Nghiên cứu sinh khả dụng và tương quan in vitro in vivo của nhũ tương nano diclofenac dùng trong nhãn khoa

LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới: TS. Nguyễn Trần Linh DS. Đặng Thị Hiền là những người thầy đã dìu dắt tôi từ những ngày đầu làm nghiên cứu khoa học và cũng là những người trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo, giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên bộ môn Bào chế, bộ môn Vật lý – Hóa lý và bộ môn Công nghiệp Dược đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận này. Tôi cũng xin cảm ơn Ban giám hiệu, các phòng ban, các thầy cô giáo và cán bộ nhân viên trường Đại học Dược Hà Nội – những người đã dạy bảo và giúp đỡ tôi trong suốt 5 năm học tập tại trường. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, anh chị em đã dành cho tôi sự giúp đỡ và động viên quý báu trong suốt thời gian qua. Hà Nội, ngày 14 tháng 5 năm 2015 Sinh viên An Phương Hà

AN PHƯƠNG HÀ

NGHIÊN CỨU SINH KHẢ DỤNG VÀ

TƯƠNG QUAN IN VITRO – IN VIVO

CỦA NHŨ TƯƠNG NANO

DICLOFENAC DÙNG TRONG NHÃN KHOA

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2015

AN PHƯƠNG HÀ

NGHIÊN CỨU SINH KHẢ DỤNG VÀ

TƯƠNG QUAN IN VITRO – IN VIVO

CỦA NHŨ TƯƠNG NANO

DICLOFENAC DÙNG TRONG NHÃN KHOA

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

DS Đặng Thị Hiền

là những người thầy đã dìu dắt tôi từ những ngày đầu làm nghiên cứu khoa học

và cũng là những người trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo, giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên bộ môn Bào chế, bộ môn Vật lý – Hóa lý và bộ môn Công nghiệp Dược đã nhiệt tình giúp

đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận này

Tôi cũng xin cảm ơn Ban giám hiệu, các phòng ban, các thầy cô giáo và cán bộ nhân viên trường Đại học Dược Hà Nội – những người đã dạy bảo và giúp đỡ tôi trong suốt 5 năm học tập tại trường

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, anh chị em

đã dành cho tôi sự giúp đỡ và động viên quý báu trong suốt thời gian qua

Hà Nội, ngày 14 tháng 5 năm 2015

Sinh viên

An Phương Hà

Danh mục các hình vẽ, đồ thị

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1

1.1 Thông tin về dược chất diclofenac 2

1.1.1 Công thức hóa học 2

1.1.2 Đặc tính lý hóa 2

1.1.3 Tác dụng dược lí 3

1.2 Thuốc nhỏ mắt Error! Bookmark not defined 1.2.1 Định nghĩa Error! Bookmark not defined 1.2.2 Sinh khả dụng thuốc nhỏ mắt và biện pháp tăng sinh khả dụng của thuốc nhãn khoa 3

1.3 Nhũ tương nano 4

1.3.1 Định nghĩa 4

1.3.2 Một số ưu điểm của nhũ tương nano 4

1.3.4 Các nghiên cứu nhũ tương nano diclofenac đã thực hiện 5

1.4 Sinh khả dụng và tương quan in vitro – in vivo 6

1.4.1 Định nghĩa 6

1.4.2 Sinh khả dụng in vitro và phương pháp đánh giá sinh khả dụng in vitro cho thuốc dùng trong nhãn khoa 6

1.4.2.1 Định nghĩa 6

1.4.2.2 Phương pháp đánh giá sinh khả dụng in vitro cho thuốc dùng trong nhãn khoa 7

1.4.3.2 Phương pháp đánh giá sinh khả dụng in vivo cho thuốc dùng trong nhãn

khoa 8

1.4.3.3 Tính toán mức độ và tốc độ hấp thu thuốc bằng phương pháp giải tích chập10 1.5 Tương quan in vitro – in vivo Error! Bookmark not defined.1 1.5.1 Định nghĩa Error! Bookmark not defined.1 1.5.2 Phân loại mức tương quan in vitro – in vivo Error! Bookmark not defined.1 1.5.4 Thiết lập mối tương quan in vitro – in vivo Error! Bookmark not defined.2 1.5.4.1 Yêu cầu chung Error! Bookmark not defined.2 1.5.4.2 Thiết lập tương quan mức A Error! Bookmark not defined.4 1.5.5 Ứng dụng của tương quan in vitro – in vivo Error! Bookmark not defined.4 CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Nguyên liệu, thiết bị, động vật thí nghiệm 15

2.1.1 Hóa chất và nguyên liệu sử dụng 15

2.1.2 Thiết bị 15

2.1.3 Động vật thí nghiệm 16

2.2 Nội dung nghiên cứu 16

2.3 Phương pháp nghiên cứu 16

2.3.1 Phương pháp bào chế nhũ tương nano nhỏ mắt diclofenac 16

2.3.2 Phương pháp bào chế dung dịch nhỏ mắt diclofenac so sánh 17

2.3.3 Phương pháp đánh giá một số đặc tính của hệ 18

2.3.3.1 Xác định kích thước tiểu phân và phân bố kích thước tiểu phân 18

2.3.3.2 Đo thế zeta 18

2.3.5.1 Các bước tiến hành thí nghiệm 19

2.3.5.2 Tính toán các thông số dược động học 22

2.3.5.3 Mức độ giải phóng dược chất in vivo 22

2.3.6 Phương pháp xây dựng tương quan in vitro – in vivo 22

2.3.6.1 Đánh giá giải phóng dược chất in vitro 22

2.3.6.2 Xác định các điều kiện thử giải phóng dược chất in vitro (phương pháp mô hình hóa đồ thị giải phóng) 24

2.3.6.3 Thiết lập mô hình tương quan phù hợp 25

2.3.7 Ứng dụng tương quan lựa chọn công thức bao chế thích hợp 25

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 26

3.1 Đánh giá sinh khả dụng và các thông số dược động học của nhũ tương nano diclofenac trên mắt thỏ 26

3.1.1 So sánh nồng độ diclofenac trong dịch tiền phòng của nhũ tương nano và dạng dung dịch 27

3.1.2 Xây dựng đường biểu diễn mức độ giải phóng in vivo của nhũ tương nano so với dung dịch 27

3.1.3 Các thông số dược động học của nhũ tương nano diclofenac trên mắt thỏ 27

3.2 Xây dựng tương quan in vitro – in vivo 28

3.2.1 Đánh giá giải phóng dược chất in vitro 28

3.2.2 Mô hình hóa đồ thị giải phóng 30

3.2.3 Thiết lập tương quan 32

3.3 Ứng dụng tương quan lựa chọn công thức bào chế thích hợp 33

3.3.1 Thiết kế công thức 33

3.3.2 Thiết kế thí nghiệm và kết quả 34

3.3.2.1 Các biến đầu ra 34

3.3.2.2 Các biến độc lập 35

3.3.2.3 Bố trí thí nghiệm và kết quả 35

3.3.2.4 Phân tích một số yếu tố ảnh hưởng đến tỷ lệ giải phóng in vivo của NTN so với mức độ giải phóng in vivo tối đa của dung dịch (Fvivo) 36

3.3.3 Lựa chọn công thức 39

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

AD Diclofenac

AIC Tiêu chuẩn thông tin Akaike

(Akaike information criterion)

AUC Diện tích dưới đường cong

(Area under curve)

