Nghiên cứu sinh khả dụng IN VIVO của curcumin giải phóng từ màng bacterial cellulose nạp thuốc qua đường uống

Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu sinh khả dụng in vivo của curcumin giải phóng từ hệ Bacterial cellulose nạp thuốc, định hướng sử dụng bào chế hệ trị liệu phóng thích dược chất kéo dài q

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

NGUYỄN THỊ TUYẾT

NGHIÊN CỨU SINH KHẢ DỤNG IN VIVO CỦA

CURCUMIN GIẢI PHÓNG TỪ MÀNG BACTERIAL CELLULOSE NẠP THUỐC QUA ĐƯỜNG UỐNG

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60 42 01 14

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Phúc Hưng

HÀ NỘI, 2017

LỜI CẢM ƠN

Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn thầy giáo TS Nguyễn Phúc Hưng, người thầy đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Em cũng xin bày tỏ lời cảm ơn tới thầy TS Nguyễn Xuân Thành, các thầy cô giáo trong khoa Sinh - KTNN cùng các thầy cô tại Trung tâm hỗ trợ nghiên cứu khoa học và chuyển giao công nghệ, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, đã tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất, cảm ơn gia đình cùng toàn thể các bạn, những người thân, đã luôn ở bên động viên, giúp đỡ và khích lệ em hoàn thành luận văn này

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2017

Học viên

Nguyễn Thị Tuyết

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu 3

3 Nhiệm vụ nghiên cứu 3

4 Vật liệu và phạm vi nghiên cứu 3

5 Phương pháp nghiên cứu 4

6 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 4

NỘI DUNG 5

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 Bacterial cellulose (BC) 5

1.1.1 Cấu trúc của màng Bacterial cellulose 5

1.1.2 Tính chất lý hóa của màng S – BC 6

1.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành màng BC 6

1.1.4 Ứng dụng của màng BC 9

1.2 Thuốc curcumin 10

1.2.1 Giới thiệu chung về thuốc 10

1.2.2 Tính chất hóa lý của curcuminoid 12

1.2.3 Hoạt tính sinh học 13

1.2.4 Hạn chế của curcumin 16

1.2.5 Sinh khả dụng của curcumin 17

1.2.6 Chống chỉ định 18

1.2.7 Tác dụng phụ: 18

1.3 Thuốc tác dụng kéo dài 19

1.4 Phương pháp HPLC 19

1.5 Nghiên cứu in vivo 21

1.6 Tình hình nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam 26

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

2.1 Vật liệu nghiên cứu 28

2.1.1 Thỏ 28

2.1.2 Nguyên liệu và hóa chất 29

2 2 Phương pháp nghiên cứu 31

2.2.1 Phương pháp bào chế BC-Cur dạng uống 31

2.2.2 Xác định lượng thuốc hấp thu vào màng 32

2.2.3 Chuẩn bị 33

2.2.4 Thiết kế thí nghiệm 34

2.2.5 Phương pháp lấy mẫu 35

2.2.6 Định lượng curcumin trong huyết tương bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao ( HPLC) 37

2.2.7 Phương pháp xử lý thống kê 42

2.3 Các thông số đánh giá SKD in vivo 42

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 46

3.1 Xác định liều thử và liều đối chiếu 46

3.2 Xây dựng quy trình phân tích curcumin trong huyết tương thỏ 46

3.3 Thẩm định quy trình phân tích curcumin trong huyết tương thỏ 47

3.3.1 Khảo sát tính tương thích của hệ thống sắc ký 47

3.3.2 Tính đặc hiệu của phương pháp 48

3.3.3 Xác định khoảng tuyến tính của phương pháp định lượng 50

3.3.4 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 53

3.3.5 Xác định độ lặp lại của phương pháp 53

3.3.6 Xác định độ đúng của phương pháp xây dựng 55

3.4 Áp dụng quy trình phân tích lượng curcumin trong huyết tương thỏ56

3.5 Tính các thông số dược động học của BC - Curcumin và Curcumin

nguyên chất 58

KẾT LUẬN 62

TÀI LIỆU THAM KHẢO 63

PHỤ LỤC 75

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến năng suất sản xuất màng BC 7 Bảng 2.1 Khối lượng cơ thể ở các giai đoạn tuổi 29 Bảng 3.3 Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp 54 Bảng 3.5 Nồng độ Curcumin trong huyết tương sau khi uống thuốc thử 57 Bảng 3.6 Nồng độ Curcumin trong huyết tương sau khi uống thuốc đối chứng

58

Bảng 3.7 Các thông số dược động học trên thỏ sau khi uống BC – cur và

uống curcumin nguyên chất 58 Bảng 3.8 Các thông số dược động học sau khi uống BC – cur và uống cur

nguyên chất 59

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cellulose thực vật và BC 6

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của curcumin 11

Hình 1.3 Dạng hỗ biến ceto-enol của curcumin 13

Hình 2.1 Sơ đồ quá trình xử lý màng BC 32

Hình 2.2 Sơ đồ quá trình xử lý màng BC 36

Hình 2.3 Sơ đồ xử lý mẫu huyết tương trắng 36

Hình 2.4 Sơ đồ xử lý mẫu huyết tương sau khi dùng chế phẩm chứa curcumin 37 Hình 2.5 DTDĐC của đồ thị nồng độ máu 43

Hình 2.6 DTDĐC theo quy tắc hình thang 43

Hình 2.7 Đồ thị nồng độ máu của 2 chế phẩm A và B 44

Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ và diện tích píc chuẩn Curcumin 53

Hình 3.2 Đường cong nồng độ thuốc theo thời gian của 2 nhóm thỏ thí nghiệm 57

1

độ thuốc cao tại nơi cần điều trị, phát huy được tối đa tác dụng của thuốc Giảm được lượng thuốc dùng cho cả đợt điều trị, do đó tuy giá thành một liều cao hơn nhưng giá thành cho cả liệu trình điều trị lại giảm

Uống là một trong những đường ưa thích nhất và truyền thống để phân phối thuốc So với đường tiêm hệ thống phân phối thuốc qua đường miệng nó có nhiều lợi thế chính bao gồm an toàn nhất, đơn giản, tiện lợi,

2

bệnh nhân dễ dàng tuân thủ, trong đó tăng hiệu quả của thuốc uống Nó cũng ngăn chặn nguy cơ lây truyền bệnh, làm giảm chi phí và áp lực cho bệnh nhân [5]

Bacterial cellulose (BC) được tạo thành từ Acetobacter xylinum có

cấu trúc hóa học rất giống của cellulose thực vật nhưng có một số tính chất hóa lý đặc biệt như: độ bền cơ học, khả năng thấm hút nước cao, đường kính sợi nhỏ, độ tinh khiết cao, độ polymer hóa lớn, có khả năng phục hồi độ ẩm ban đầu, Vì vậy, BC được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực như: thực phẩm, công nghiệp dệt, công nghiệp giấy, mỹ phẩm, y học, đáng chú ý nhất trong sự kiểm soát các hệ thống vận chuyển thuốc BC đã được sử dụng như trong một vài hệ thống để phân phối thuốc Amin et al.[13] đã báo cáo việc sử dụng màng BC làm màng bọc cho Paracetamol bằng cách sử dụng kĩ thuật phun phủ Kết quả cho thấy màng BC giúp cho thuốc được giải phóng một cách kéo dài làm tăng hiệu quả sử dụng của thuốc Gần đây, Huang et al [35] nghiên cứu việc

sử dụng màng BC cho việc kiểm soát in vitro của Berberine Ngoài thẩm

thấu qua da, thí nghiệm kiểm soát sự giải phóng thuốc Berberine qua màng BC còn được thử nghiệm mô phỏng trong dạ dày, ruột Các kết quả thu được cho thấy rằng thuốc đã được giải phóng với một tốc độ chậm Rào cản lớn khiến thuốc curcumin chưa được ứng dụng rộng rãi là

do curcumin không tan trong nước (độ tan 0,001%), sinh khả dụng thấp

Vì vậy, khi dùng theo đường uống, curcumin hòa tan một phần rất nhỏ vào các dịch thể của ống tiêu hóa, chỉ 7 – 10% curcumin được hấp thụ vào máu, lại bị chuyển hóa nhanh qua gan, làm cho sinh khả dụng thực tế của curcumin chỉ đạt 2-3% Với hi vọng về khả năng nạp Curcumin của màng BC và giải phóng Curcumin kéo dài, đồng thời kiểm định lại

những kết quả đã đạt được trong nghiên cứu in vitro tôi đã chọn đề tài:

