2.3.1. Phương pháp bào chế nhũ tương nhỏ mắt diclofenac
Dựa trên các kết quả nghiên cứu đã thực hiện [8], [9], [10], [11] công thức nhũ tương nano chứa dược chất ở dạng acid diclofenac được lựa chọn, trong đó tỉ lệ các tá dược được lựa chọn theo mẫu có tỉ lệ giải phóng in vitro cao nhất. Công thức: Acid diclofenac 0,093 g (≈ 0,1 g natri diclofenac)
Isopropyl myristat 2,000 g Transcutol HP 1,500 g Span 80 1,000 g Cremophor RH40 1,000 g Tween 80 1,000 g Glycerin 5,000 g
Đệm borat 0,1 M; pH 7,5 Nước cất pha tiêm vừa đủ 100 mL
Nhũ tương nano được bào chế bằng phương pháp siêu âm:
Bước 1: Hòa tan hoàn toàn dược chất vào pha dầu (isopropyl myristat, Span 80, Transcutol HP), đun nóng lên 60 - 650C.
Bước 2: Hòa tan, đun nóng pha nước (nước cất, glycerin, Cremophor RH40, Tween 80, hệ đệm) lên 65 - 700C.
Bước 3: Kết hợp hai pha. Siêu âm 15 phút bằng máy siêu âm cầm tay Labsonic®M –Sartorius (tần số 30000 Hz, biên độ 100 μm, siêu âm liên tục).
Bước 4: Điều chỉnh pH về 7,5 bằng dung dịch natri hydroxyd 0,1 mol/L. Thêm nước vừa đủ thể tích.
Bước 5: Tiệt khuẩn: lọc qua màng cellulose acetat 0,2 µm.
Bước 6: Đóng gói vào bao bì đã xử lý, dán nhãn, hoàn chỉnh thành phẩm.
2.3.2. Phương pháp bào chế dung dịch nhỏ mắt diclofenac so sánh
Dạng dung dịch được pha theo công thức bào chế dung dịch nhỏ mắt diclofenac tham khảo trong Thực tập bào chế [3].
Công thức Natri diclofenac 0,100 g Dinatri edetat 0,050 g Dinatri hydrophosphat 0,300 g Natri clorid 0,450 g Benzalkonium clorid 0,005 g Nước cất pha tiêm vừa đủ 100 mL
Bào chế
Bước 1: Hòa tan dinatri edetat, natri clorid, dinatri hydrophosphat vào khoảng 80 mL nước cất.
Bước 2: Hòa tan natri diclofenac vào dung dịch trên.
Bước 3: Thêm benzalkonium clorid, khuấy đều
Bước 4: Điều chỉnh pH đến 7,4 bằng dung dịch natri hydroxyd 1 mol/L. Thêm nước vừa đủ thể tích.
Bước 5: Tiệt khuẩn: lọc qua màng cellulose acetat 0,2 µm.
Bước 6: Đóng gói vào bao bì đã xử lý, dán nhãn, hoàn chỉnh thành phẩm.
2.3.3. Phương pháp đánh giá một số đặc tính của hệ
2.3.3.1. Xác định kích thước tiểu phân và phân bố kích thước tiểu phân
Sử dụng máy đo phân bố KTTP và thế zeta Zetasizer Nano ZS90, đo kích thước hạt trong khoảng 0,01 – 10000 nm. Ánh sáng tán xạ đo ở góc 900, nhiệt độ đo 25oC. Để giảm hiện tượng đa tán xạ, tiến hành pha loãng mẫu NTN 100 lần trước khi đo.
2.3.3.2. Đo thế zeta
Sử dụng máy đo phân bố KTTP và thế zeta Zetasizer Nano ZS90. Mẫu NTN được pha loãng 100 lần trước khi đo, nhiệt độ đo 25oC.
2.3.4. Phương pháp định lượng dược chất
Dược chất có trong mẫu NTN AD được định lượng bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao – HPLC với detector mảng diod (DAD).
Điều kiện
Pha tĩnh: Cột C8 kích thước 150 mm × 4,6 mm (Octyl silica gel; 5 µm). Pha động: hỗn hợp MeOH và dung dịch đệm phosphat pH 2,5 với tỷ lệ
75/25, lọc qua màng cellulose acetat 0,45 µm, rồi siêu âm 15 phút. Tốc độ dòng pha động: 1 mL/phút.
