform (20:1)
E1A E1B
E1A1 E1A2 E1A3 E1A4 E1A5 E1A6 E1A7
SKC pha thuận
Chloroform:methanol (5:1)
Hợp chất 1
GLHE9 HGLHE7 ợp chất 2
SKC pha thuận
32
Hình 3.4. Sơñồ phân lập hợp chất 3 (GLHE2) từ phân ñoạn E2
E2A E2B E2C E2E E2F E2G E2H
Hợp chất 3 (GLHE2) E2D
E2
SKCpha thuận n-hexan:ethylacetat:methanol (7:1:1)
33