3

“Nghiên cứu sinh khả dụng in vivo của Curcumin giải phóng từ

màng bacterial cellulose nạp thuốc qua đường uống”

2 Mục đích nghiên cứu

Nghiên cứu sinh khả dụng in vivo của curcumin giải phóng từ hệ

Bacterial cellulose nạp thuốc, định hướng sử dụng bào chế hệ trị liệu phóng thích dược chất kéo dài qua đường uống

3 Nhiệm vụ nghiên cứu

- Xác đinh được liều lượng BC- curcumin, và liều curcumin đối chiếu

- Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng curcumin trong huyết tương bằng máy sắc kí lỏng hiệu năng cao

- Làm thí nghiệm in vivo trên động vật nghiên cứu là thỏ

+ Sử dụng hệ BC nạp thuốc cho động vật nghiên cứu : Cho thỏ uống BC- curcumin nạp curcumin nguyên chất xuất sứ từ Ấn Độ (96%) + Thu thập mẫu máu của thỏ theo thời gian cố định trong 24h sau khi uống BC- curcumin

- Phân tích mẫu máu bằng máy HPLC để xác định sinh khả dụng của thuốc, các thông số dược động học, thời gian giải phóng của thuốc

4 Vật liệu và phạm vi nghiên cứu

 Vật liệu nghiên cứu:

- Màng BC tinh khiết có khả năng giải phóng kéo dài tốt hơn trong

in vitro

- Thuốc Curcumin dạng tinh khiết 96% có nguồn gốc từ Ấn Độ

 Phạm vi nghiên cứu:

Sinh khả dụng in vivo của curcumin giải phóng từ hệ BC –

curcumin định hướng sử dụng bào chế hệ trị liệu phóng thích dược chất kéo dài dùng qua đường uống

4

 Địa điểm nghiên cứu:

Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng - Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Viện kiểm nghiệm thuốc trung ương 2 - Quận Thanh Trì - Hà Nội

5 Phương pháp nghiên cứu

- Xác định lượng curcumin hấp thu trong viên BC

 Ý nghĩa thực tiễn:

Việc sử dụng màng BC làm vật liệu để hấp thu và giúp giải phóng thuốc Curcumin từ từ, điều này có thể làm tăng khả dụng sinh học của thuốc từ đó làm tăng hiệu quả điều trị của thuốc

7 Đóng góp mới của đề tài

Đây là đề tài đầu tiên nghiên cứu sinh khả dụng curcumin giải phóng từ hệ BC nạp thuốc Curcumin Kết quả nghiên cứu có thể định

hướng sử dụng bào chế hệ trị liệu các loại thuốc dùng qua đường uống

5

NỘI DUNG

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Bacterial cellulose (BC)

1.1.1 Cấu trúc của màng Bacterial cellulose

Màng cellulose vi khuẩn (BC) cấu tạo bởi những chuỗi polymer 1,4 glucopyranose mạch thẳng được tổng hợp từ một số loài vi khuẩn, chủ

yếu là Acetobacter xylinum (A xylinum) Màng BC do A xylinum tạo ra

có cấu trúc hóa học đồng nhất với cellulose thực vật nhưng lại có một số tính chất hóa lí như: độ bền cơ học và khả năng thấm hút nước cao, đường kính sợi nhỏ, độ tinh khiết cao, khả năng polymer hóa lớn Màng

BC có đường kính sợi nhỏ hơn 100A 0

[42], nhỏ hơn rất nhiều so với các sợi cellulose thực vật (1/100) [28], [42], [43] BC có cấu trúc siêu mịn và

độ chịu lực của nó gần bằng nhôm Khi đem so sánh đường kính của BC với đường kính của các sợi nhân tạo cho thấy: kích thước của BC còn nhỏ hơn cả kích thước của sợi tổng hợp hóa học có đường kính nhỏ nhất [34]

Hiện nay màng BC được xem là nguồn nguyên liệu mới có tiềm năng ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực khác nhau như công nghiệp thực phẩm, công nghệ giấy, công nghệ sản xuất pin [13, 57,22, 62] Trong lĩnh vực y học, màng BC đã được một số nước trên thế giới nghiên cứu ứng dụng làm màng trị bỏng, mặt nạ dưỡng da, mạch máu nhân tạo [62, 92, 38]

6

Sợi cellulose của màng BC Sợi cellulose của thực vật

Hình 1.1 Cellulose thực vật và BC [27]

1.1.2 Tính chất lý hóa của màng S – BC

Hình dạng, kích thước của sản phẩm BC rất đa dạng và có thể chủ động tạo ra kích thước mong muốn S – BC có tính chất cơ lý bền và ổn định nó giúp cho BC có thể chịu được sự tác động của môi trường như khuấy trộn hoặc các áp lực BC không tan trong môi trường phản ứng Giá thể BC có độ trương nở tốt Độ trương nở giúp cho sự khuếch tán của cơ chất và sản phẩm.Môi trường trong và ngoài chất mang không có

sự khác biệt BC đã qua xử lý không gây tác động đến chất được hấp thu Sau giai đoạn xử lý, BC chỉ là giá thể trơ về mặt hóa học, có độ trương

nở tốt Màng BC có thể tái sử dụng nhiều lần trong ứng dụng làm chất mang, an toàn cho môi trường sống [86]

1.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành màng BC

Nguồn cacbon: Cacbon có trong tế bào chất, thành tế bào, trong tất

cả các phân tử enzyme, acid nucleic, và các sản phẩm trao đổi chất Chính vì vậy, các nguồn hữu cơ có chứa cacbon có ý nghĩa hàng đầu trong đời sống vi sinh vật Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến năng suất sản xuất BC được thể hiện ở bảng 1.1

7

Bảng 1.1 Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến năng suất sản xuất màng

BC

Nguồn cacbon

monosaccharide

Năng suất tổng hợp BC

Nguồn cacbon disaccharide

Năng suất tổng hợp BC

16

7

33

7 – 11

Nguồn nitơ: ý nghĩa chủ yếu của nguồn nitơ là cung cấp nguyên

liệu cho cơ thể sinh vật để hình thành nhóm amin (-NH2 và -NH-) trong các phân tử aminoacid, nucleotit, các bazơ dị vòng [64] Nguồn nitơ dễ hấp thu nhất với vi sinh vật là NH3 và NH4

+ Vi sinh vật có khả năng đồng hóa rất tốt nitơ chứa trong các thức ăn hữu cơ Nguồn nitơ vô cơ là (NH4)2SO4, NH4NO3, nguồn nitơ hữu cơ là pepton, cao nấm men [64]