CTTƯ Công thức bào chế thích hợp

(Diode Array Detector)

FDA Cơ quan quản lý thực phẩm dược phẩm Mỹ

(Food and Drug Administration)

HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao

(High performance liquid chromatography)

IVIVC Tương quan in vitro – in vivo

kl/tt Khối lượng/thể tích

KTTP Kích thước tiểu phân

MRT Thời gian lưu trung bình

(Mean residence time)

PdI Chỉ số đa phân tán

(The United States Pharmacopeia)

in vitro 24

Bảng 3.1 Mức độ giải phóng in vivo của NTN so với dung dịch 27

Bảng 3.2 Các thông số dược động học của nhũ tương nano diclofenac trên mắt thỏ 28

Bảng 3.3 Kết quả AIC của các môi trường giải phóng với các mô hình giải phóng khác nhau 30

Bảng 3.4 Giá trị AIC theo tương quan giữa mức độ giải phóng in vitro trong các điều kiện thử giải phóng và mức độ giải phóng in vivo của dược chất 32

Bảng 3.5 Các thành phần trong công thức NTN AD 34

Bảng 3.6 Các biến định tính 35

Bảng 3.7 Các biến định lượng 35

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của các biến độc lập đến các biến phụ thuộc 36

Bảng 3.9 Kết quả luyện mạng neuron nhân tạo 37

Bảng 3.10 Thành phần công thức NTN AD lựa chọn 39

Bảng 3.11 Kết quả F vivo – tỷ lệ giải phóng in vivo của CTTƯ so với dung dịch 39

Bảng P1 Kết quả thí nghiệm và tính toán trung bình 6 lô (n=6) PL1 Bảng P2 Phần trăm dược chất giải phóng tại các thời điểm trong các môi trường

đệm phosphat pH khác nhau PL2

Bảng P3 Phần trăm dược chất giải phóng tại các thời điểm trong các môi trường

đệm phosphat pH 7,4 có chứa Tween 80 và ethanol hàm lượng khác nhau PL2

Bảng P4 Các biến phụ thuộc PL3 Bảng P5 Thiết kế thí nghiệm cho NTN AD PL3 Bảng P6 Một số đặc tính của 20 công thức thiết kế PL3 Bảng P7 Phần trăm dược chất giải phóng tại các thời điểm của 20 công thức thiết

kế PL3

Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn mức độ giải phóng in vivo của NTN so với dung dịch 27 Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn tỷ lệ DC giải phóng của NTN diclofenac trong một số

môi trường đệm phosphat pH khác nhau 29

Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn tỷ lệ DC giải phóng của NTN diclofenac trong một số

môi trường đệm phosphat pH 7,4 khác nhau 29

Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn sự giải phóng dược chất theo mô hình Weibull trong môi

trường phosphat pH 5,8 31

Hình 3.6 Mặt đáp biểu diễn ảnh hưởng của loại CDH thân nước và hàm lượng

CDH thân nước đến mức độ giải phóng in vivo của NTN so với dung dịch ở thời điểm 75 phút 37

Hình 3.7 Mặt đáp biểu diễn ảnh hưởng của loại dung môi pha dầu (IPM và

Miglyol) và hàm lượng Transcutol HP đến mức độ giải phóng in vivo của NTN so với dung dịch ở thời điểm 180 phút 38

Hình 3.8 Đồ thị biểu diễn F vivo tại các thời điểm dự đoán và thực tế 40

Hình P1 Kết quả phân bố kích thước tiểu phân mẫu NTN CTTƯ PL4 Hình P2 Kết quả thế zeta mẫu NTN CTTƯ PL5 Hình P3 Sắc đồ của dung dịch acid diclofenac chuẩn PL6 Hình P4 Sắc đồ của NTN AD CTTƯ PL6 Hình P5 Mô hình thử nghiệm kỹ thuật thẩm tách micro [39] PL7

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay, các thuốc chống viêm không steroid - NSAIDs là một nhóm dược chất quan trọng dùng cho mục đích giảm đau, chống viêm trong các bệnh về mắt Diclofenac là một dược chất điển hình thuộc nhóm này, là một dẫn chất acid phenyl acetic có ưu điểm chính không gây ra các tác dụng phụ như thuốc chống viêm không steroid khác như giảm đáp ứng miễn dịch, tăng nhãn áp và ức chế sự tái tạo của lớp biểu mô giác mạc Tuy nhiên sinh khả dụng của thuốc nhỏ mắt thường rất thấp (chỉ khoảng 1 – 3%) do tác động của cơ chế bảo vệ sinh lý của hệ thống nước mắt và bản chất cấu tạo của các lớp giác mạc

Do vậy, một số dạng bào chế đã được áp dụng như hỗn dịch, thuốc mỡ, nhũ tương với mục đích làm tăng thời gian lưu thuốc Với sự phát triển của công nghệ nano, những ưu điểm của dạng bào chế nhũ tương, và thị trường Việt nam chưa có chế phẩm thuốc nhỏ mắt NTN nào, bộ môn Bào chế đã tiến hành nghiên cứu bào chế nhũ tương nhỏ mắt diclofenac nhằm tăng tính thấm của dược chất, duy trì tác dụng kéo dài, hiệu quả và thuận tiện cho người sử dụng Hiện tại, công thức cơ bản cho chế phẩm cũng như phương pháp bào chế đã được xác định [8], [9], [11], [12]

và bước đầu đã đánh giá sinh khả dụng của nhũ tương nano nhỏ mắt diclofenac [10]

Tiếp theo những nghiên cứu trên, chúng tôi tiến hành đề tài:

“Nghiên cứu sinh khả dụng và tương quan in vitro – in vivo của nhũ tương

nano diclofenac dùng trong nhãn khoa” với các mục tiêu:

1 Đánh giá sinh khả dụng của nhũ tương nano diclofenac dùng trong nhãn khoa

2 Xây dựng tương quan in vitro – in vivo và ứng dụng tương quan để tối ưu hóa

công thức nhũ tương nano diclofenac dùng trong nhãn khoa

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Thông tin về dược chất diclofenac

1.1.1 Công thức hóa học

Hình 1.1 Công thức cấu tạo acid diclofenac [36]

1.1.2 Đặc tính lý hóa

 Tính chất vật lý

 Cảm quan: Bột kết tinh màu trắng hoặc gần trắng, hơi hút ẩm [7]

 Độ tan: Rất ít tan trong nước, độ tan trong nước ở 25oC thay đổi tùy theo giá trị pH từ 17,8 – 1771 μg/mL [32] Tan tốt trong dầu thực vật (dầu thầu dầu, dầu oliu…) [13]; không tan/hexan, toluen; ít tan/cloroform; tan tốt/methanol; tan rất tốt/dimethyl sulfoxyd, dimethyl formamid, dioxan… [44]

 Hấp thụ UV: λmax (methanol) = 285 nm; λmax (acetonitril) = 278 nm [44]

 Tính chất hóa học:

 Là một dẫn chất của anilin, diclofenac có thể bị oxy hóa

 Dung dịch trong methanol, thêm acid nitric đặc sẽ có màu đỏ nâu [5], [7]

 Dung dịch trong ethanol cho phản ứng với các dung dịch kali fericyanid, sắt (III) clorid, và acid hydrocloric sẽ cho màu xanh và có tủa [5], [7]

 Định tính:

 Dựa trên các phản ứng đặc trưng trình bày ở mục tính chất hóa học [7]