Thể tích tiêm mẫu: 20 µL.
Detector UV bước sóng: 276 nm. Mẫu chuẩn
Cân chính xác một lượng DC khoảng 25 mg, hòa tan hoàn toàn bằng methanol trong bình định mức 25 mL, bổ sung thể tích vừa đủ, thu được dung dịch gốc nồng
độ 1 mg/mL. Tiếp tục pha loãng dung dịch gốc 20 lần bằng pha động để thu được mẫu chuẩn có nồng độ khoảng 50 µg/mL, lọc qua màng lọc 0,45 µm.
Mẫu thử
Định lượng DC có trong mẫu NTN: pha loãng mẫu NTN 20 lần (làm tương tự mẫu chuẩn) bằng pha động, lọc qua màng lọc 0,45 µm.
Công thức tính
Nồng độ DC trong mẫu thử được tính theo công thức sau:
= . 25
Phần trăm DC có trong mẫu NTN được tính theo công thức:
= .100
Trong đó: H: phần trăm DC chứa trong mẫu NTN (%)
C0: Nồng độ lý thuyết của DC trong NTN bào chế (mg/mL). Ct: Nồng độ DC trong mẫu thử (mg/mL).
mc: Khối lượng DC cân ban đầu để pha mẫu chuẩn (mg) St: Diện tích pic chính của mẫu thử (mAU.giây)
Sc: Diện tích pic của mẫu chuẩn (mAU.giây).
2.3.5. Đánh giá sinh khả dụng
2.3.5.1. Các bước tiến hành thí nghiệm
Dựa trên phương pháp đã được Quản Duy Quang thực hiện, các bước tiến hành như sau [10]:
Chuẩn bị
Nhũ tương nano nhỏ mắt acid diclofenac 0,093% và dung dịch nhỏ mắt natri diclofenac 0,1% theo quy trình ở mục 2.3.1 và mục 2.3.2.
Một lô gồm 12 con thỏ, trọng lượng tương đối bằng nhau khoảng 2,5 – 3,0 kg.
Nhỏ thuốc
Với mỗi con thỏ: Lần lượt nhỏ vào mắt trái 1 giọt nhũ tương nano, nhỏ vào mắt phải 1 giọt dung dịch (pha theo công thức và quy trình ở mục 2.3.1 và 2.3.2). Ghi lại thời điểm nhỏ thuốc. Ghi lại khối lượng mỗi chế phẩm nhỏ vào mắt thỏ (bằng hiệu khối lượng của lọ đựng chế phẩm trước và sau khi nhỏ) để tính toán hệ số quy đổi theo mục 2.3.5.2.b [10].
Lấy mẫu, xử lý mẫu và phân tích
Mỗi con thỏ chỉ được lấy mẫu 1 lần tại một thời điểm nhất định.
12 thời điểm lựa chọn tương ứng với 12 con thỏ lần lượt là 10, 20, 30, 40, 50, 60, 75, 90, 105, 120, 150 và 180 phút.
Trước thời điểm lấy mẫu khoảng 2 phút, gây mê thỏ bằng cloroform.
Tại thời điểm lấy mẫu, dùng kim tiêm đường kính 30 gauge đâm xuyên qua giác mạc, hút lấy khoảng 100 μL dịch tiền phòng.
Tham khảo tài liệu tham khảo số [10], xử lý mẫu bằng methanol, ly tâm lấy dịch trong và phân tích mẫu bằng phương pháp HPLC theo quy trình ở mục 2.3.4.
Tiến hành lặp lại các thí nghiệm trên 3 lần
Định lượng DC trong dịch tiền phòng
Dược chất có trong dịch tiền phòng của mắt thỏ được định lượng bằng phương pháp HPLC với điều kiện như ở mục 2.3.4. với thể tích tiêm mẫu là 50 µL.
Mẫu chuẩn
Cân chính xác khoảng 0,02 g acid diclofenac vào bình định mức 10 mL, thêm methanol, lắc đều cho tan, bổ sung methanol vừa đủ đến vạch.
Pha loãng 1000 lần bằng methanol để thu được nồng độ khoảng 2000 ng/mL. Lọc qua màng cellulose acetat 0,45 µm.