Nguồn dinh dưỡng khoáng: phospho bao giờ cũng chiếm tỉ lệ cao

nhất trong số các nguyên tố khoáng của tế bào vi sinh vật Phospho có mặt trong hầu hết các thành phần của tế bào Để đảm bảo nguồn dinh dưỡng phopho, người ta sử dụng các nguồn dinh dưỡng phospho vô cơ như K2HPO4, KH2PO4, KNO3,… [64] Ngoài ra còn nhiều nguyên tố vi lượng cũng ảnh hưởng đến quá trình tạo màng BC như Mg, Fe, S, Na,

Ca, Mn, Cl, Một trong số nguyên liệu chủ yếu ngày nay được sử dụng

để tạo màng BC là nước dừa già, nước vo gạo, dịch hoa quả, rỉ đường, nên khi nuôi cấy không cần phải bổ sung nguyên tố vi lượng nữa [64]

Các chất kích thích sinh trưởng: các vitamin như pyrodoxine, acid

nicotinic, p – aminobenzoic acid, biotinđược xác định là cần thiết cho sự

8

tăng trưởng tế bào và tổng hợp cellulose, trong khi pantothenate và riboflavin cho kết quả ngược lại [77] Nước dừa già là nguồn nguyên liệu chủ yếu được sử dụng để nuôi cấy vi khuẩn thu màng BC Tùy theo giống dừa, tuổi của quả dừa mà các thành phần hóa học trong nước dừa

có khác nhau Lượng đường khử tổng và protein trong nước dừa tăng lên khi dừa càng chín Đường ở đây có thể là glucose, fructose, sucrose hay sirbitol Ngoài ra, nước dừa còn nhiều khoáng chất, vitamin, acid amin, phù hợp cho quá trình hình thành màng BC [64] Nước gạo cũng là một trong những thành phần thích hợp để tạo màng BC vì trong nước gạo chứa nhiều cacbonhydrat, các vitamin nhóm B, các nguyên tố vi lượng như Fe, Zn, và acid amin

Ngoài ra các điều kiện nuôi cấy như độ pH, nhiệt độ, độ thông khí, thời gian nuôi cấy, cũng ảnh hưởng đến quá trình hình thành màng BC

Vi khuẩn A xylinum phát triển thuận lợi trên môi trường có pH

thấp Do đó môi trường nuôi cấy thu màng BC cần được bổ sung thêm acid acetic nhằm acid hóa môi trường, đồng thời nó có tác dụng sát khuẩn, giúp ngăn chặn sự phát triển của vi sinh vật có hại [50] [64] [86]

- Nhiệt độ thích hợp để nuôi cấy vi sinh vật tạo màng BC là từ khoảng 250C đến 300

C Ở nhiệt độ thấp quá, quá trình lên men xảy ra chậm Nếu nhiệt độ quá cao sẽ ức chế hoạt động và đến mức nào đó sẽ đình chỉ sự sinh sản của tế bào và hiệu suất lên men sẽ giảm[43], [44], [49], [53]

- Vi khuẩn A xylinum là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc nên điều kiện

tiên quyết, quyết định đến năng suất tạo màng BC là độ thông khí Lên men tĩnh cần sử dụng dụng cụ có bề mặt thoáng và lớp môi trường mỏng [96]

- Tùy vào thời gian nuôi cấy, người ta thu được màng với độ dày mong muốn Thường 24h sau khi nuôi cấy sẽ xuất hiện lớp đục trên bề

9

mặt, phía dưới có những sợi tơ nhỏ hướng lên Sau 36 – 48h sẽ hình thành lớp màng mỏng và ngày càng dày lên

1.1.4 Ứng dụng của màng BC

BC có độ tinh khiết cao, độ bền dai cơ học lớn, khả năng thấm hút nước cao, có thể bị thủy phân bởi enzyme, Vì vậy, BC được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực công nghệ khác nhau như: thực phẩm, công nghiệp dệt, mỹ phẩm, công nghệ giấy, công nghệ pin, đặc biệt trong lĩnh vực y học.Trong y học, màng BC thu được từ quá trình nuôi cấy tĩnh được nghiên cứu và sử dụng làm da nhân tạo Ở Brazil, màng BC ướt tinh sạch được sản xuất và bán ra thị trường như một loại da nhân tạo dùng đắp vết thương [8] Trường Đại học Y dược Thành phố Hồ Chí Minh cũng nghiên cứu sử dụng màng BC có tẩm dầu mù u làm màng trị bỏng được thực nghiệm ở thỏ Kết quả cho thấy rằng màng BC giúp vết thương mau lành và ngăn không cho vết thương nhiễm trùng [6] Ngoài

ra, màng BC còn được ứng dụng trong ghép mô, cơ quan nội tạng, làm tác nhân vận chuyển thuốc Dựa vào đặc tính trương nở của BC người ta ứng dụng làm tác nhân vận chuyển thuốc, làm tá dược tự rã, dùng làm huyền phù BC để ổn định các tá dược dạng nước, làm cho chúng không

bị tách pha khi bảo quản lâu ngày

Tính đến cuối năm 2014 trên thế giới chỉ có 18 công trình nghiên cứu ứng dụng BC trong quá trình phân phối thuốc đã được báo cáo [33], trong đó có 9 nghiên cứu với màng BC tinh khiết, 2 nghiên cứu với thể chất biến đổi màng BC và 7 với các vật liệu nanocomposite Một số công trình nghiên cứu về ứng dụng của BC trong việc phân phối thuốc:

Amin et al.[13] đã báo cáo việc sử dụng màng BC làm màng bọc cho Paracetamol bằng cách sử dụng kĩ thuật phun phủ Kết quả cho thấy màng BC giúp cho thuốc được giải phóng một cách kéo dài làm tăng hiệu quả sử dụng của thuốc

10

Huang et al [35] nghiên cứu việc sử dụng màng BC cho việc kiểm soát in vitro của Berberine Ngoài thẩm thấu qua da, thí nghiệm kiểm soát sự giải phóng thuốc qua màng BC còn được thử nghiệm mô phỏng trong dạ dày (SGF), ruột (SIF) Các kết quả thu được cho thấy rằng thuốc đã được giải phóng với một tốc độ từ từ trong pH thấp (như SGF), trung gian trong điều kiện kiềm và tỷ lệ giải phóng nhanh nhất đã được quan sát với điều kiện gần như trung tính (như SIF), với những đường cong phát hành được kiểm soát bằng cách khuếch tán

Stroescu et al đã báo cáo việc sử dụng của poly (vinyl alcohol) –

BC cho sự kiểm soát các axit sorbic [25] và vanillin [52] (như là một kháng sinh thành phần), chứng minh một lần nữa rằng các tỷ lệ phát hành được kiểm soát bằng cách khuếch tán

Việc sản xuất các vật liệu tổng hợp nano – BC cho quá trình kiểm soát thuốc đã được thử nghiệm với một số polymer, cụ thể là PAA , polyvinyl alcohol [25], [52], polyacrylamide và polyme in dấu phân tử [12]

Ở Việt Nam, việc nghiên cứu BC làm tác nhân vận chuyển thuốc còn là một hướng đi mới

11

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của curcumin [73]

- Curcumin là tinh thể màu nâu đỏ, là hoạt chất được chiết ra từ của nghệ vàng thuộc họ gừng Hiện tại người ta tìm thấy curcumin tồn tại ở 4 dạng hợp chất:

12

Chính vì curcumin là sắc tố tạo nên màu vàng sáng nên curcumin được dùng làm chất phụ gia thực phẩm Trong chất phụ gia thực phẩm curcumin được kí hiệu dưới ám số E100 [76] [78]

1.2.2 Tính chất hóa lý của curcuminoid

Bền với nhiệt độ, không bền với ánh sáng Khi ở dạng dung dịch Cur

dễ bị phân hủy bởi ánh sáng và nhiệt độ [51]

