Dựa trên phương pháp đã được Quản Duy Quang thực hiện, các bước tiến hành như sau [10]:
Chuẩn bị
Nhũ tương nano nhỏ mắt acid diclofenac 0,093% và dung dịch nhỏ mắt natri diclofenac 0,1% theo quy trình ở mục 2.3.1 và mục 2.3.2.
Một lô gồm 12 con thỏ, trọng lượng tương đối bằng nhau khoảng 2,5 – 3,0 kg.
Nhỏ thuốc
Với mỗi con thỏ: Lần lượt nhỏ vào mắt trái 1 giọt nhũ tương nano, nhỏ vào mắt phải 1 giọt dung dịch (pha theo công thức và quy trình ở mục 2.3.1 và 2.3.2). Ghi lại thời điểm nhỏ thuốc. Ghi lại khối lượng mỗi chế phẩm nhỏ vào mắt thỏ (bằng hiệu khối lượng của lọ đựng chế phẩm trước và sau khi nhỏ) để tính toán hệ số quy đổi theo mục 2.3.5.2.b [10].
Lấy mẫu, xử lý mẫu và phân tích
Mỗi con thỏ chỉ được lấy mẫu 1 lần tại một thời điểm nhất định.
12 thời điểm lựa chọn tương ứng với 12 con thỏ lần lượt là 10, 20, 30, 40, 50, 60, 75, 90, 105, 120, 150 và 180 phút.
Trước thời điểm lấy mẫu khoảng 2 phút, gây mê thỏ bằng cloroform.
Tại thời điểm lấy mẫu, dùng kim tiêm đường kính 30 gauge đâm xuyên qua giác mạc, hút lấy khoảng 100 μL dịch tiền phòng.
Tham khảo tài liệu tham khảo số [10], xử lý mẫu bằng methanol, ly tâm lấy dịch trong và phân tích mẫu bằng phương pháp HPLC theo quy trình ở mục 2.3.4.
Tiến hành lặp lại các thí nghiệm trên 3 lần
Định lượng DC trong dịch tiền phòng
Dược chất có trong dịch tiền phòng của mắt thỏ được định lượng bằng phương pháp HPLC với điều kiện như ở mục 2.3.4. với thể tích tiêm mẫu là 50 µL.
Mẫu chuẩn
Cân chính xác khoảng 0,02 g acid diclofenac vào bình định mức 10 mL, thêm methanol, lắc đều cho tan, bổ sung methanol vừa đủ đến vạch.
Pha loãng 1000 lần bằng methanol để thu được nồng độ khoảng 2000 ng/mL. Lọc qua màng cellulose acetat 0,45 µm.
Mẫu thử
Dịch tiền phòng thu được từ mắt thỏ xử lý theo quy trình ở mục 2.3.5.1. rồi đem đi phân tích.
a. Xác định nồng độ thực của diclofenac trong dịch tiền phòng
Nồng độ diclofenac của mẫu sau xử lý là:
= ∙ ∙
Trong đó: Cxl: Nồng độ diclofenac trong mẫu xử lý (ng/mL) mc: Khối lượng acid diclofenac pha chuẩn (mg) St: Diện tích pic của mẫu xử lý (mAU.giây) Sc: Diện tích pic của mẫu chuẩn (mAU.giây) Nồng độ thực của diclofenac trong dịch tiền phòng là:
ự = . − .
Cthực: Nồng độ thực của diclofenac trong dịch tiền phòng (ng/mL)
b. So sánh nồng độ thuốc trong dịch tiền phòng giữa dạng nhũ tương nano và dạng dung dịch
Công thức pha chế cho nhũ tương nano acid diclofenac 0,093% và dung dịch natri diclofenac 0,1% đã đảm bảo rằng với cùng một thể tích, hai dạng bào chế đều có số mol dược chất tương tự nhau. Tuy nhiên, không giống như các dạng bào chế khác như dùng theo đường tiêm hay đường uống có khả năng phân liều chính xác, thuốc nhỏ mắt chỉ có thể phân liều tương đối theo “giọt”. Vì vậy để khách quan và chính xác, cần phải quy đổi về cùng một thể tích nhỏ thuốc bằng hệ số quy đổi, sau đó mới tiến hành so sánh nồng độ thuốc trong dịch tiền phòng giữa dạng nhũ tương nano và dạng dung dịch. Thể tích quy đổi là 0,05 mL - tương ứng gần đúng với chỉ định mỗi lần nhỏ thuốc của các chế phẩm nhỏ mắt chứa diclofenac hiện nay (mỗi lần nhỏ 1 giọt). Hệ số quy đổi: = đ (tham khảo tài liệu số [10]).
Thể tích đã nhỏ của nhũ tương nano và dung dịch lần lượt là:
= ( ); = ( )
Với: mnhỏ là khối lượng thuốc đã nhỏ, Dnano là khối lượng riêng của dạng nhũ tương nano (mg/mL), Ddd là khối lượng riêng của dung dịch (mg/mL).
Nồng độ dược chất trong dịch tiền phòng khi nhỏ đúng 0,05 mL là:
, = × = ự × ,
Trong đó: C0,05: nồng độ dược chất trong dịch tiền phòng khi nhỏ 0,05 mL (ng/mL). Cthực: nồng độ dược chất phân tích được khi nhỏ Vnhỏ mL thuốc (ng/mL). Vnhỏ : thể tích nhỏ thuốc (mL).