Mẫu thử
Dịch tiền phòng thu được từ mắt thỏ xử lý theo quy trình ở mục 2.3.5.1. rồi đem đi phân tích.
a. Xác định nồng độ thực của diclofenac trong dịch tiền phòng
Nồng độ diclofenac của mẫu sau xử lý là:
= ∙ ∙
Trong đó: Cxl: Nồng độ diclofenac trong mẫu xử lý (ng/mL) mc: Khối lượng acid diclofenac pha chuẩn (mg) St: Diện tích pic của mẫu xử lý (mAU.giây) Sc: Diện tích pic của mẫu chuẩn (mAU.giây) Nồng độ thực của diclofenac trong dịch tiền phòng là:
ự = . − .
Cthực: Nồng độ thực của diclofenac trong dịch tiền phòng (ng/mL)
b. So sánh nồng độ thuốc trong dịch tiền phòng giữa dạng nhũ tương nano và dạng dung dịch
Công thức pha chế cho nhũ tương nano acid diclofenac 0,093% và dung dịch natri diclofenac 0,1% đã đảm bảo rằng với cùng một thể tích, hai dạng bào chế đều có số mol dược chất tương tự nhau. Tuy nhiên, không giống như các dạng bào chế khác như dùng theo đường tiêm hay đường uống có khả năng phân liều chính xác, thuốc nhỏ mắt chỉ có thể phân liều tương đối theo “giọt”. Vì vậy để khách quan và chính xác, cần phải quy đổi về cùng một thể tích nhỏ thuốc bằng hệ số quy đổi, sau đó mới tiến hành so sánh nồng độ thuốc trong dịch tiền phòng giữa dạng nhũ tương nano và dạng dung dịch. Thể tích quy đổi là 0,05 mL - tương ứng gần đúng với chỉ định mỗi lần nhỏ thuốc của các chế phẩm nhỏ mắt chứa diclofenac hiện nay (mỗi lần nhỏ 1 giọt). Hệ số quy đổi: = đ (tham khảo tài liệu số [10]).
Thể tích đã nhỏ của nhũ tương nano và dung dịch lần lượt là:
= ( ); = ( )
Với: mnhỏ là khối lượng thuốc đã nhỏ, Dnano là khối lượng riêng của dạng nhũ tương nano (mg/mL), Ddd là khối lượng riêng của dung dịch (mg/mL).
Nồng độ dược chất trong dịch tiền phòng khi nhỏ đúng 0,05 mL là:
, = × = ự × ,
Trong đó: C0,05: nồng độ dược chất trong dịch tiền phòng khi nhỏ 0,05 mL (ng/mL). Cthực: nồng độ dược chất phân tích được khi nhỏ Vnhỏ mL thuốc (ng/mL). Vnhỏ : thể tích nhỏ thuốc (mL).
2.3.5.2. Tính toán các thông số dược động học
Lập bảng kết quả trung bình nồng độ - dược chất thời gian của thuốc qua sáu lần thử. Sử dụng phần mềm Phoenix WinNonlin 6.3, lựa chọn phương pháp không dựa trên mô hình ngăn tính toán các thông số sau:
λz: độ dốc của đường thẳng biểu diễn logarit nồng độ dược chất theo thời gian tại các điểm lấy mẫu cuối cùng của pha thải trừ.
Cmax: Nồng độ AD cực đại trong dịch tiền phòng.
Tmax: thời gian để AD đạt nồng độ cực đại trong dịch tiền phòng.
AUC0-180: Diện tích dưới đường cong nồng độ - thời gian từ 0 tới 180 phút - thời điểm lấy mẫu cuối cùng.
AUC0-∞: Diện tích dưới đường cong nồng độ - thời gian từ 0 tới ∞. MRT: Thời gian lưu trung bình của thuốc trong dịch tiền phòng.
2.3.5.3. Mức độ giải phóng dược chất in vivo
Trên cơ sở kết quả trung bình nồng độ dược chất – thời gian thu được, sử dụng phương pháp giải tích chập (deconvolution) để tính toán mức độ (tỷ lệ) giải phóng in vivo củadạng NTN so lượng giải phóng in vivo tối đa của dạng dung dịch theo phương pháp đã nêu ở mục 1.4.3.3 trong phần tổng quan.