Tan trong chất béo, ethanol, methanol, dicloromethane, aceton, acid acetic băng và hầu như không tan trong nước ở môi trường acid hay trung tính (độ tan <10 mg ở 250

13

chưa bão hòa ở vị trí ortho cũng chứa nhóm α, β diceton ở carbon số 3 và

5 Nhóm diceton có thể bị chuyển dạng thuận nghịch giữa dạng enolic và cetonic (hình 1.3) Sự chuyển dạng phụ thuộc vào pH Dạng bis-ceto tồn tại chủ yếu trong môi trường acid và trung tính, còn dạng enol chiếm ưu thế trong môi trường kiềm[73] Ở dạng bis-ceto, carbon vị trí số 4 của liên kết hepten có chức năng như một chất cho proton mạnh, còn dạng enol đóng vai trò như một chất cho electron Điều này làm cho curcumin

có đặc tính chống oxy hóa [73]

Hình 1.3 Dạng hỗ biến ceto-enol của curcumin

- Dung dịch curcumin có màu vàng tại pH 2,5 - 7 và màu đỏ ở pH > 7 [32]

1.2.3 Hoạt tính sinh học

Các nghiên cứu in vitro, in vivo và trên lâm sàng đã chứng minh các

đặc điểm dược động học, tính an toàn và khả năng cho hiệu quả điều trị với nhiều loại bệnh của curcumin Curcumin đã được nghiên cứu ứng dụng nhiều trong lĩnh vực y sinh học với các định hướng tác dụng như: chống oxy hoá, ức chế con đường truyền tín hiệu tế bào, ảnh hưởng đến hoạt động của các enzym trong tế bào, khả năng thay đổi quá trình phiên

mã gen và kích hoạt cơ chế làm tế bào chết theo chương trình (apoptosis)

Từ xa xưa, Curcumin đã được dùng làm màu thực phẩm và dùng trong các bài thuốc dân gian Cur đã được sử dụng như một vị thuốc dân gian để chữa một số bệnh như bệnh gan, nhiễm khuẩn, bệnh ngoài da, viêm loét dạ dày, phòng và chữa một số loại ung thư…Cur không gây

14

độc đối với người ở liều lượng lên đến 10g/ngày Chính vì tính an toàn nên Cur có nhiều tiềm năng sử dụng trong dược phẩm [48]

Curcumin còn là chất chống viêm và chống oxy hóa điển hình, có thể sử dụng trong điều trị bệnh mà không sợ gây loãng xương, không gây loét dạ dày

Ngoài ra, Curcumin cũng đã được chứng minh là có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm cao, có triển vọng lớn trong điều trị viêm gan siêu vi

B, C và cả HIV với giá rẻ [10], [12]

Như vậy ta thấy hoạt tính của Curcumin rất phong phú và đa dạng,

 Hoạt tính kháng ung thư

Curcumin là được xem một hoạt chất điều trị ung thư vào loại mạnh theo cơ chế tự hủy diệt từng phần các tế bào ác tính [3] Nó vô hiệu hóa

tế bào ung thư và ngăn chặn không cho hình thành các tế bào ung thư mới mà không ảnh hưởng đến các tế bào lành tính bên cạnh, nó loại bỏ các gốc tự do và các loại men gây ung thư có trong thức ăn, nước uống hằng ngày Vì vậy, Curcumin được xem là hoạt chất hỗ trợ, phòng chống

và chữa trị ung thư một cách có hiệu quả [3]

Ngoài ra, Curcumin còn có khả năng ức chế sự hình thành khối u, tác động đến hầu hết các giai đoạn của quá trình hình thành và phát triển của khối u như: biến đổi, phát triển, lan rộng của tế bào ung thư [3]

 Hoạt tính kháng oxy hóa

Các dạng oxygen hoạt động (ROS- Reactive oxygen species) là thành phần tham gia vào các cơ chế gây bệnh khác nhau trong cơ thể [12] Curcumin có khả năng ức chế hiệu quả các ROS trong cơ thể như:

anion superoxide, H2O2, gốc nitrite ở mức độ in vitro và in vivo [26]

Curcumin có hoạt tính sinh học mạnh và đa dạng, các hoạt tính đó đều xuất phát từ tính kháng oxy hóa mạnh của Curcumin, tính kháng oxy hóa của nó mạnh hơn vitamin E [41]

15

Do vậy thông qua hoạt tính kháng oxy hóa, Curcumin có khả năng khống chế sự phát triển nhiều loại bệnh tật và các tác nhân gây hại khác nhau Cur thể hiện khả năng ức chế mạnh với những thương tổn do H2O2gây ra ở tế bào sừng, tế bào fibroblast và các tế bào NG108 [48] Cur ngăn chặn sự peroxy hóa lipid trong vi lạp thể gan, màng hồng cầu và dịch đồng thể não chuột nhờ vậy mà nó duy trì hoạt động của những enzyme kháng oxy hóa như SOD, catalase và glutathione peroxidase [15]

Trong cấu trúc của Cur có hydrogen của nhóm phenolic và hydrogen của nhóm methylene (giữa liên kết β - diketone) đều có thể tạo nên khả năng kháng oxy hoá Tuy nhiên, hoạt tính của Curcumin thực chất là do hydrogen ở vị trí nào gây ra vẫn còn nhiều tranh cãi

W.F.Chen và cộng sự [90] nghiên cứu khả năng ức chế 2,2’- azobis (2-amidinopropane hydrochloride) (AAPH), Cu2+ trong oxy hóa lipoprotein nồng độ thấp của curcumin và các chất tương tự như curcumin nhưng không có nhóm phenolic:

1,7-bis (3,4-dimethoxyphenyl)-1,6-heptadiene 3,5-dione (1) 1,7-bis(4-methoxyphenyl)-1,6-heptadiene-3,5-dione (2)

Hoạt tính kháng oxy hoá của các chất (1), (2), (3) đều yếu hơn các dẫn xuất Cur nhiều lần Do đó, nhóm nghiên cứu cho rằng nhóm phenolic đóng vai trò quan trọng tạo nên hoạt tính của các dẫn xuất curcuminoid

L Chen và cộng sự [60] cho rằng nhóm enolic có tính acid cao hơn nhóm phenolic nên hydrogen của enolic đóng vai trò quyết định hoạt tính kháng oxy hoá của Curcumin Do đó trong quá trình trao đổi proton để loại bỏ gốc tự do hydrogen của enolic tách ra đầu tiên

16

K I Priyadarsini và cộng sự [48] lại cho rằng hoạt tính kháng oxy hoá của Curcumin chủ yếu là do quá trình tách hydrogen trên nhóm phenolic và một phần trên nhóm methylene

Ngoài ra, Curcumin có khả năng tạo phức mạnh với các ion kim loại như chì, cadmium, sắt… mà các ion kim loại này là nhân tố xúc tác cho nhiều phản ứng oxy hoá, đầu độc tế bào thần kinh và là nguyên nhân gây ra các căn bệnh như Alzheimer, Parkinson,… Do vậy, Curcumin là một trong các hợp chất thiên nhiên tiềm năng có thể sử dụng để loại trừ các ion kim loại độc trong cơ thể người [46]