 Đo phổ hồng ngoại và sắc kí lớp mỏng: so sánh với chất chuẩn [7]

 Định lượng:

 Chuẩn độ trong môi trường khan: acid diclofenac có thể định lượng bằng dung dịch kali hydroxyd trong methanol trong môi trường cloroform [5]

1.2 Thuốc nhỏ mắt

1.2.1 Định nghĩa

Thuốc nhỏ mắt là dung dịch nước, dung dịch dầu hoặc hỗn dịch vô khuẩn của một hay nhiều hoạt chất, dùng để nhỏ vào mắt Chế phẩm cũng có thể được bào chế dưới dạng khô (bột, bột đông khô, viên nén) vô khuẩn, được hòa tan hoặc phân tán

vào một chất lỏng vô khuẩn thích hợp khi dùng [2]

Tuy nhiên, trên thực tế thuốc nhỏ mắt cũng có thể là dạng nhũ tương Ví dụ như chế phẩm RestasisTM (Allergan, Mỹ) là nhũ tương nhỏ mắt chứa cyclosporin A 0,05%; chế phẩm Refresh Dry Eye Therapy® (Allergan, Mỹ) là nhũ tương nhỏ mắt không có DC; chế phẩm Durezol™ (Sirion therapeutics, Mỹ) là nhũ tương nhỏ mắt chứa difluprednat 0,05% [20]

1.2.2 Sinh khả dụng thuốc nhỏ mắt và biện pháp làm tăng sinh khả dụng của thuốc nhỏ mắt

Sinh khả dụng thuốc nhỏ mắt thường rất thấp Chỉ có khoảng 1% - 3% lượng

DC có trong liều thuốc đã đưa vào mắt là thấm được qua giác mạc và phân bố đến nơi tác dụng tại các khoang ở trong mắt Đó là do tác động của cơ chế bảo vệ sinh

lý của hệ thống nước mắt và bản chất cấu tạo các lớp mô của giác mạc [2]

Một số biện pháp làm tăng sinh khả dụng của thuốc nhỏ mắt qui ước [2], [27]:

 Tăng thời gian lưu thuốc ở vùng trước giác mạc: hạn chế gây kích ứng mắt, chất làm tăng độ nhớt, bào chế hỗn dịch, thuốc mỡ, gel, hệ cài đặt ở mắt,…

 Tăng tính thấm của giác mạc với dược chất: sử dụng các chất làm tăng tính thấm của biểu mô giác mạc với dược chất: CDH (Tween 80, Brij…), thay đổi tính thấm của dược chất với biểu mô giác mạc (tiền thuốc)

 Hiện nay các hệ tiểu phân như: vi cầu, vi nang, hỗn dịch, nhũ tương, liposome, niosome, dendrime, tiểu phân chứa trong kính tiếp xúc…có kích thước nm đến µm sử dụng cho nhãn khoa đang được tập trung nghiên cứu nhiều, trong đó NTN với đặc điểm riêng về cấu trúc, tính chất đã được chứng minh là có khả năng kéo dài thời gian tác dụng của thuốc, tăng sinh khả dụng

và hiệu lực điều trị, giảm số lần sử dụng thuốc cho người bệnh [27], [38]

1.3 Nhũ tương nano

1.3.1 Định nghĩa

Nhũ tương là một hệ phân tán cơ học vi dị thể, được tạo bởi hai chất lỏng không đồng tan, trong đó một chất lỏng được phân tán đồng đều vào chất lỏng thứ hai (môi trường phân tán) dưới dạng các tiểu phân có đường kính từ 0,1 đến hàng chục micromet [2]

NTN (còn được gọi là nhũ tương siêu mịn, nhũ tương dưới micro), thường có KTTP từ 50-200 nm, và có chỉ số đa phân tán thấp [23], [38], [43]

1.3.2 Một số ưu điểm của nhũ tương nano

 Sử dụng đơn giản và tiện lợi [38]

 Giảm kích ứng mắt với các dược chất dễ gây kích ứng [38]

 Giảm số lần dùng thuốc trong ngày so với dạng thuốc nhỏ mắt, hạn chế tác dụng phụ và tổn thương tế bào biểu mô mắt Các tiểu phân có sức căng bề mặt nhỏ làm tăng khả năng thấm ướt, giúp hệ phân tán rộng và tăng thời gian tiếp xúc của thuốc với giác mạc [38]

 Độ ổn định cao, ít bị lên bông, kết tụ, sa lắng như các nhũ tương micro [38]

1.3.3 Các nghiên cứu nhũ tương nano diclofenac đã thực hiện

Cùng với xu hướng chung của thế giới, tại Việt nam các hệ siêu vi tiểu phân cũng đã được triển khai nghiên cứu rất nhiều Tuy nhiên, dạng nano nhũ tương nhỏ mắt chứa diclofenac chỉ mới lần đầu tiên được nghiên cứu bắt đầu ở bộ môn Bào chế - trường Đại học Dược Hà nội từ năm 2011

Đầu tiên, Vũ Ngọc Mai (2011) sử dụng phương pháp siêu âm đã bào chế thành công NTN diclofenac (cả dạng acid và dạng muối) với ba loại pha dầu là isopropyl myristat, Labrafac PG và Miglyol cùng với CDH Tween 80, Cremophor

EL, Span 80, ĐDH Transcutol HP Đồng thời, tác giả cũng đánh giá được ảnh hưởng của các loại hệ đệm, lượng pha dầu, nồng độ CDH và ĐDH đến độ ổn định

vật lý và khả năng giải phóng dược chất in vitro [8]

Trên cơ sở đó, Nguyễn Thị Phượng (2012) lựa chọn dạng acid của diclofenac, pha dầu isopropyl myristat với tỉ lệ các CDH và ĐDH thích hợp để so sánh phương pháp bào chế siêu âm và siêu âm kết hợp đồng nhất hóa áp suất cao Kết quả cho thấy, tuy không có sự khác biệt về độ ổn định và tỉ lệ dược chất được nhũ hóa nhưng phương pháp siêu âm kết hợp đồng nhất hóa có KTTP nhỏ hơn,

lượng dược chất giải phóng in vitro trong 2 giờ đầu là tương tự nhưng các giờ tiếp

theo siêu âm kết hợp đồng nhất hóa giải phóng nhiều hơn [9]

Nguyễn Hồng Vân (2012) tiếp tục thay đổi công thức bằng cách kết hợp cả hai pha dầu Miglyol và isopropyl myristat, thay đổi các tỉ lệ CDH và ĐDH, bổ sung thêm PG và bào chế bằng phương pháp phân cắt tốc độ cao Sau đó tương tự các nghiên cứu trên đánh giá độ ổn định vật lý, các đặc tính vật lý (KTTP, PdI, thế zeta,

độ nhớt) và khả năng giải phóng dược chất in vitro, qua đó đã lựa chọn ra 3 công

thức tối ưu để nghiên cứu độ ổn định trong 6 tháng Sau 6 tháng KTTP, thế zeta, tỉ

lệ dược chất trong pha dầu, hàm lượng dược chất và phần trăm dược chất giải phóng tại các thời điểm có thay đổi, nhưng vẫn có khả năng tác dụng kéo dài Tác giả đã đi đến kết luận NTN nhỏ mắt diclofenac bảo quản tốt nhất ở 2 – 8oC [12]