2.3.6. Phương pháp xây dựng tương quan in vitro – in vivo 2.3.6.1. Đánh giá giải phóng dược chất in vitro 2.3.6.1. Đánh giá giải phóng dược chất in vitro
Thiết bị: Sự dụng hệ thống đánh giá giải phóng thuốc qua màng Hanson Research. Ngăn nhận chứa 7 mL môi trường khuếch tán. Ngăn cho là 1 khối trụ tròn
khuyết giữa đường kính 1 cm, chứa được 1 mL mẫu. Màng giải phóng được đặt giữa hai ngăn.
Điều kiện:
Màng giải phóng: màng thẩm tích 12000 Dalton. Diện tích bề mặt màng khuếch tán: 1,76 cm2.
Môi trường khuếch tán: dung dịch đệm phosphat với các pH khác nhau 4,0; 4,5; 5,8; 6,8; 7,4 và có thêm chất diện hoạt Tween 80, Ethanol làm tăng độ tan của dược chất, tăng khả năng giải phóng dược chất [19], [35], [46]. Nhiệt độ môi trường được duy trì: 34±0,5oC (nhiệt độ bề mặt nhãn cầu). Tốc độ khuấy: 400 vòng/phút.
Thể tích môi trường khuếch tán: 7 mL.
Lượng mẫu đem thử: 1,0 mL NTN (chứa 0,93 mg acid diclofenac).
Lấy mẫu: Lấy mẫu trong 3 tiếng, bắt đầu tại thời điểm 10 phút, tiếp đó là các thời điểm 20, 30, 40, 50, 60, 75, 90, 105, 120, 150, 180 phút lấy mẫu một lần, mỗi lần lấy 1 mL rồi bổ sung 1 mL môi trường khuếch tán mới. Lượng DC giải phóng từ NTN được xác định bằng phương pháp HPLC.
Định lượng dược chất giải phóng in vitro
Điều kiện và mẫu chuẩn như ở mục 2.3.4.
Mẫu thử: 1 mL mẫu lấy được từ môi trường khuếch tán trực tiếp đem đi phân tích.
Tính toán:
Nồng độ DC trong môi trường khuếch tán tại thời điểm t:
= .
Tổng lượng DC đã giải phóng từ NTN tại thời điểm t (lần lấy mẫu thứ n):
Qt = V .Ct + v.∑
Phần trăm DC đã giải phóng từ NTN tại thời điểm t:
Trong đó: Ct: Nồng độ DC trong môi trường khuếch tán tại thời điểm t (µg/mL). Cc: Nồng độ mẫu chuẩn (µg/mL).
St: Diện tích pic của mẫu thử (mAU.giây) Sc: Diện tích pic của mẫu chuẩn (mAU.giây)
Qt: tổng lượng DC đã giải phóng tại thời điểm t (µg) V: thể tích môi trường khuếch tán (mL)
v: thể tích mỗi lần lấy mẫu thử (mL)
Xt: phần trăm giải phóng tại thời điểm t (%) M: khối lượng DC có trong mẫu thử (mg).
2.3.6.2. Xác định các điều kiện thử giải phóng dược chất in vitro (phương pháp mô hình hóa đồ thị giải phóng) mô hình hóa đồ thị giải phóng)
Sử dụng phần mềm Phoenix WinNonlin 6.3, khớp các số liệu của từng môi trường và lựa chọn mô hình phù hợp nhất trên tiêu chuẩn thông tin Akaike (AIC). Mô hình có giá trị AIC nhỏ nhất được xem là mô hình phù hợp nhất.
AIC được tính theo công thức sau:
= ∗ ln − + 2 ∗
Trong đó: n là số điểm dữ liệu giải phóng; p là tham số của mô hình; yj là phần trăm giải phóng tại điểm lấy mẫu thứ j; yˆjlà phần trăm giải phóng dự đoán theo mô hình tại điểm lấy mẫu thứ j; wj là trọng số tuỳ chọn (trong khóa luận này wj = 1).
Các mô hình giải phóng được trình bày ở bảng 2.2.