1.2.4 Hạn chế của curcumin

Tính chất dược động học và dược lực học của Curcumin có ảnh hưởng rất lớn đến hiệu quả điều trị Curcumin có những đặc điểm dược động học không thuận lợi như: hấp thu kém, chuyển hoá và thải trừ khỏi

cơ thể nhanh nên sinh khả dụng rất thấp [46] Curcumin là một hợp chất

kỵ nước, độ hoà tan ở pH sinh lý rất thấp (khoảng 11mg/mL) Curcumin

có tốc độ chuyển hoá và thải trừ nhanh, bị thuỷ phân trong môi trường kiềm và phân huỷ khi gặp ánh sáng, nhiệt độ cao và điều kiện oxi hoá [46] Khả năng hấp thu curcumin kém ở ruột có thể do độ tan thấp, ngoài

ra còn bị phân huỷ ở pH trung tính hoặc kiềm và bị ảnh hưởng chuyển hóa của các enzym Nghiên cứu đánh dấu phóng xạ đã cho thấy hầu hết liều uống được bài tiết trong phân và một phần ba curcumin vẫn không thay đổi cấu trúc [48] Rất nhiều phương pháp đã được ứng dụng để làm tăng sinh khả dụng của curcumin thông qua làm tăng độ tan, độ ổn định

và tính thấm qua màng tế bào bằng các kỹ thuật hoá học, kỹ thuật bào chế phân tử [21] Một số kỹ thuật bào chế chính làm tăng sinh khả dụng của curcumin như: tạo phức hợp dạng lồng phân tử curcumin - cyclodextrin; bào chế dưới dạng liposome, tạo micell với các chất diện hoạt; bào chế phức hợp phytosome; tạo tiểu phân nano curcumin với các

17

chất mang polymer Sử dụng kết hợp cùng với các chất tăng sinh khả dụng cũng đã được ứng dụng (kết hợp với piperine để ức chế glucuronid hoá) Một số nghiên cứu còn tổng hợp các cấu trúc tương tự curcumin nhằm tạo ra các chất có nhiều ưu điểm hơn Tuy nhiên, cho tới nay, vẫn chưa phát triển thành công được một loại thuốc nào từ curcumin có tác dụng như mong đợi trong điều trị lâm sàng

1.2.5 Sinh khả dụng của curcumin

Nghiên cứu dược động học của curcumin được báo cáo bởi Yang K

và cộng sự cho thấy: nồng độ tối đa curcumin trong huyết tương chuột cống sau khi uống liều 500mg/kg là 0,06 ± 0,01 g/ml, chứng tỏ SKD đường uống chỉ khoảng 1% [93] Tương tự, theo nghiên cứu của Shoba

G và cộng sự, nồng độ curcumin cao nhất trong huyết tương là 1,35 ± 0,23g/ml sau 1 giờ dùng đường uống với liều 2g/kg trên chuột cống, trong khi người tình nguyện khỏe mạnh (khối lượng 50-75kg) uống liều đơn 2g curcumin (4 viên nang 500mg), nồng độ trong huyết tương rất thấp, chỉ khoảng 0,006 ± 0,005g/ml trong 1 giờ [74] Trong nghiên cứu đánh giá SKD trên chuột cống của Allam A N và cộng sự, với liều 340mg/kg trên chuột cống, lượng curcumin không hấp thu trong nhung mao ruột và lượng tìm thấy trong tế bào nhày khá lớn, trong khi lượng curcumin trong huyết tương không thể tìm thấy Điều này còn chứng tỏ curcumin có tính thấm kém qua hệ thống dạ dày, ruột [17]

Sau hấp thu, curcumin bị chuyển hóa qua gan (chuyển hóa lần đầu) Sau đó, curcumin bị thải trừ nhanh ở dạng liên hợp với glucuronid và sulfat Khoảng 60-70% curcumin dùng đường uống được thải trừ qua

phân [15][73] Dihydrocurcumin

Như vậy, hấp thu curcumin từ ruột kém có thể do độ tan thấp, tốc độ hòa tan chậm nên dược chất hòa tan không hoàn toàn Ngoài ra, curcumin còn bị phân hủy trong môi trường sinh lý của hệ thống dạ dày

18

ruột, tốc độ chuyển hóa và thải trừ nhanh SKD của curcumin thấp, dẫn đến việc sử dụng trong điều trị hạn chế

- Curcumin có thể là thụ thai khó khăn hơn

- Người bệnh gan, sạn mật Curcumin kích thích túi, ống mật

- Curcumin có thể làm những người đang dùng thuốc "loãng máu" như aspirin, clopidogrel (Plavix) dễ chảy máu hơn Người uống thuốc NSAIDS như ibuprofen, aspirin để trị sưng khớp, giảm viêm có thể còn

dễ bị chảy máu nhiều hơn với curcumin

- Người bệnh tiểu đường đang dùng thuốc hạ đường máu: curcumin

có thể làm đường máu quá thấp (hypoglycemia) làm ngất xỉu

- Người đang uống thuốc làm giảm acid bao tử (vd proton pump inhibitor: omeprazole), curcumin có thể làm acid dạ dày được sản xuất nhiều hơn

- Ngoài ra nhiều thuốc có tương tác với curcumin, cũng như chất piperine của tiêu được kèm theo nghệ cho dễ hấp thụ có thể tương tác với

19

một số thuốc như phenytoin (chống co giật), theophylline, propanolol (hạ huyết áp)

[Bác sĩ Hồ Văn Hiền- Hỏi đáp Y học, 17/10/2016]

1.3 Thuốc tác dụng kéo dài

 Khái niệm:

Thuốc tác dụng kéo dài (TDKD) là những chế phẩm có khả năng kéo dài quá trình giải phóng và hấp thu dược chất từ dạng thuốc nhằm duy trì nồng độ dược chất trong máu trong vùng điều trị một thời gian dài với mục đích kéo dài thời gian điều trị [5]

 Ưu điểm:

- Duy trì nồng độ dược chất trong máu trong vùng điều trị, giảm được dao động nồng độ máu của thuốc (tránh được hiện tượng đáy - đỉnh), do đó giảm tác dụng không mong muốn của thuốc [5]

- Giảm số lần dùng thuốc cho người bệnh, tránh hiện tượng quên thuốc, bỏ thuốc, thức dậy nửa đêm uống thuốc… Từ đó đảm bảo sự tuân thủ điều trị của bệnh nhân, nâng cao hiệu quả điều trị của thuốc [5]

- Nâng cao sinh khả dụng của thuốc do thuốc do thuốc được hấp thu đều đặn, triệt để hơn Trong nhiều trường hợp có thể tập trung được nồng

độ thuốc cao tại cơ quan đích, nâng cao hiệu quả điều trị [5]

 Nhược điểm:

- Đòi hỏi kĩ thuật cao và trang thiết bị phức tạp

- Không thải trừ ngay ra khỏi cơ thể nếu xảy ra hiện tượng ngộ độc thuốc hoặc người dùng không chịu thuốc

- Có ít dược chất bào chế được dưới dạng tác dụng kéo dài

1.4 Phương pháp HPLC

 Phương pháp HPLC

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ra đời năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ

20

điển HPLC là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng

và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang

đã được biến bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ Phương pháp này ngày càng được sử dụng rộng rãi và phổ biến vì nhiều lý do: có

độ nhạy cao, khả năng định lượng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt

 Hệ thống HPLC:

Máy HPLC có cấu tạo gồm các phần sau:

+ Bình đựng dung môi: Hiện tại máy HPLC thường có 4 đường dung môi vào đầu bơm cao áp cho phép chúng ta sử dụng 4 bình chứa dung môi cùng một lần để rửa giải theo tỉ lệ mong muốn và tổng tỉ lệ dung môi của 4 đường là 100%

+ Bộ khử khí Degasse: Mục đích của bộ khử khí nhằm loại trừ các bọt nhỏ còn sót lại trong dung môi pha động Nếu như trong quá trình phân tích mà dung môi pha động còn sót lại các bọt khí thì sẽ cho kết quả phân tích sai