Nguyễn Thị Thúy (2013) lựa chọn ra 4 công thức, sử dụng phương pháp siêu

âm kết hợp phân cắt tốc độ cao hoặc đồng nhất hóa áp suất cao để khảo sát nâng quy mô bào chế từ 100 mL lên 1000 mL Tác giả đã tìm được thời gian siêu âm cũng như đồng nhất hóa thích hợp thông qua đánh giá các đặc tính vật lý (KTTP,

PdI, thế zeta, độ nhớt) và khả năng giải phóng dược chất in vitro [11]

Tiếp tục, Quản Duy Quang (2014) đã tiến hành thẩm định phương pháp định lượng và bước đầu đánh giá sinh khả dụng của NTN diclofenac, lựa chọn phương pháp bào chế siêu âm Tác giả đã xây dựng và thẩm định được phương pháp định lượng diclofenac trong dịch tiền phòng bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao kết hợp thêm chuẩn với tính đặc hiệu, độ đúng, độ chính xác đạt tiêu chuẩn của FDA Nghiên cứu đã bước đầu đánh giá sinh khả dụng trên mắt thỏ (thực hiện trên

3 lô mẫu) và cho kết quả dạng NTN có nồng độ diclofenac trong dịch tiền phòng cao hơn so với dạng dung dịch ở đa số các thời điểm lấy mẫu, NTN có mức độ giải

phóng in vivo gấp khoảng 1,34 lần so với dạng dung dịch [10]

Với những kết quả đã đạt được, nghiên cứu hoàn thiện đánh giá sinh khả

dụng in vivo ở giai đoạn tiếp theo là cần thiết để có những đánh giá, lựa chọn giá trị hơn trong việc xây dựng tương quan in vivo – in vitro để ứng dụng tìm ra công thức

hai loại là sinh khả dụng in vitro và sinh khả dụng in vivo [4]

1.4.2 Sinh khả dụng in vitro và phương pháp đánh giá sinh khả dụng in vitro

cho thuốc dùng trong nhãn khoa

1.4.2.1 Định nghĩa

Sinh khả dụng in vitro đánh giá quá trình giải phóng, hòa tan dược chất từ

dạng thuốc [4]

1.4.2.2 Phương pháp đánh giá sinh khả dụng in vitro cho thuốc dùng trong

nhãn khoa

Các thiết bị sử dụng:

 Bình Franz: mẫu NTN được chứa ở ngăn cho phía trên (donor), môi trường

khuếch tán ở ngăn nhận phía dưới (receptor), màng thử giải phóng được đặt giữa hai phần Sau thời gian nhất định, lấy mẫu từ môi trường khuếch tán để định lượng, và

bổ sung lại thể tích môi trường khuếch tán mới tương ứng [22], [28]

 Màng giải phóng: thường sử dụng màng thẩm tích hoặc túi thẩm tích có giới hạn KLPT thường 12 – 14 kDa [28] Các màng này thường được xử

lý bằng môi trường khuếch tán trước khi tiến hành thí nghiệm

 Môi trường khuếch tán: thường là đệm phosphat pH 7,4 [14] hoặc dung dịch nước mắt nhân tạo [24], được điều nhiệt để duy trì nhiệt độ thích hợp

và khuấy trộn với tốc độ nhất định

 Nhiệt độ: 34±0,5oC (nhiệt độ bề mặt nhãn cầu) [14], [24] hoặc 37±0,5oC [17]

 Qi Li (2014) sử dụng bình Franz để nghiên cứu giải phóng in vitro của

Tacrolimus dùng cho nhãn khoa Mẫu Tacrolimus được chứa ở ngăn cho phía trên (donor), môi trường khuếch tán là hỗn hợp ethanol: nước mắt nhân tạo tỷ lệ thể tích 25:75, màng thử giải phóng là giác mạc của thỏ được sử dụng trong nghiên cứu được đặt giữa hai phần Sau các khoảng thời gian nhất định, 1 mL mẫu từ môi trường khuếch tán được lấy ra định lượng bằng phương pháp HPLC với detector

UV (G1314A VWD) tại bước sóng 220 nm; và bổ sung lại thể tích môi trường khuếch tán mới tương ứng [30]

 Thiết bị thẩm tách micro (hình P5 – PL 7) [39]

 Naseem A Charoo và cộng sự (2003) nghiên cứu giải phóng in vitro từ hệ

phân phối thuốc Ciprofloxacin hydroclorid dùng cho nhãn khoa bằng phương pháp thẩm tách Sử dụng thiết bị thẩm tách, màng giải phóng là màng mắt nhân tạo, môi

trường khuếch tán là nước mắt nhân tạ o pH 7,4 được khuấy liên tục bằng máy khuất từ, nhiệt độ được duy trì ở mức 37±0,5oC, tại các thời điểm lấy 3 mL mẫu và

bổ sung 3 mL môi trường khuếch tán, lọc mẫu và đem đo quang tại bước sóng 274

nm, sử dụng dung dịch nước mắt nhân tạo pH 7,4 làm mẫu trắng [18]

 Thiết bị thử hòa tan [14], [15], [17], [42], [50]

 H O Ammar (2009) đã tiến hành nghiên cứu bào chế nhũ tương nano

dorzolamid dùng cho nhãn khoa, nghiên cứu giải phóng in vitro được tiến hành:

thiết bị sử dụng là thiết bị thử hòa tan (SR8 PLUS, máy thử hòa tan Handson, Mỹ),

900 mL môi trường giải phóng là đệm phosphat (pH 7,4), nhiệt độ môi trường được cài đặt là 34±0,5oC, tốc độ khuấy là 50 vòng/phút, tiến hành thử nghiệm trong 6 giờ, NTN được chứa trong túi thẩm tích với 2 đầu được kẹp chặt Tại những thời điểm nhất định, lấy 5 mL mẫu từ môi trường khuếch tán (bổ sung thế tích môi trường tương ứng) và định lượng DC bằng phương pháp đo quang tại bước sóng 252,6 nm [14]

1.4.3 Sinh khả dụng in vivo và phương pháp đánh giá sinh khả dụng in vivo

cho thuốc dùng trong nhãn khoa

Hiện tại, có khá nhiều phương pháp để đánh giá sinh khả dụng của thuốc nhỏ mắt trên thỏ tuy nhiên đều gặp phải hạn chế bởi lượng mẫu lấy được từ mỗi thời điểm rất ít và khó lấy mẫu Mặt khác với những thuốc mà đích tác dụng là trong

nhãn cầu thì định lượng dược chất trong dịch tiền phòng là phù hợp nhất bởi đây là khu vực trung gian vận chuyển các chất đến các mô và tổ chức trong mắt [37] Vì vậy phương pháp này đã được dược sĩ Quản Duy Quang sử dụng trong nghiên cứu

để đánh giá sinh khả dụng nhũ tương nano nhỏ mắt diclofenac Nghiên cứu đã xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng diclofenac trong dịch tiền phòng mắt thỏ bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao kết hợp thêm chuẩn với giới hạn định lượng dưới khoảng 500 ng/mL, khoảng tuyến tính: từ khoảng 500 đến 8200 ng/mL và tính đặc hiệu độ đúng độ chính xác đạt tiêu chuẩn của FDA [10]

 Nguyễn Thị Mai Anh (2014) đã tiến hành đánh giá sinh khả dụng in vivo của

hỗn dịch nhỏ mắt chứa piroxicam nano bằng phương pháp định lượng dược chất trong thủy dịch Nghiên cứu thực hiện lấy thủy dịch mắt thỏ sau khi đã nhỏ hỗn dịch chứa piroxicam nano vào mắt thỏ tại từng thời điểm thích hợp, loại bỏ protein trước khi định lượng bằng cách trộn mẫu với đồng lượng methanol hoặc acetonitril sau đó

ly tâm tốc độ cao, hút lấy phần dịch trong, tiến hành phân tích bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao detector DAD tại bước sóng 254 nm và cho kết quả trong 30 phút đầu

Cmax của hỗn dịch nano cao gấp đôi so với hỗn dịch bào chế từ nguyên liệu đầu [1]

 Xiang – Gen Wu và cộng sự (2010) đã tiến hành nghiên cứu sinh khả dụng in vivo của hỗn dịch chứa mycophenolat mofetil nano bằng phương pháp định lượng

dược chất trong thủy dịch Sau khi nhỏ 50 µL hỗn dịch chứa mycophenolat mofetil vào cả hai mắt thỏ, mí mắt của thỏ được đậy lại trong 30 giây và sau đó tại các thời điểm nhất định sau khi tiêm, thủy dịch được thu thập và xử lý bằng cách trộn thủy dịch với hỗn hợp acid hydrocloric 1M và methanol (tỷ lệ 4:14), đem ly tâm lấy dịch trong đem định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao [51]

 Evren H Gökçe và cộng sự (2009) tiến hành nghiên cứu giải phóng in vivo

của nano lipid rắn cyclosporin – A dùng cho nhãn khoa Tiến hành nghiên cứu trên thỏ đực cân nặng khoảng 2,5 – 3,5 kg, nhỏ 50 µL nano lipid rắn cyclosporin – A (đã tiệt khuẩn) vào mắt phải của thỏ, và bên mắt trái của thỏ nhỏ cùng một lượng thể tích 50 µL nhũ tương nhỏ mắt cyclosporin – A trên thị trường (Restasis®) để so

sánh mức độ giải phóng in vivo của hai dạng bào chế Sau 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, và 24

giờ lấy thủy dịch ở mỗi mắt thỏ bằng kim tiêm cẩn thận không làm hỏng màng giác mạc (trước khi dùng kim tiêm hút dịch tiền phòng, mắt thỏ được gây tê bằng thuốc nhỏ mắt chứa 0,5% proparacain hydroclorid) Xử lý dịch tiền phòng bằng 10 µL của 6% acid percloric trong methanol trước khi đem định lượng bằng HPLC với detector UV tại bước sóng 210 nm Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng dạng bào chế nano lipid rắn có thời gian lưu giữ trên bề mặt giác mạc lâu hơn, sinh khả dụng cao hơn so với dạng bào chế nhũ tương trên thị trường (Restasis®) [25]

1.4.3.3 Tính toán mức độ và tốc độ hấp thu thuốc bằng phương pháp giải tích chập

Đánh giá mức độ và tốc độ hấp thu thuốc là một trong những nội dung quan trọng trong đánh giá sinh khả dụng của thuốc và phương pháp không dựa trên mô hình ngăn thường được lựa chọn để tính toán mức độ và tốc độ hấp thu thuốc Theo

phương pháp không dựa trên mô hình ngăn, mức độ giải phóng dược chất in vivo

được tính toán bằng phương pháp giải tích chập (deconvolution) [40], [41]

Nếu gọi:

 C(t) là hàm số biểu thị nồng độ thuốc trong huyết tương theo thời gian khi dùng đường ngoài tĩnh mạch

 rabs(t) là hàm số biểu thị tốc độ hấp thu theo thời gian

 Cδ(t) là hàm số biểu thị nồng độ thuốc trong huyết tương theo thời gian khi tiêm tĩnh mạch

thì:

 Tại một thời điểm τ bất kì, có một lượng rabs(τ).dτ được hấp thu

 Đến thời điểm t, một khoảng thời gian ứng với (t –τ) đã trôi qua Lượng thuốc hấp thu đó sẽ thải trừ tương ứng như với quá trình thuốc được tiêm tĩnh mạch Nghĩa là lượng thuốc còn lại trong cơ thể sẽ chỉ là Cδ (t – τ)

rabs(τ).dτ

 Nồng độ thuốc trong máu tại thời điểm t sẽ bằng tổng cộng các vi phân Cδ (t– τ) rabs(τ).dτ trong khoảng từ 0→t

( ) = ( − ) ( )

Nếu biết hai hàm C(t) và Cδ(t) ta sẽ tính được rabs(t) Kết quả có thể được tối ưu hóa thông qua tái tích chập (WLS Reconvolution) Tổng lượng dược chất được hấp thu tới thời điểm t (At) sẽ được tính theo công thức:

= ( )

Phương trình trên có thể cho phép xác định phần trăm hấp thu At/A∞ theo thời gian

và cơ chế của động học hấp thu

1.5 Tương quan in vitro – in vivo

1.5.1 Định nghĩa

Theo FDA: Mối tương quan in vitro – in vivo là một mô hình toán học mô tả mối quan hệ giữa đặc tính in vitro của một dạng bào chế và đáp ứng in vivo tương ứng Thông thường, đặc tính in vitro chính là tốc độ hoặc, và mức độ giải phóng dược chất và đáp ứng in vivo là nồng độ thuốc trong máu hay lượng thuốc được hấp

thu [46] Dược điển Mỹ định nghĩa IVIVC là sự thiết lập một mối liên hệ hợp lý giữa một đặc tính sinh học hoặc một thông số của nó với một đặc tính hóa lý của dạng bào chế [48]

1.5.2 Phân loại mức tương quan in vitro – in vivo

Có bốn mức tương quan đã được mô tả trong FDA guideline, trong đó bao gồm mức độ A, B, C và đa mức C [46] Khái niệm các mức tương quan được dựa trên khả năng của các mối tương quan để phản ánh nồng độ thuốc trong huyết tương theo thời gian để quản lý các hình thức liều lượng nhất định [46]

Tương quan mức A

Là mức tương quan cao nhất, thể hiện quan hệ từng điểm giữa tốc độ hòa tan

in vitro và tốc độ hấp thu in vivo của thuốc từ dạng bào chế [26], [46] Tỷ lệ %

thuốc hấp thu có thể được tính toán theo phương pháp phụ thuộc mô hình như của Wagner – Nelson hoặc phương pháp không phụ thuộc mô hình (giải tích chập)

Mục đích của tương quan mức A là xác định một mối quan hệ trực tiếp giữa

dữ liệu in vivo và tỷ lệ giải phóng in vitro để xác định tỷ lệ sinh dược học của các

dạng bào chế [26], [46]

Tương quan mức B

Một IVIVC mức độ B sử dụng nguyên tắc phân tích thời điểm thống kê

(statistical moment analysis) Thời gian hòa tan in vitro trung bình của sản phẩm được so sánh với thời gian lưu trú in vivo trung bình hoặc thời gian hấp thu in vivo trung bình Mối tương quan mức B cũng sử dụng tất cả các dữ liệu in vivo và in vitro, mặc dù các dữ liệu không tương quan từng điểm như mức A Mối tương quan

mức B không phản ánh chính xác đường cong nồng độ thuốc trong máu theo thời

gian vì một số đường cong in vivo khác nhau lại cho các giá trị thời gian lưu giữ

như nhau [26], [46]

Tương quan mức C

Tương quan mức C liên quan đến cùng một thời điểm giải phóng (T50%, T90% ) để có một thông số dược động học trung bình như AUC, Tmax, hoặc Cmax Đây là mức tương quan thấp nhất, mối liên hệ giữa các thành phần hấp thu và giải phóng được thành lập khi nó không phản ánh hình dạng hoàn chỉnh của đường cong nồng độ thuốc trong huyết tương theo thời gian (yếu tố quan trọng xác định hiệu suất của một sản phẩm thuốc) Do những hạn chế rõ ràng của nó, ưu điểm của tương

quan mức C được giới hạn trong việc dự đoán dữ liệu in vivo của thuốc Trong giai

đoạn đầu của phát triển công thức, tương quan mức C có thể có ích để lựa chọn công thức khi mà nghiên cứu tương đương sinh học rất khó khăn [26], [46]

Tương quan đa mức C

Tương quan mức C là có sự liên quan giữa một vài thông số dược động học (Cmax, AUC, hoặc các thông số thích hợp khác) với khối lượng thuốc được hòa tan

in vitro tại một vài thời điểm khác nhau [26], [46]

1.5.3 Thiết lập mối tương quan in vitro – in vivo

1.5.3.1 Yêu cầu chung [46]

Để thiết lập một IVIVC cần phải có đầy đủ các dữ liệu hòa tan in vitro và dữ liệu hấp thu in vivo của cùng lô thuốc

Dữ liệu hòa tan in vitro đóng vai trò quan trọng trong việc thiết lập tương quan Mục đích của nghiên cứu giải phóng in vitro trong giai đoạn đầu của nghiên

cứu phát triển thuốc là lựa chọn công thức tối ưu, đánh giá các thành phần hoạt chất

và tá dược, và đánh giá bất kì sự thay đổi nhỏ của sản phẩm thuốc Trong giai đoạn đầu của sự thiết lập tương quan, điều kiện giải phóng có thể được thay đổi để tạo

được tương quan điểm – điểm giữa dữ liệu hòa tan in vitro và dữ liệu hòa tan in vivo Đối với tương quan in vitro – in vivo, phép thử in vitro được đề xuất là một thay thế cho sinh khả dụng của thuốc Do vậy, điều kiện giải phóng in vitro nên

giống nhau cho tất cả các công thức thử nghiệm trong nghiên cứu tương đương sinh

học Phép thử in vitro có thể được thay đổi cho đạt mối tương quan như thay đổi tốc

độ khuấy, thay đổi pH hay nhiệt độ môi trường Một khi đã lựa chọn được phương pháp thích hợp cho một thuốc, các điều kiện hòa tan sẽ được áp dụng cho tất cả các công thức bào chế Cũng có thể thử một công thức bào chế trong tất cả các môi trường hòa tan độc lập, ngoài môi trường bắt buộc theo quy định, thử thêm ít nhất ba môi trường (như đệm phosphat pH 4,5; 5,8; và 6,8…) mô phỏng môi trường hòa tan thuốc [46] Các chất diện hoạt (ví dụ: Tween 80, hay chất hoạt động bề mặt như natri lauryl sulfat 1%) hay ethanol thường được thêm vào môi trường hòa tan đối với những thuốc ít tan [21], [46] Thể tích môi trường hòa tan phụ thuộc vào thiết bị khuấy và công thức được thử Với mục đích thiết lập IVIVC, dữ liệu hòa tan phải lấy ít nhất 12 đơn vị liều lượng riêng từ mỗi lô Hệ số biến thiên của các dữ liệu hòa tan trung bình mỗi lô không được vượt quá 10% Điều kiện thử hòa tan cần được xây dựng để các dữ liệu thử hòa tan nằm trong hoặc tại giới hạn trên và giới hạn dưới của dữ liệu thử tương đương sinh học Cần lấy dữ liệu hòa tan tại ít nhất 3 điểm, thời điểm lấy cần bao hàm giai đoạn đầu, giữa và cuối của quá trình hòa tan, ít nhất 80% dược chất được giải phóng tại thời điểm lấy mẫu cuối cùng, nếu lượng dược chất có khả năng hòa tan tối đa nhỏ hơn 80% thì thời điểm lấy mẫu cuối cùng khi quá trình hòa tan đạt trạng thái ổn định [46]

Nghiên cứu sinh khả dụng mô tả được đặc tính nồng độ thuốc tại đích biến đổi theo thời gian sau khi sử dụng của mỗi chế phẩm Nghiên cứu sinh khả dụng trong IVIVC phải được thực hiện trên số đối tượng nghiên cứu đủ để kết quả nghiên cứu chế phẩm thực sự có ý nghĩa Số đối tượng tham gia nghiên cứu phải trong khoảng 6 đến 36 Các nghiên cứu phải được thiết kế chéo, ngẫu nhiên Kiểm soát và tiêu chuẩn hóa các biến bao gồm các tiêu chuẩn lựa chọn đối tượng tham gia nghiên cứu như cân nặng, chế độ ăn uống, giới [46], [47]

1.5.3.2 Thiết lập tương quan mức A

Quá trình thiết lập một tương quan mức A gồm các bước như sau [41], [46]:

1 Phát triển các công thức bào chế với tốc độ giải phóng khác nhau (nhanh, trung bình, chậm) hoặc 1 công thức bào chế nếu thử hòa tan trong các điều kiện độc lập

2 Thu được các dữ liệu hòa tan in vitro và dữ liệu nồng độ thuốc trong máu từ

các công thức này

3 Tính toán các dữ liệu từ quá trình hấp thu in vivo và quá trình thử hòa tan,

dùng phương pháp không phụ thuộc mô hình, giải tích chập (deconvolution), hay phương pháp phụ thuộc mô hình (ví dụ mô hình Wagner-Nelson)

4 Thiết lập tương quan dựa vào các dữ liệu in vitro và in vivo thu được

5 Thẩm định phương pháp

1.5.5 Ứng dụng của tương quan in vitro – in vivo

Nghiên cứu tương quan in vitro – in vivo là để xác định có hay không một tương quan định lượng in vitro – in vivo, mà nếu có thì có thể sử dụng những thông

số thu được từ kết quả nghiên cứu in vitro thay thế cho những nghiên cứu in vivo

vốn tiêu tốn rất nhiều tiền của, thời gian, nhân lực và làm tăng giá thành sản phẩm của thuốc; là cơ sở xét miễn nghiên cứu sinh khả dụng và tương đương sinh học; là

cơ sở hoặc dùng để đánh giá ứng dụng của các đặc điểm và phương pháp thử hòa tan; là cơ sở cho kiểm tra chất lượng sản xuất và lựa chọn công thức thuốc thích hợp [41], [46]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu, thiết bị, động vật thí nghiệm

2.1.1 Hóa chất và nguyên liệu sử dụng

Bảng 2.1: Hóa chất và nguyên liệu sử dụng

15 Dinatri hydrophosphat Trung Quốc Nhà sản xuất

16 Benzalkonium clorid Trung Quốc Nhà sản xuất

2.1.2 Thiết bị

* Thiết bị lọc nén Sartorius SM 16249 (Đức); màng lọc cellulose acetat, kích thước

lỗ lọc 0,2 µm; 0,45 µm; máy đo pH Eutech Instruments pH 510; máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilentv 1260 Infinite (Mỹ); bể siêu âm Ultrasonic LC_60H.; máy ly

tâm lạnh Universal 320R (Anh); máy siêu âm cầm tay Labsonic®M – Sartorius (Đức); máy lắc xoáy Vortex; máy lọc nước PURELAB Classic UV, ELGA (Anh); máy đo phân bố KTTP và thế zeta Zetasizer Nano ZS90 – Malvern (Anh)

* Hệ thống đánh giá giải phóng thuốc qua màng Hanson Research

* Cân phân tích, cân kỹ thuật, các dụng cụ thủy tinh khác…

2.1.3 Động vật thí nghiệm

* Động vật thí nghiệm được lựa chọn là thỏ đực, cân nặng khoảng 2,5 – 3,0 kg, được nuôi dưỡng trong điều kiện thí nghiệm với chế độ ăn uống đầy đủ và được kiểm soát

2.2 Nội dung nghiên cứu

* Nghiên cứu sinh khả dụng NTN diclofenac dùng trong nhãn khoa

* Thiết lập mô hình IVIVC và ứng dụng IVIVC xác định công thức NTN diclofenac thích hợp dùng trong nhãn khoa

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp bào chế nhũ tương nhỏ mắt diclofenac

Dựa trên các kết quả nghiên cứu đã thực hiện [8], [9], [10], [11] công thức nhũ tương nano chứa dược chất ở dạng acid diclofenac được lựa chọn, trong đó tỉ lệ các

tá dược được lựa chọn theo mẫu có tỉ lệ giải phóng in vitro cao nhất Công thức:

Acid diclofenac 0,093 g (≈ 0,1 g natri diclofenac)

Đệm borat 0,1 M; pH 7,5

Nước cất pha tiêm vừa đủ 100 mL

Nhũ tương nano được bào chế bằng phương pháp siêu âm:

 Bước 1: Hòa tan hoàn toàn dược chất vào pha dầu (isopropyl myristat,

Span 80, Transcutol HP), đun nóng lên 60 - 650C

 Bước 2: Hòa tan, đun nóng pha nước (nước cất, glycerin, Cremophor

RH40, Tween 80, hệ đệm) lên 65 - 700C

 Bước 3: Kết hợp hai pha Siêu âm 15 phút bằng máy siêu âm cầm tay

Labsonic®M –Sartorius (tần số 30000 Hz, biên độ 100 μm, siêu âm liên tục)

 Bước 4: Điều chỉnh pH về 7,5 bằng dung dịch natri hydroxyd 0,1 mol/L

Thêm nước vừa đủ thể tích

 Bước 5: Tiệt khuẩn: lọc qua màng cellulose acetat 0,2 µm

 Bước 6: Đóng gói vào bao bì đã xử lý, dán nhãn, hoàn chỉnh thành phẩm

2.3.2 Phương pháp bào chế dung dịch nhỏ mắt diclofenac so sánh

Dạng dung dịch được pha theo công thức bào chế dung dịch nhỏ mắt diclofenac tham khảo trong Thực tập bào chế [3]

 Bước 2: Hòa tan natri diclofenac vào dung dịch trên

 Bước 3: Thêm benzalkonium clorid, khuấy đều

 Bước 4: Điều chỉnh pH đến 7,4 bằng dung dịch natri hydroxyd 1 mol/L

Thêm nước vừa đủ thể tích

 Bước 5: Tiệt khuẩn: lọc qua màng cellulose acetat 0,2 µm

 Bước 6: Đóng gói vào bao bì đã xử lý, dán nhãn, hoàn chỉnh thành phẩm

2.3.3 Phương pháp đánh giá một số đặc tính của hệ

2.3.3.1 Xác định kích thước tiểu phân và phân bố kích thước tiểu phân

Sử dụng máy đo phân bố KTTP và thế zeta Zetasizer Nano ZS90, đo kích thước hạt trong khoảng 0,01 – 10000 nm Ánh sáng tán xạ đo ở góc 900, nhiệt độ đo

25oC Để giảm hiện tượng đa tán xạ, tiến hành pha loãng mẫu NTN 100 lần trước khi đo

2.3.3.2 Đo thế zeta

Sử dụng máy đo phân bố KTTP và thế zeta Zetasizer Nano ZS90 Mẫu NTN được pha loãng 100 lần trước khi đo, nhiệt độ đo 25oC

2.3.4 Phương pháp định lượng dược chất

Dược chất có trong mẫu NTN AD được định lượng bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao – HPLC với detector mảng diod (DAD)

 Điều kiện

 Pha tĩnh: Cột C8 kích thước 150 mm × 4,6 mm (Octyl silica gel; 5 µm)

 Pha động: hỗn hợp MeOH và dung dịch đệm phosphat pH 2,5 với tỷ lệ 75/25, lọc qua màng cellulose acetat 0,45 µm, rồi siêu âm 15 phút

độ 1 mg/mL Tiếp tục pha loãng dung dịch gốc 20 lần bằng pha động để thu được mẫu chuẩn có nồng độ khoảng 50 µg/mL, lọc qua màng lọc 0,45 µm

Trong đó: H: phần trăm DC chứa trong mẫu NTN (%)

C0: Nồng độ lý thuyết của DC trong NTN bào chế (mg/mL)

Ct: Nồng độ DC trong mẫu thử (mg/mL)

mc: Khối lượng DC cân ban đầu để pha mẫu chuẩn (mg)

St: Diện tích pic chính của mẫu thử (mAU.giây)

Sc: Diện tích pic của mẫu chuẩn (mAU.giây)

2.3.5 Đánh giá sinh khả dụng

2.3.5.1 Các bước tiến hành thí nghiệm

Dựa trên phương pháp đã được Quản Duy Quang thực hiện, các bước tiến hành

 Nhỏ thuốc

Với mỗi con thỏ: Lần lượt nhỏ vào mắt trái 1 giọt nhũ tương nano, nhỏ vào mắt

phải 1 giọt dung dịch (pha theo công thức và quy trình ở mục 2.3.1 và 2.3.2) Ghi lại thời điểm nhỏ thuốc Ghi lại khối lượng mỗi chế phẩm nhỏ vào mắt thỏ (bằng hiệu khối lượng của lọ đựng chế phẩm trước và sau khi nhỏ) để tính toán hệ số quy

đổi theo mục 2.3.5.2.b [10]

 Lấy mẫu, xử lý mẫu và phân tích

 Mỗi con thỏ chỉ được lấy mẫu 1 lần tại một thời điểm nhất định

 12 thời điểm lựa chọn tương ứng với 12 con thỏ lần lượt là 10, 20, 30, 40, 50,

60, 75, 90, 105, 120, 150 và 180 phút

 Trước thời điểm lấy mẫu khoảng 2 phút, gây mê thỏ bằng cloroform

 Tại thời điểm lấy mẫu, dùng kim tiêm đường kính 30 gauge đâm xuyên qua giác mạc, hút lấy khoảng 100 μL dịch tiền phòng

 Tham khảo tài liệu tham khảo số [10], xử lý mẫu bằng methanol, ly tâm lấy dịch trong và phân tích mẫu bằng phương pháp HPLC theo quy trình ở mục 2.3.4

Tiến hành lặp lại các thí nghiệm trên 3 lần

 Định lượng DC trong dịch tiền phòng

Dược chất có trong dịch tiền phòng của mắt thỏ được định lượng bằng phương pháp HPLC với điều kiện như ở mục 2.3.4 với thể tích tiêm mẫu là 50 µL

 Mẫu chuẩn

 Cân chính xác khoảng 0,02 g acid diclofenac vào bình định mức 10 mL, thêm methanol, lắc đều cho tan, bổ sung methanol vừa đủ đến vạch

 Pha loãng 1000 lần bằng methanol để thu được nồng độ khoảng 2000 ng/mL

 Lọc qua màng cellulose acetat 0,45 µm

a Xác định nồng độ thực của diclofenac trong dịch tiền phòng

 Nồng độ diclofenac của mẫu sau xử lý là:

= ∙ ∙

Trong đó: Cxl: Nồng độ diclofenac trong mẫu xử lý (ng/mL)

mc: Khối lượng acid diclofenac pha chuẩn (mg)

St: Diện tích pic của mẫu xử lý (mAU.giây)

Sc: Diện tích pic của mẫu chuẩn (mAU.giây)

 Nồng độ thực của diclofenac trong dịch tiền phòng là:

ự = −

Cthực: Nồng độ thực của diclofenac trong dịch tiền phòng (ng/mL)

b So sánh nồng độ thuốc trong dịch tiền phòng giữa dạng nhũ tương nano và dạng dung dịch

Công thức pha chế cho nhũ tương nano acid diclofenac 0,093% và dung dịch natri diclofenac 0,1% đã đảm bảo rằng với cùng một thể tích, hai dạng bào chế đều

có số mol dược chất tương tự nhau Tuy nhiên, không giống như các dạng bào chế khác như dùng theo đường tiêm hay đường uống có khả năng phân liều chính xác, thuốc nhỏ mắt chỉ có thể phân liều tương đối theo “giọt” Vì vậy để khách quan và chính xác, cần phải quy đổi về cùng một thể tích nhỏ thuốc bằng hệ số quy đổi, sau

đó mới tiến hành so sánh nồng độ thuốc trong dịch tiền phòng giữa dạng nhũ tương nano và dạng dung dịch Thể tích quy đổi là 0,05 mL - tương ứng gần đúng với chỉ định mỗi lần nhỏ thuốc của các chế phẩm nhỏ mắt chứa diclofenac hiện nay (mỗi lần nhỏ 1 giọt) Hệ số quy đổi: = đ (tham khảo tài liệu số [10])

Thể tích đã nhỏ của nhũ tương nano và dung dịch lần lượt là:

Với: mnhỏ là khối lượng thuốc đã nhỏ, Dnano là khối lượng riêng của dạng nhũ tương nano (mg/mL), Ddd là khối lượng riêng của dung dịch (mg/mL)

 Nồng độ dược chất trong dịch tiền phòng khi nhỏ đúng 0,05 mL là:

, = × = ự × ,

Trong đó: C0,05: nồng độ dược chất trong dịch tiền phòng khi nhỏ 0,05 mL (ng/mL)

Cthực: nồng độ dược chất phân tích được khi nhỏ Vnhỏ mL thuốc (ng/mL)

Vnhỏ : thể tích nhỏ thuốc (mL)

2.3.5.2 Tính toán các thông số dược động học

 Lập bảng kết quả trung bình nồng độ - dược chất thời gian của thuốc qua sáu lần

thử Sử dụng phần mềm Phoenix WinNonlin 6.3, lựa chọn phương pháp không dựa trên mô hình ngăn tính toán các thông số sau:

 λz: độ dốc của đường thẳng biểu diễn logarit nồng độ dược chất theo thời gian tại các điểm lấy mẫu cuối cùng của pha thải trừ

 Cmax: Nồng độ AD cực đại trong dịch tiền phòng

 Tmax: thời gian để AD đạt nồng độ cực đại trong dịch tiền phòng

 AUC0-180: Diện tích dưới đường cong nồng độ - thời gian từ 0 tới 180 phút - thời điểm lấy mẫu cuối cùng

 AUC0-∞: Diện tích dưới đường cong nồng độ - thời gian từ 0 tới ∞

 MRT: Thời gian lưu trung bình của thuốc trong dịch tiền phòng

2.3.5.3 Mức độ giải phóng dược chất in vivo

Trên cơ sở kết quả trung bình nồng độ dược chất – thời gian thu được, sử dụng phương pháp giải tích chập (deconvolution) để tính toán mức độ (tỷ lệ) giải

phóng in vivo của dạng NTN so lượng giải phóng in vivo tối đa của dạng dung dịch

theo phương pháp đã nêu ở mục 1.4.3.3 trong phần tổng quan

2.3.6 Phương pháp xây dựng tương quan in vitro – in vivo

2.3.6.1 Đánh giá giải phóng dược chất in vitro

 Thiết bị: Sự dụng hệ thống đánh giá giải phóng thuốc qua màng Hanson

Research Ngăn nhận chứa 7 mL môi trường khuếch tán Ngăn cho là 1 khối trụ tròn

khuyết giữa đường kính 1 cm, chứa được 1 mL mẫu Màng giải phóng được đặt giữa hai ngăn

 Nhiệt độ môi trường được duy trì: 34±0,5oC (nhiệt độ bề mặt nhãn cầu)

 Tốc độ khuấy: 400 vòng/phút

 Thể tích môi trường khuếch tán: 7 mL

 Lượng mẫu đem thử: 1,0 mL NTN (chứa 0,93 mg acid diclofenac)

 Lấy mẫu: Lấy mẫu trong 3 tiếng, bắt đầu tại thời điểm 10 phút, tiếp đó là các

thời điểm 20, 30, 40, 50, 60, 75, 90, 105, 120, 150, 180 phút lấy mẫu một lần, mỗi lần lấy 1 mL rồi bổ sung 1 mL môi trường khuếch tán mới Lượng DC giải phóng từ NTN được xác định bằng phương pháp HPLC

 Định lượng dược chất giải phóng in vitro

 Điều kiện và mẫu chuẩn như ở mục 2.3.4

 Mẫu thử: 1 mL mẫu lấy được từ môi trường khuếch tán trực tiếp đem đi phân

Trong đó: Ct: Nồng độ DC trong môi trường khuếch tán tại thời điểm t (µg/mL)

Cc: Nồng độ mẫu chuẩn (µg/mL)

St: Diện tích pic của mẫu thử (mAU.giây)

Sc: Diện tích pic của mẫu chuẩn (mAU.giây)

Qt: tổng lượng DC đã giải phóng tại thời điểm t (µg)

V: thể tích môi trường khuếch tán (mL)

v: thể tích mỗi lần lấy mẫu thử (mL)

Xt: phần trăm giải phóng tại thời điểm t (%)

M: khối lượng DC có trong mẫu thử (mg)

2.3.6.2 Xác định các điều kiện thử giải phóng dược chất in vitro (phương pháp

mô hình hóa đồ thị giải phóng)

Sử dụng phần mềm Phoenix WinNonlin 6.3, khớp các số liệu của từng môi trường và lựa chọn mô hình phù hợp nhất trên tiêu chuẩn thông tin Akaike (AIC)

Mô hình có giá trị AIC nhỏ nhất được xem là mô hình phù hợp nhất

AIC được tính theo công thức sau:

Trong đó: n là số điểm dữ liệu giải phóng; p là tham số của mô hình; yj là phần trăm giải phóng tại điểm lấy mẫu thứ j; yˆ jlà phần trăm giải phóng dự đoán theo mô hình tại điểm lấy mẫu thứ j; wj là trọng số tuỳ chọn (trong khóa luận này wj = 1) Các mô hình giải phóng được trình bày ở bảng 2.2

Bảng 2.2 Các mô hình giải phóng khác nhau phù hợp với mô hình phân tích

dữ liệu in vitro

chất giải phóng