Bảng 2.2. Các mô hình giải phóng khác nhau phù hợp với mô hình phân tích dữ liệu in vitro
Mô hình Phương trình Tham số
Hill ( ) = ( ∗ )/( + ) Finf là tỷ lệ dược
chất giải phóng
Double Weibull
( ) = 1 ∗ 1 −
+ (1 − 1) 1 −
f1 là tỷ lệ đóng góp của mô hình Weibull 1.
vào thời điểm vô cùng;
t là thời điểm giải phóng ;
MDT là thời gian
hòa tan trung
bình; b, b1, b2 là tham số mũ Makoid- Banakar = . . .
kMB, n, và k là thông số thực nghiệm trong mô hình
Makoid-Banakar (kMB, n, k>0).
2.3.6.3. Thiết lập mô hình tương quan phù hợp
Sử dụng phần mềm Phoenix IVIVC Toolkit 2.2, mối quan hệ giữa tỷ lệ giải phóng in vivo và tỷ lệ giải phóng in vitro được thiết lập trên các mô hình sau:
Mô hình 1 (PT1): Fvivo=AbsScale*Fvitro(Tscale*Tvivo)
Mô hình 2 (PT2): Fvivo=AbsScale*Fvitro(Tscale*Tvivo-Tshift)
Mô hình 3 (PT3): Fvivo=AbsScale*[Fvitro(Tscale*Tvivo-Tshift)-AbsBase]
Trong đó: Fvivo: là (tỷ lệ) giải phóng in vivo dạng NTN so lượng giải phóng in vivo tối đa của dạng dung dịch; AbsScale: là tỷ lệ quy đổi giải phóng in vivo với giải phóng in vitro; Fvitro: là tỷ lệ giải phóng in vitro; Tscale: là tỷ lệ quy đổi thời gian giải phóng in vivo với thời gian giải phóng in vitro; Tvivo: thời điểm giải phóng in vivo; Tshift: thời gian tiềm tàng; AbsBase: tỷ lệ giải phóng in vivo cơ sở.
Mô hình có giá trị AIC nhỏ nhất được xem là mô hình tương quan phù hợp nhất.
2.3.7. Ứng dụng tương quan lựa chọn công thức bào chế thích hợp
Sử dụng phần mềm MODDE 8.0 (Umetrics Inc., USA) để thiết kế thí nghiệm dựa trên nguyên tắc hợp tử tại tâm. Mô hình IVIVC được sử dụng để dự đoán tỷ lệ giải phóng in vivo dựa vào tỷ lệ giải phóng in vitro.
Xác định các yếu tố ảnh hưởng và lựa chọn công thức bào chế thích hợp bằng phần mềm FormRules v2.0 và INForm v3.2, dựa trên mô hình mạng neuron nhân tạo.
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Đánh giá sinh khả dụng và các thông số dược động học của nhũ tương nano diclofenac trên mắt thỏ
3.1.1. So sánh nồng độ diclofenac trong dịch tiền phòng của nhũ tương nano và dạng dung dịch dạng dung dịch
Bố trí thí nghiệm theo quy trình ở mục 2.3.5 với quy ước là mắt trái nhỏ dạng nhũ tương nano và mắt phải nhỏ dạng dung dịch. Tính toán và xử lý số liệu theo phương pháp đã trình bày ở mục 2.3.5.2 vẽ đường cong nồng độ - thời gian theo giá trị nồng độ quy đổi tính toán được khi nhỏ 0,05 mL dạng bào chế. Kết quả trung bình 6 lô thí nghiệm được trình bày ở bảng P1 (PL 1) (bao gồm kết quả 3 lô đầu tiên đã được thực hiện trước đó [10]).
Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn đường cong nồng độ - thời gian trung bình 6 lô
Kết quả cho thấy đồ thị nồng độ dược chất trong dịch tiền phòng biến thiên khá phức tạp và có sự dao động lớn của giá trị nồng độ này giữa các cá thể thỏ.
Có thể thấy dạng dung dịch dễ bị rửa trôi, dược chất thải trừ nhanh hơn so với dạng nhũ tương nano. Do dạng NTN phân bố dược chất dần từ pha dầu sang pha nước nên giúp kiểm soát và duy trì sự giải phóng dược chất làm cho nồng độ dược chất trong dịch tiền phòng cao hơn và được duy trì lâu hơn dạng dung dịch. Đồ thị
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 N ồ n g đ ộ ( n g /m L ) Thời gian (phút) NTN