+ Bơm cao áp: Mục đích để bơm pha động vào cột thực hiện quá trình chia tách sắc kí Pump phải tạo được áp suất cao khoảng 250at-500at, và pump phải tạo dòng liên tục Lưu lượng bơm từ 0,1- 9,999ml/ phút Tốc độ bơm là hằng định theo thông số đã được cài đặt Hiện tại bơm có 2 Pisstone để thay phiên nhau đẩy dung môi liên tục + Bộ phận tiêm mẫu: Để đưa mẫu vào cột phân tích theo phương pháp không ngừng dòng chảy với dung tích 5 - 100µl Có 2 cách lấy mẫu vào cột: bằng tiêm mẫu thủ công và tiêm mẫu tự động

+ Cột sắc kí: Cột chứa pha tĩnh được coi là trái tim của hệ thống sắc

kí lỏng hiệu năng cao Cột pha tĩnh thường làm bằng thép không rỉ, chiều dài cột khoảng 10- 30cm, đường kính trong 1-10mm, hạt chất nhồi cỡ

21

Ø=5- 10µm, ngoài ra còn một số trường hợp đặc biệu về kích thước và kích cỡ hạt, …

+ Detector: Là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho tín hiệu ghi trên sắc đồ để có thể định tính và định lượng Tùy theo tính chất của các chất cần phân tích mà người ta sử dụng loại Detector thích hợp và phải thỏa mãn điều kiện trong cùng một nồng độ nhất định của chất phân tích

+ Bộ phận ghi tín hiệu: Để ghi tín hiệu phát hiện do Detector truyền sang

+ In kết quả: Sau khi đã phân tích xong các mẫu ta sẽ in kết quả do phần mềm tính toán ra giấy để hoàn thiện hồ sơ

1.5 Nghiên cứu in vivo

 Quy định về đánh giá sinh khả dụng in vivo

Sinh khả dụng in vivo đánh giá giai đoạn hấp thu dược chẩt từ chế

phẩm bào chế

Hiện nay, nhiều nước trên thế giới đã có những tiểu ban chuyên môn đánh giá sinh khả dụng và tương đương sinh học Họ được phép ra quy định hoặc hướng dẫn về việc đánh giá sinh khả dụng và tương đương sinh học (như Mỹ, Canada, Cộng đồng châu Âu, Australia ) [5]

- Theo quy định bổ xung 1984 của Mỹ, có thể đánh giá sinh khả dụng bằng các phương pháp sau (xếp theo thứ tự độ chính xác, độ nhạy,

độ lặp lại giảm dần) [5]:

+ Thử in vivo trên cơ thể động vật bằng cách xác định sự biến thiên

nồng độ dược chất hoặc chất chuyển hoá trong máu, huyết tương, huyết thanh hoặc các dịch sinh học thích hợp khác theo thời gian

+ Thử vitro đã được chứng minh là tương quan tỷ lệ thuận với số sinh khả dụng in vivo trên cơ thể

- Thử in vivo ở động vật bằng các cách sau [5]:

22

+ Đo dược chất hoặc chất chuyển hoá bài tiết trong nước tiểu theo thời gian

+ Đo tác dụng dươc lí của dược chất hoặc chất chuyển hoá theo thời gian nếu chất tác dụng đó có thể đo được, một cách đủ chính xác, đủ nhạy và lặp lại So sánh tác dụng lâm sàng một cách thích hợp

- Những phương pháp đặc biệt khác (có quy định riêng) [5]

Sinh khả dụng được đánh giá trên ngưới hoặc súc vật thí nghiệm nên sự dao động giữa các cá thể thường là khá lớn Vì vậy khi đánh giá cần có đề cương quy định rõ các điều kiện đánh giá như:

Đối tượng thử: động vật đã thành thục, khoẻ mạnh, được ăn uống và sinh hoạt theo chế độ quy định (nhịn ăn qua đêm ít nhất 10 giờ trước khi dùng thuốc và 2 giờ sau khi dùng thuốc) Động vật đã được kiểm tra kĩ

về các hằng số sinh lý, sinh hoá trước khi thử thuốc và phải được thông báo đầy đủ về mục tiêu, phương pháp thử và nguy cơ có thể có phản ứng phụ của thuốc

Nguyên tắc lựa chọn động vật thí nghiệm cần làm giảm nhỏ giao động giữa các cá thể, chỉ dùng số lượng động vật ở mức tối thiểu cần thiết Trên động vật, nếu kết quả nghi ngờ cần chọn lại mẫu và động vật làm thực nghiệm lại

Lấy mẫu thử: Nếu thử trên máu số lượng mẫu phải đủ đặc trưng cho pha hấp thu và pha thải trừ, đủ để xác định được đỉnh nồng độ và cho phép xác định được diện tích dưới đường cong của đồ thị ở ít nhất 3 lần thời gian bán thải của dược chất Nếu thử liều đơn theo phương pháp thiết kế chéo thường lấy 10 - 15 mẫu [5]

Mẫu đối chiếu: Phải đạt các tiêu chuẩn quy định như: Phải là mẫu

đã được xét duyệt cấp giấy phép sản xuất, lưu hành trên cơ sở đã được thử lâm sàng Tốt nhất dùng sản phẩm gốc của nhà phát minh hoặc sản phẩm có uy tín trên thị trường [5]

23

- Bố trí thử nghiệm và xử lí kết quả: Thường dùng phương pháp thiết kế chéo ngẫu nhiên Động vật thường là 12 - 24 con, được chia thành 2 nhóm uống thuốc 2 lần Trong mỗi nhóm, chọn ngẫu nhiên 1 trong 2 sản phẩm (thử hoặc đối chiếu) Thời gian giữa 2 lần dùng thuốc ít nhất bằng 5 lần thời gian bản thải (t 1/2) của dược chất để đảm bảo thuốc của lần dùng trước đã được đào thải hết rối mới dùng tiếp lần thứ 2 Số liệu thu được được sử lý bằng phương pháp thống kê Phương pháp xử lý ảnh hưởng nhiều đến kết quả, do đó cần được quy định rõ trong đề cương đánh giá sinh khả dụng và tương đương sinh học [5]

 Nghiên cứu in vi vo thuốc curcumin

Nghiên cứu in vivo dựa trên việc đánh giá nồng độ thuốc trong

huyết tương sau khi uống [17]

Do khả năng thấm kém, độ tan thấp, bị chuyển hóa và thải trừ nhanh trong cơ thể nên các mẫu huyết tương thường có nồng độ curcumin rất thấp Vì vậy, trong nghiên cứu đánh giá sinh khả dụng của các dạng thuốc chứa curcumin cần lựa chọn đối tượng thử và phương pháp định lượng curcumin trong huyết tương cần có độ nhạy cao

Về đối tượng thử, nghiên cứu SKD đường uống của curcumin được tiến hành trên chuột cống [36], [46], [58], [72] hoặc chuột nhắt [30], [32], [68], [97] Bên cạnh đó cũng có một số nghiên cứu được thực hiện trên người tình nguyện [72] Nghiên cứu trên chuột có ưu điểm là đơn giản hơn nghiên cứu trên người tình nguyện về khía cạnh đạo đức, pháp

lý và kinh tế Chuột và người có nhiều điểm tương tự về hấp thu và mô hình biểu thị sự vận chuyển tương tự ở ruột non nhưng mức độ biểu thị

và mô hình enzym chuyển hóa ở dạ dày ruột có thể khác nhau [23] Bộ gen của chuột và người giống nhau đến 99% Chuột cũng là một loài động vật có vú, dễ sinh sản và rẻ tiền hơn so với các loại động vật khác Đồng thời, chuột là động vật dễ nuôi nhốt và bắt giữ bằng tay và sự khác

24

biệt về gen thấp, dẫn đến sai khác về phạm vi đáp ứng hẹp hơn so với các động vật thí nghiệm khác [83] Nhược điểm của việc sử dụng chuột

trong nghiên cứu in vivo là sự khác nhau cơ bản giữa người và chuột về

con đường và tốc độ chuyển hóa Việc cho chuột uống thuốc khó khăn hơn trên người, thể tích dịch sinh học ít và lấy mẫu khó khăn [83]

Các nghiên cứu đánh giá sinh khả dụng in vivo đều cho chuột uống

mẫu tiểu phân nano curcumin bằng ống thông vào dạ dày Các mẫu máu được lấy ra sau từng khoảng thời gian xác định từ tĩnh mạch đuôi chuột [36], hoặc lấy máu từ đám rối hốc mắt chuột sau khi gây mê bằng ether [51], [72], có thể lấy bằng cách chọc vào tim [17] Máu thu được trộn với thành phần chống đông (heparin [72] hoặc EDTA [51]) bằng cách lắc và

ly tâm thu lấy phần huyết tương Trong một số trường hợp không thể lấy mẫu nhiều lần trên một cá thể, có thể lấy mẫu trên một nhóm cá thể hoặc

sử dụng mô hình dược động học quần thể

Về xử lý mẫu, mẫu huyết tương được chiết bằng dung môi ethyl acetat, methanol [48], ethanol [37] hoặc tert-butyl methyl ether [93] Ly tâm lấy dịch trong Bốc hơi dung môi trong dòng khí nitrogen ở nhiệt độ thích hợp Phần cắn hòa tan vào methanol và tiến hành phân tích

Mẫu huyết tương sau khi xử lý được định lượng curcumin bằng phương pháp thích hợp [72] Cá biệt có một số nghiên cứu định lượng cả curcumin và chất chuyển hóa của curcumin trong huyết tương [24], [58] Chất chuyển hóa của curcumin có thể ở dưới dạng tự do hoặc liên hợp dạng glucuronid hoặc sulfat Khi đó, mẫu huyết tương được ủ với dung dịch enzym sulfatase và glucuronidase ở 37oC trong 1 giờ để chuyển curcumin sulfat và glucuronid thành curcumin tự do trước khi chiết [97]

Về phương pháp định lượng, hầu hết các nghiên cứu sử dụng phương pháp HPLC với ưu điểm nhanh, đơn giản, có độ nhạy cao Điều kiện tiến hành định lượng curcumin trong dịch sinh học bằng phương

25

pháp HPLC trong các nghiên cứu về cơ bản là sử dụng cột C18 ở nhiệt

độ thích hợp Thành phần pha động thường là các dung môi phân cực như acetonitril, methanol phối hợp với nước Tốc độ dòng thường từ 1 đến 2ml/phút Phần lớn các nghiên cứu sử dụng detector tử ngoại bước sóng từ 420-430nm hoặc detector huỳnh quang với bước sóng kích thích

và phát xạ lần lượt 426nm và 536nm hoặc detector khối phổ Một số nghiên cứu sử dụng chất chuẩn nội như β-17-estradiol acetat [72], [95], benzocain [66] hoặc emodin [97] Bên cạnh đó, một số nghiên cứu sử dụng phương pháp sắc ký lỏng kết hợp với khối phổ LC-MS hoặc LC-MS/MS [65]

So với các mô hình nghiên cứu sinh khả dụng khác, nghiên cứu in

vivo cung cấp được các yếu tố thể hiện sự phản ứng của cơ thể sống với

thuốc Từ đó có thể dự đoán được các tác dụng, lựa chọn đường dùng,

liều dùng trên người Đánh giá sinh khả dụng in vivo là cơ sở lựa chọn thuốc điều trị thay thế Tuy nhiên, nghiên cứu in vivo có hạn chế giá

thành cao, tốn thời gian và hạn chế về mặt đạo đức sinh học

Gao Y và cộng sự đã đánh giá sinh khả dụng của hỗn dịch nano curcumin trên chuột nhắt với liều 250mg/kg Các thông số dược động học tính toán không dựa trên mô hình ngăn trên hai nhóm cá thể, mỗi nhóm gồm 27 chuột Giá trị AUC0- của hỗn dịch nano khoảng 617,82 ± 70,92g/ml.giờ, gấp 6,80 lần so với hỗn dịch curcumin (90,12 ± 16,85g/l.giờ) Cmax đối với hỗn dịch nano curcumin khoảng 174,75 ± 49,05mcg/ml, cao hơn so với hỗn dịch curcumin (12,58 ± 4,28mcg/ml) (p < 0,01) [30]

Dựa trên cơ sở phân tích trên, để giải quyết vấn đề tăng sinh khả dụng của curcumin, nghiên cứu lựa chọn bào chế dưới dạng hệ tiểu phân nano bằng phương pháp giảm kích thước tiểu phân sử dụng kỹ thuật nghiền bi siêu mịn kết hợp với đồng nhất hóa nhờ lực phân cắt lớn

26

Trong điều kiện tiến hành thực nghiệm, nghiên cứu lựa chọn các điều kiện thử in vitro với thiết bị thử kiểu cánh khuấy và mẫu thử được đưa

trực tiếp vào môi trường hòa tan Phương pháp đánh giá sinh khả dụng in

vivo dựa trên việc xác định nồng độ curcumin trong huyết tương chuột

nhắt Do curcumin bị chuyển hóa mạnh thành nhiều chất chuyển hóa, trong đó có tetrahydrocurcumin và nồng độ các chất này đều thấp nên các phương pháp định lượng nồng độ thuốc trong huyết tương được lựa chọn cần đáp ứng được cả yêu cầu độ nhạy, độ chính xác cao Do đó, phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao được lựa chọn

1.6 Tình hình nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam

- Hu L., Shi Y., Li J H., et al (2015), [37] "Tăng cường sinh khả dụng của Curcumin qua đường miệng bằng hệ thống phân tán rắn mới"

- Ji H., Tang J., Ren J., et al (2015) [46], "Các hạt nano lipid rắn

có chứa curcumin với Brij78 và TPGS đã cải thiện sinh khả dụng ở miệng và sự hấp thu chất curcumin ở ruột", Phân phát thuốc,

- Kumar A., Ahuja A., Ali J., và các cộng sự (2014) [51], "Chất chứa nano lipid chứa chất curcumin để cải thiện sinh khả dụng, tính ổn định và tính độc tế bào đối với các tế bào glioma ác tính"

- Liu A., Lou H., Zhao L., et al (2006) [58], "Định lượng bằng

LC / MS / MS cho curcumin và tetrahydrocurcumin trong huyết tương chuột và ứng dụng vào nghiên cứu dược động học của phức hợp phospholipid curcumin"

27

- Liu W., Zhai Y., Heng X., et al (2016) [59], "sinh khả dụng của curcumin ở đường miệng: các vấn đề và tiến bộ"

- L Shen, H.-F Ji [60], Nghiên cứu lý thuyết về đặc tính hóa lý của curcumin

- Mishra S., Karmodiya K., Surolia N., Surolia A (2008) [61],

"Tổng hợp và thăm dò các chất tương tự curcumin mới như các chất chống sốt rét"

- Onoue S., Takahashi H., Kawabata Y (2010) [65], "Thiết kế công thức và các nghiên cứu quang hóa về sự phân tán chất curcumin của tinh thể nano với sự cải thiện sinh khả dụng của đường miệng"

- J.S.Shim và cộng sự cũng đã tổng hợp được một số dẫn xuất hydrazinocurcumin (HC) và hydrazinobenzoylcurcumin (HBC)

 Việt Nam

- Nguyễn Đức Hạnh, Nguyễn Minh Đức, Đặng văn Giáp [4], xây dựng quy trình chiết xuất cao nghệ curcuma longa L., 2010

- Trần Văn Được [2], nghiên cứu viên nén glipizid giải phóng kéo

dài sử dụng cốt thân nước HPMC, trường Đại học dược, 2013

- Lê Xuân Tiến [10], “Nghiên cứu tổng hợp hydrazincurcumin và isoxaxolcurcumin- Khảo sát hoạt tính sinh học của chúng”

- Trần Thanh Vũ [12], “Tổng hợp và xác định hoạt tính sinh học của dẫn xuất pheny- lhydrazinocurcuminoid”

Ở Việt Nam việc nghiên cứu BC làm tác nhân vận chuyển thuốc còn là một hướng đi mới

28

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Thỏ

Thỏ là động vật có vú nhỏ được xếp vào họ Leporidae thuộc bộ

Lagomorpha, sinh sống ở nhiều nơi trên thế giới [9]

Thỏ là vật nuôi rất nhạy cảm với các yếu tố ngoại cảnh, khả năng thích ứng với môi trường kém Thân nhiệt của thỏ thay đổi theo nhiệt độ không khí môi trường Thỏ có ít tuyến mồ hôi dưới da, cơ thể thải nhiệt

chủ yếu qua đường hô hấp [9]

- Sinh lý tiêu hóa:

Thỏ là gia súc có dạ dày đơn, dạ dày thỏ co giãn tốt nhưng co bóp yếu Các chất dinh dưỡng được phân giải nhờ các men tiêu hóa của dạ dày và ruột sẽ được hấp thụ chủ yếu qua ruột non Ruột già chủ yếu hấp

thụ các muối và nước [9]

Manh tràng là đoạn đầu của ruột già có kích thước rất lớn Đây là bộ

phận chính tiêu hóa chất xơ (cỏ, lá cây,…) nhờ có hệ vi sinh vật cộng sinh

[9]

- Sinh lý sinh sản:

Thỏ rất mắn đẻ, tuổi thành thục sinh dục từ 5 – 6 tháng, mang thai trung bình 30 ngày và sau khi đẻ 1 - 3 ngày động dục trở lại Chu kỳ động dục của thỏ thay đổi (10 - 16 ngày) Thỏ cái chỉ cho phối giống khi động dục và 9 - 10 giờ sau khi giao phối trứng mới rụng (Đinh Xuân

Bình), đây là đặc điểm sinh sản khác với các loài gia súc khác [9]

- Khả năng sinh trưởng:

Các giống thỏ lai ở Việt Nam có tầm vóc nhỏ hơn so với thỏ ngoại nhưng có khả năng chịu đựng được trong điều kiện chăn nuôi kham khổ

và dinh dưỡng thấp, khối lượng trưởng thành đạt 3,5 - 5,5kg/ con [9]

29

Bảng 2.1 Khối lượng cơ thể ở các giai đoạn tuổi [9]

Khối lượng 21 ngày tuổi gram 300 - 350 350 - 400 Khối lượng 30 ngày tuổi gram 400 - 500 500 - 600

Thỏ được nuôi làm động vật thí nghiệm vì nhỏ, dễ nuôi, giá thành

rẻ Trong đề tài này chọn thỏ có nguồn gốc tại trại giống ở viện kiểm nghiệm thuốc trung ương 2, để giúp thỏ thí nghiệm thích nghi tốt nhất với điều kiện thí nghiệm Thỏ thí nghiệm được lựa chọn có cân nặng khoảng 2kg, cùng giới tính

2.1.2 Nguyên liệu và hóa chất

Nguyên liệu: Màng Bacterial cellulose đã hấp thu Curcumin có

khả năng giải phóng kéo dài tốt hơn đã thử nghiệm trong in vitro là màng

lên men từ môi trường cao nấm men dày 1cm

Hóa chất: Thuốc Curcumin chuẩn (tinh khiết khoảng 96% có nguồn gốc Ấn Độ), các hóa chất thông thường Methanol, acetonitril, acid acetic, ethyl acetat đạt tiêu chuẩn HPLC, nước cất, dung dịch NaOH 1.5M, cồn 96o Thuốc chống đông máu EDTA (hoặc thuốc có tác dụng tương tự) …

2.1.3 Thiết bị và dụng cụ

Chuồng nuôi thỏ thí nghiệm có đầy đủ đồ dùng cho thỏ ăn và uống nước, dễ dọn dẹp, vệ sinh và bắt thỏ khi tiến hành thí nghiệm

Hộp giữ thỏ khi lấy máu

Dụng cụ: ống nghiệm, bình tam giác có chia vạch, cốc đong thủy tinh, đũa thủy tinh, pipet ruột thẳng, bình thủy tinh, lọ penicilin, đèn cồn, đĩa petri, kẹp gỗ, thước kẹp panme, bình hút ẩm, giấy lọc, giấy quỳ tím

30

và nhiều dụng cụ hóa sinh khác như cồn, bông băng, găng tay và khẩu trang y tế Ống nghiệm đựng mẫu máu chứa EDTA, có dán nhãn ghi thời gian lấy và lô thí nghiệm, khay đựng ống nghiệm, ống đựng mẫu huyết tương …

Các loại máy móc thiết bị:

Máy khuấy từ gia nhiệt, Anh; Viện NCKH&ƯD- Hpu2 Cân phân tích CPA 224S,

Sartorius

Viện NCKH&ƯD- Hpu2

Buồng cấy vô trùng, Tây Ban Nha Viện NCKH&ƯD- Hpu2 Thiết bị lắc xor Vortex ZX3,

Velp Scientifica

Trung ương Thiết bị lắc xoáy ngang

Reciprocating Shaking 3006,

GFL

Trung ương

Thiết bị bốc hơi dung môi ở

áp suất giảm Centrivap

solvent system, Labconco

31

2 2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp bào chế BC-Cur dạng uống

Curcumin có những đặc điểm dược động học không thuận lợi như: hấp thu kém, chuyển hoá và thải trừ khỏi cơ thể nhanh nên sinh khả dụng rất thấp [12] Do vậy chúng tôi đã lựa chọn màng BC để hấp thụ thuốc giúp GPKD nhằm tăng sinh khả dụng của thuốc Viên uống BC - Cur được bào chế như sau [84]:

 Tạo màng BC ở môi trường cao nấm men với độ dày 1cm, đường kính 1,5 cm

- Bước 1: Chuẩn bị môi trường

- Bước 2: Hấp khử trùng môi trường cao nấm men ở 1150C trong

- Bước 6: Thu màng BC thô, rửa sạch chúng dưới vòi nước

 Xử lý màng trước khi hấp thu thuốc

Mục đích: loại bỏ được các tạp chất trong môi trường nuôi cấy, đồng thời phá hủy và trung hòa độc tố của vi khuẩn

Quy trình xử lý màng BC:

32

Hình 2.1 Sơ đồ quá trình xử lý màng BC

 Hấp thu Cur:

Viên BC sau khi đã tinh sạch đem hấp thụ trong dung dịch

Curcumin 100% trong 2h

2.2.2 Xác định lượng thuốc hấp thu vào màng

Các loại màng BC sau khi được tinh chế sẽ đươc ép loại bỏ khoảng 50% nước

Pha dung dịch curcumin 100% (gồm 200mg thuốc Curcumin dẫn dung dịch cồn 99,50 đến 200ml), rút 3ml để đo OD xác định m1

Cho màng 10 viên BC vào 200ml dung dịch trên, và cho hấp thu trong điều kiện tối ưu (thí nghiệm được thực hiện ở 600

C, thời gian là

120 phút và chế độ lắc là 160 vòng/phút)

Sau 2h rút 3ml dung dịch để đo OD xác định m2

Từ đó xác định lượng thuốc hấp thu vào các màng BC bằng công thức: