Tách chiết polysaccharides từ sinh khối nấm hương

Nguồn nguyên liệu thu hoạt chất này không thể không kể tới nấm hương, nấm hương vừa chứa hoạt chất polysaccharides có tác dụng tốt cho sức khỏe con người vừa được mệnh danh là “ Vua của

NÔNG THỊ HUỆ

Tên đề tài:

“TÁCH CHIẾT POLYSACCHARIDES

TỪ SINH KHỐI NẤM HƯƠNG”

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ thực phẩm

Khoá học : 2010 – 2014 Giáo viên hướng dẫn : ThS Nguyễn Hữu Nghị Khoa CNSH - CNTP, Trường ĐH Nông Lâm Thái Nguyên

Thái Nguyên, 2014

Sau thời gian thực tập tại phòng thí nghiệm tại khoa Công nghệ Sinh học

và Công nghệ Thực Phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, cùng với

sự cố gắng của bản thân và sự giúp đỡ của mọi người chúng tôi đã hoàn thành khoá luận tốt nghiệp của mình

Trước hết, chúng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban giám hiệu Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, cùng toàn thể các thầy cô giáo trong khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực Phẩm đã tận tình giúp

đỡ, tạo mọi điều kiện tốt nhất để chúng tôi tiến hành nghiên cứu và làm tốt khóa luận tốt nghiệp

Qua đây, chúng tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới Th.S Nguyễn Hữu Nghị giáo viên trực tiếp hướng dẫn chúng tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài Thầy đã tận tình chỉ dẫn và giúp đỡ chúng tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này

Cuối cùng, chúng tôi bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến gia đình, bạn bè, những người luôn quan tâm giúp đỡ, động viên, đồng thời làm chỗ dựa tinh thần rất lớn giúp chúng tôi hoàn thành tốt mọi công việc được giao trong suốt thời gian học tập, thực hiện khóa luận tốt nghiệp để có được kết quả ngày hôm nay

Thái Nguyên, ngày 06 tháng 06 năm 2014

Người thực hiện

Nông Thị Huệ

Bảng 4.1 Ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu/dung môi tới hiệu suất

trích ly polysaccharides thô từ sinh khối nấm hương 29

Bảng 4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ dung môi trích ly tới hiệu suất

trích ly polysaccharides thô từ sinh khối nấm hương 31

Bảng 4.3 Ảnh hưởng của thời gian trích ly tới hiệu suất thu

polysaccharides từ sinh khối nấm hương 32

Hình 2.1: Chu trình sống của nấm hương 8

Hình 4.1 Đường cong sinh trưởng của sinh khối nấm hương 27

TCN : Trước công nguyên

SCN : Sau công nguyên

ATTP : An toàn thực phẩm

TPCN : Thực phẩm chức năng

LEM : Lentunula Edodes Mycelium

AHCC : Active Hexose Corelated Compound

AZT : Azidi-thymidine

Phần 1: MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích và yêu cầu 3

1.2.1 Mục đích 3

1.2.2 Yêu cầu 3

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn đề tài 3

1.3.1 Ý nghĩa khoa học 3

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn đề tài 3

Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Cơ sở khoa học 4

2.1.1 Khái quát lịch sử trồng nấm 4

2.1.2 Vài nét về ngành khoa học Thực phẩm chức năng 4

2.1.3 Giới thiệu chung về nấm hương 6

2.1.4 Tổng quan về polysaccharides 10

2.1.5 Nuôi cấy sinh khối nấm hương trong môi trường lỏng 13

2.1.6 Một số phương pháp tách chiết polysaccharides 17

2.1.7 Khái quát về lọc và ly tâm 19

2.2 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về trồng và sản xuất nấm hương 20 2.2.1 Tình hình ngoài nước 20

2.2.2 Tình hình trong nước 20

Phần 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

3.1 Đối tượng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 22

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 22

3.1.2 Thiết bị và hóa chất dùng trong nghiên cứu 22

3.1.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 22

3.2 Nội dung nghiên cứu 22

3.3.2 Phương pháp chuẩn bị môi trường 25

3.3.3 Phương pháp nuôi cấy nấm hương 25

3.3.4 Phương pháp thu sinh khối nấm hương từ môi trường lỏng PD 26

3.3.5 Định lượng polysaccharides sau khi trích ly 26

Phần 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27

4.1 Nuôi cấy sinh khối nấm hương trong môi trường lỏng PD 27

4.2 Ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi trích ly/nguyên liệu tới hiệu suất thu polysaccharides thô từ sinh khối nấm hương 29

4.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ dung môi trích ly tới hiệu suất trích ly polysaccharides từ sinh khối nấm hương 30

4.4 Ảnh hưởng của thời gian trích ly tới hiệu quả trích ly polysaccharides từ sinh khối nấm hương 31

Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 33

5.1 Kết luận 33

5.2 Kiến nghị 34

TÀI LIỆU THAM KHẢO 35

ta lại hướng tới lựa chọn thực phẩm sao cho an toàn, có lợi cho sức khỏe Và phương châm mới của nhiều người “Hãy để thực phẩm trở thành thuốc và thuốc là thức ăn của bạn”

Dựa vào xu hướng đó nhiều nhà nghiên cứu đã tiến hành nghiên cứu và tìm ra một số loại thực phẩm từ tự nhiên vừa có giá trị dinh dưỡng cao, an toàn thực phẩm vừa chứa một số hợp chất có tính dược học có lợi cho sức khỏe người sử dụng trong việc phòng và hỗ trợ điều trị một số loại bệnh Đặc biệt được chú ý đến là nấm ăn, nấm dược liệu Từ những năm 300 TCN nấm

ăn đã được xác định là “Mỹ thực” (thức ăn quý trong cung đình Trung Hoa) Năm 200 – 100 TCN, trong sách “Thần nông bản thảo binh” đã miêu tả tỉ mỉ hình thái, tính năng, công dụng của các loài nấm dùng để chữa trị bệnh, bồi dưỡng sức khỏe Ví như nấm hương, một loài nấm được còn mang một số tính chất dược học có lợi cho sức khỏe con người

Theo chuyên gia dinh dưỡng Cardwell nói rằng: Hiện tại, các thực

nghiệm đang hướng đến việc kiểm tra tác động của nấm ở những cấp độ khác nhau trong việc chống lại virus cảm cúm Các nghiên cứu xem xét đến cả hai phản ứng miễn dịch và giải phóng cúm virus [5]

Mới đây, những nghiên cứu tại phòng thí nghiệm của trường Đại học Tufts được xuất bản trong Tạp chí Dinh dưỡng cũng nói rằng: Ăn nấm đồng nghĩa với việc tăng cường tổ chức miễn dịch cho cơ thể, đồng thời tăng Cytokines (Là chất trung gian chủ yếu hoạt hóa miễn dịch và duy trì đáp ứng miễn dịch) và sau đó các hooc-môn giống như protein có vai trò quan trọng

trong việc bảo vệ cơ chế khỏi sự nhiễm virus và mắc các chứng bệnh ung bướu [5]

Các nghiên cứu khoa học hiện đại trên nấm đã mở rộng theo cấp số nhân trong hơn ba thập kỷ vừa qua, không chỉ ở Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc

mà còn ở Mỹ và những giải thích khoa học về các hợp chất hoạt động trong

cơ thể động vật và cơ thể con người đang ngày càng xuất hiện trên nhiều trang tạp chí khoa học và y học Qua phân lập và xác định của các nhà nghiên cứu cho biết hợp chất có trong nấm ăn có tác dụng dược lý trên cơ thể người như: điều hòa miễn dịch, chống tế bào ung thư, phòng và chữa bệnh tim mạch, kháng virus, kháng khuẩn, ký sinh trùng, đặc tính bảo vệ và điều trị đái tháo đường, gan là hợp chất polysaccharides

Hợp chất polysaccharides có trong nấm ăn đã trưng bày một số hoạt động chống HIV mạnh, dẫn đến ức chế virus nhân bản và tế bào phản ứng tổng hợp (Yoshida và cộng sự, 1988) Vậy nên polysaccharides có trong nấm

ăn là một hướng phát triển mới có tiềm năng cho ngành khoa học mới khoa học Thực phẩm chức năng ở nước ta Nguồn nguyên liệu thu hoạt chất này không thể không kể tới nấm hương, nấm hương vừa chứa hoạt chất polysaccharides có tác dụng tốt cho sức khỏe con người vừa được mệnh danh

là “ Vua của các loại rau” bởi trong thành phần dinh dưỡng của nấm hương có chứa một hàm lượng dinh dưỡng cao, chứa một số vitamin, protein và một số acid amin thiết yếu Nấm hương vừa là một loại nấm ăn được, vừa là nấm dược liệu có tính dược học đáp ứng nhu cầu của người tiêu dùng hiện đại

“Hãy để thực phẩm trở thành thuốc và thuốc là thức ăn của bạn”

Theo nhiều nghiên cứu thì hệ sợi nấm hương cũng chứa tương đối đầy

đủ về số lượng các hoạt chất sinh học và dinh dưỡng như ở trong nấm hương quả thể Việc nuôi cấy hệ sợi nấm hương cho phép rút ngắn thời gian, không đòi hỏi các điều kiện khắt khe như trong nuôi trồng nấm thu quả thể Mặt khác việc nuôi cấy hệ sợi nấm hương để thu sinh khối có thể sử dụng phương pháp nuôi cấy trong môi trường lỏng Đặc biệt với mục đích sử dụng nào đối với nấm hương thì việc khảo sát sự phát triển của hệ sinh khối trong môi trường

lỏng cũng là khâu đầu tiên rất cần thiết và quan trọng để tạo tiền đề cho các nghiên cứu và ứng dụng tiếp theo Do đó trong khuôn khổ của khóa luận tốt

nghiệp này chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Tách chiết polysaccharides từ sinh khối nấm hương”

1.2 Mục đích và yêu cầu

1.2.1 Mục đích

Tách chiết, định lượng polysaccharides từ sinh khối nấm hương

1.2.2 Yêu cầu

- Nuôi cấy tạo sinh khối trong môi trường lỏng

- Tách chiết polysaccharides từ sinh khối nấm hương

- Định lượng polysaccharides sau khi chiết và đánh giá điều kiện chiết tới hiệu suất thu hồi polysaccharides

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn đề tài

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn đề tài

Đặt cơ sở cho việc xây dựng quy trình sản xuất thu polysaccharides từ sinh khối nấm và nấm quả thể, thu nguồn nguyên liệu cho ngành thực phẩm chức năng trong tương lai

Thực hiện đề tài giúp sinh viên nắm vững các thao tác trong phòng thí nghiệm, bổ sung thêm kiến thức thực tế dựa trên lý thuyết, tích lũy thêm kinh nghiệm, tiếp cận với công tác nghiên cứu khoa học phục vụ cho công việc

nghiên cứu sau khi ra trường

Kết quả thu được từ đề tài là cơ sở cho các nghiên cứu chuyên sâu hơn

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Cơ sở khoa học

2.1.1 Khái quát lịch sử trồng nấm

Theo các tài liệu khảo cổ thì từ thời đồ đá cũ (500 – 400 năm TCN) những cư dân nguyên thủy ở Trung Quốc đã biết thu lượm và sử dụng nhiều loại nấm ăn từ thiên nhiên Năm 400 TCN đã có những miêu tả khoa học về sinh thái, sinh lý của không ít các loại nấm ăn Năm 100 TCN bắt đầu có những ghi chép đầu tiên về kỹ thuật trồng nấm [1]

Năm 200 – 300 SCN có những ghi chép về phương pháp nuôi trồng nấm linh chi Đến năm 581 – 600 SCN trong sách “Dược tính luận” có ghi chép phương pháp trồng mộc nhĩ Sau đó nhiều nấm được đưa vào nuôi trồng như nấm kim châm, nấm ngân nhĩ, nấm hương, nấm rơm [1]

Hiện nay nghề trồng nấm đã phổ biến rộng rãi trên thế giới đặc biệt là Trung Quốc với sản lượng nấm trồng cao nhất thế giới, sau đó là đến Nhật Bản, Mỹ,…

2.1.2 Vài nét về ngành khoa học Thực phẩm chức năng

2.1.2.1 Khái niệm ngành khoa học thực phẩm chức năng

Ở các nước khác nhau thì khái niệm về thực phẩm chức năng là khác nhau Trong các văn bản của Bộ Y tế thống nhất khái niệm: “Thực phẩm chức năng là thực phẩm dùng để hỗ trợ chức năng của các bộ phận trong cơ thể người, có tác dụng dinh dưỡng, tạo cho cơ thể tình trạng thoải mái, tăng sức

đề kháng và giảm bớt nguy cơ bệnh tật” Theo khái niệm này thì thực phẩm chức năng nằm giữa giới hạn thực phẩm truyền thống và thuốc Vì thế, người

ta còn gọi thực phẩm chức là thực phẩm – thuốc

Thực phẩm chức năng khác với thực phẩm truyền thống như sau thực phẩm chức năng được sản xuất chế biến theo công thức bổ sung một số thành

phần có lợi và loại bớt một số thành phần bất lợi Việc bổ sung hay giảm bớt phải được chứng minh và cân nhắc một cách khoa học, được cơ quan nhà nước có thẩm quyền cho phép Thực phẩm chức năng có tác dụng sức khỏe nhiều hơn là các chất dinh dưỡng thông thường Thực phẩn chức năng rất ít tạo ra năng lượng như các loại thực phẩm truyền thống Liều lượng sử dụng thường nhỏ chỉ vài miligam như là thuốc

Tuy nhiên thực phẩm chức năng không phải là thuốc mà nhà sản xuất ghi trên nhãn mác là thực phẩm, còn thuốc thì được công bố là sản phẩm thuốc có tác dụng chữa bệnh Còn thực phẩm chức năng thì không có tác dụng chữa bệnh mà chỉ hỗ trợ và bổ sung thêm một số chất có tác dụng giảm bớt nguy cơ mắc bệnh

2.1.2.2 Thực trạng sử dụng thực phẩm chức năng tại Việt Nam

Theo cục ATTP – Bộ Y tế trong 10 năm trở lại đây, tại Việt Nam, số lượng TPCN được công bố đang phát triển với tốc độ cao và mức tiêu thụ TPCN của người tiêu dùng tăng lên nhanh chóng Đến nay thực phẩm chức năng tại Việt Nam có gần 10000 sản phẩm, trong đó nhập khẩu chiếm gần 40% Số lượng các doanh nghiệp tham gia sản xuất và phân phối TPCN đang tăng nhanh Cả nước hiện có gần 1800 doanh nghiệp sản xuất, kinh doanh TPCN và năm sau tăng hơn năm trước

PGS.TS Lê Văn Truyền – nguyên Thứ trưởng Bộ Y tế - nói: “Do các bệnh mạn tính và ô nhiễm môi trường, người dân ngày càng có xu hướng tìm

về một lối sống lành mạnh, quan tâm hơn đến các sản phẩm thiên nhiên và các biện pháp ph9ng bệnh Nếu để cho bệnh xuất hiện thì chi phí lớn hơn nhiều

so với phòng bệnh Vì thế không có lý do gì mà TPCN lại đứng ngoài cuộc” Dẫn chứng điều này ông cho biết, 70% người dân Mỹ thường xuyên sử dụng TPCN để phòng bệnh Theo Ngân hàng Thế giới (World Bank, 2006), thị trường TPCN ở Mỹ chiếm 35%, Châu Âu 32%, Nhật Bản 25% và phần còn ại

là của các nước trên thế giới là 8% Do đó thị trường TPCN ở Việt Nam phát triển mạnh cũng là theo quy luật chung

2.1.2.3 Các chế phẩm chức năng từ nấm hương trong tương lai

Trong thế kỷ 21, việc sử dụng tài nguyên thiên nhiên trong thực phẩm, y học và các ngành khoa học khác đã trở thành một đề tài nghiên cứu của các nhà khoa học Trong đó nấm hương đã được sử dụng làm thức ăn dài và là loại thuốc có khả năng tăng cường hệ thống miễn dịch ở người Từ những tiền chất có trong nấm hương đó, các nhà khoa học đã tổng hợp, phân lập, tách chiết ra tạo thành những hợp chất có khả năng hỗ trợ và điều trị bệnh cao Các sản phẩm nổi tiếng từ nấm hương như: Lentinan (β-1,3/1,6 glucan từ quả thể nấm hương); LEM (từ sợi nấm) dùng để điều trị bệnh ung thư, đặc biệt LEM có hiệu lực cao trong điều trị bệnh AIDS [3]

Nấm hương giàu các chất như selenium, acid uric, vitamin A, E, C và đặc biệt là vitamin D chống oxi hóa Các chất alenin và cholin ngăn ngừa sự xuất hiện của bệnh xơ gan, xơ vữa động mạch [3]

Tirosinase có trong nấm hương có thể làm giảm nhanh chóng các lipit tích lũy dư thừa trong gan, giúp tăng cường hoạt động của gan, giải độc cho

cơ thể

Trong tương lai nấm hương là nguồn nguyên liệu sạch từ tự nhiên cung cấp cho ngành thực phẩm chức năng một số hoạt chất có tính chất dược lý tiềm năng phát triển trong tương lai như thực phẩm chức năng đa sinh tố, thực phẩm chức năng hỗ trợ điều trị ung thư, thực phẩm chức năng tăng khả năng miễn dịch, thực phẩm bổ sung vitamin, và một số chế phẩm khác từ nấm hương

2.1.3 Giới thiệu chung về nấm hương

2.1.3.1 Khái quát về giới nấm

Trước đây nấm được coi là thực vật nhưng thực chất nấm được phân vào một giới riêng, gọi là giới Nấm tương đương với giới Động vật và giới Thực vật

Nấm có hai ngành chính là nấm nhầy (Myxomycota) và nấm thật (Enmycota) Nấm nhầy chia ra thành các ngành phụ như sau: Nấm tiên mao, nấm tiên mao, nấm tiếp hợp, nấm túi, nấm đảm, nấm bất toàn

Nấm ăn được có cấu tạo chủ yếu là hệ sợi nấm Sợi nấm có dạng ống tròn, đường kính khoảng 2 – 4 µm Các ống tròn đều có cách vách ngăn, khoảng cách giữa hai vách ngăn là 3 – 10 µm được gọi là tế bào Sợi nấm còn được gọi là khuẩn ty (hypha), hệ sợi nấm được gọi là khuẩn ty thể, Nấm đều

có cấu tạo chung của tất cả các vi sinh vật nhân thực Các nhóm nấm khác nhau có thành phần tế bào khác nhau [1]

Nấm ăn thuộc ngành nấm túi và nấm đảm, không có khả năng quang hợp

mà sống dị dưỡng, lấy thức ăn từ nguồn hữu cơ (động vật và thực vật) Hầu hết các loài nấm đều lấy dinh dưỡng qua tế bào sợi (giống như rễ cây) Tế bào nấm không có đời sống độc lập trong sợi nấm vì giữa các tế bào có vách ngăn

mà các vách ngăn lại có lỗ thủng đường kính từ 0,1 – 0,2 µm Nhiều nấm có

hệ men phân giải tương đối mạnh, chúng có khả năng sản sinh ra enzyme ngoại bào, những enzyme này giúp nấm biến đổi những cơ chất phức tạp thành dạng hòa tan để dễ hấp thu Dựa vào cách hấp thu dinh dưỡng của nấm người ta chia thành ba nhóm là nhóm hoại sinh, nhóm ký sinh, nhóm cộng sinh [2]

Quả thế nấm ăn có cấu tạo là hệ sợi nấm Sợi nấm có thể phát triển từ bào tử hay một đoạn sợi nấm Bào tử có thể nảy mầm theo nhiều hướng khác nhau, còn sợi nấm thì phân nhánh nhiều lần tạo nên một mạng sợi nấm dày chằng chịt và thường có màu trắng [2]

2.1.3.2 Hình thái học của hệ sợi nấm và đặc tính sinh học của nấm hương

Nấm hương còn có tên gọi khác là nấm Đông Cô, nấm Hương Cô có

nguồn gốc ở Đông Á, có danh pháp khoa học là: Lentinula edodes Tiếng Anh

và các ngôn ngữ châu Âu thì được gọi theo tiếng Nhật Bản là Shiitake Nấm

Hương được phân loại khoa học:

Thuộc giới (regnum): Fungi

Ngành (phylum): Bacicliomycota

Lớp (class): Agricomycetes

Bộ (ordo): Agaricales

Họ (familia): Tricholomataceae hay Maramiaceae hay Omphalotaceae Chi (genus): Lentinula

Loài (species): L edodes [2]

Nấm hương là một trong những loại nấm hoại sinh trên gỗ thích hợp ở vùng có khí hậu ôn đới, mát ẩm thường mọc hoang nhiều ở Việt Nam, Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc,… Ở Việt Nam thường mọc hoang ở các tỉnh có khí hậu mát mẻ, ẩm như Lào Cai, Lai Châu, Lạng Sơn, Cao Bằng, Bắc Kạn, Thái Nguyên, Hòa Bình, Lầm Đồng Nấm quả thể trưởng thành có hình tán

dù Màu sắc bên ngoài khác nhau tùy loại: Loài L.edodes có màu nâu nhạt

nhũ bong, loài L tigrinus có màu xám, những vết nứt như da hổ [4]

Sợi nấm hương lúc đầu có đường kính nhỏ khoảng 0,5 – 1,0 mm, về sau lớn dần lên đến kích thước 1 – 2 mm, sau khi các quá trình tiếp hợp và hình thành nấm quả thế ta có mũ nấm có đường kính từ 3 – 10 cm Lúc đầu mũ có dạng hình nón nhọn ở giữa, sau trải rộng ra và bằng phẳng, viền mũ thường cuộc vào trong Bề ngang của phiến tương đối rộng và có khuynh hướng bám vào cuống nấm Nấm hương không có vòng cổ và vòng bao gốc, cuống thon đều hoặc hơi tóp ở gốc Cuống nấm có đường kính 0,5 – 1,2 cm, dài khoảng 2,5 – 8 cm[2]

Nấm hương trải qua quá trình sinh trưởng và phát triển như sau:

Hình 2.1: Chu trình sống của nấm hương [2]

Nấm hương thuộc ngành phụ nấm đảm nên có tới ba cấp sợi nấm:

Tai nấm

trưởng thành

Hệ sợi sơ cấp: Không có vách ngăn và có nhiều nhân, dần dần sẽ tạo thành vách ngăn và phân thành những tế bào đơn nhân trong sợi nấm sự phối hợp nguyên sinh chất giữa hai sợi nấm sơ cấp xảy ra rất sớm

Hệ sợi thứ cấp: Tạo thành do sự phối trộn giữa hai sợi nấm cấp một, khi

đó nguyên sinh chất giữa hai sợi nấm khác dấu sẽ trộn với nhau Hai nhân vẫn đứng riêng rẽ làm tế bào có hai nhân Hay còn gọi là sợi nấm song nhân, sợi nấm song nhân là hình thái chủ yếu của sợi nấm

Hệ sợi cấp ba: Do sợi nấm thứ cấp phát triển thành Các sợi nấm liên kết lại chặt chẽ với nhau tạo thành quả thể nấm [2]

2.1.3.3 Giá trị dinh dưỡng của nấm hương

Nấm hương có giá trị dinh dưỡng cao, sử dụng nấm hương làm rau như một thực phẩm cung cấp vitamin, chất khoáng cho cơ thể Trong 100 g nấm hương khô (phần ăn được) có chứa 13(g) nước; 19% protein; 1,8(g) lipid; 54(g) hydratcacbon; 7,8(g) chất xơ; 4,9(g) chất khoáng, trong thành phần chất khoáng có 124mg Ca; 415mg P; 25,3mg Fe;… Vitamin có trong nấm hương 0,07mg vitamin B1; 1,13mg vitamin B2; 2,4mg vitamin PP; 18,9mg acid

nicotinic; provitamin D [2]

Các chất tạo nên hương thơm: Xeton, sulfit, ankan, acid béo… Theo Mizuno yếu tố tạo nên hương thơm, vị ngon của nấm là monosodium glutamate, nucleotit, amino axit tự do, chuỗi peptide, acid hữu cơ (axit malic,

axit fumalic, axit glutaric, axit oxalic, axit lactic,…) và đường[2]

Hơn nữa trong nấm hương và hệ sợi nấm hương có tới 40 loại enzyme, đáng chú ý nhất là enzyme β (1-3) glucosidaza, kitinaza, esteraza, lipoidaza, ligninaza, almondaza, pepsin, loxintinaza, tannaza, pectinaza, saccaraza, transferaza, maltaza, xenlulaza, hemixenlulaza, amylotransferaza, inulaza, melibiaza, glycozidaza, ureaza, insulinaza, asparaginaza, peroxydaza, lactaza, cacboxylpeptidaza, tyrozin oxydaza, zymaza, lichen amylaza, chymosin,

metalloproteaza,…[2]

2.1.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và phát triển của hệ sợi nấm hương

Một số yếu tố ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và phát triển của nấm hương

là độ ẩm, nhiệt độ, độ pH, ánh sáng, …

Về độ ẩm: Độ ẩm cơ chất thích hợp cho sự phát triển của sợi nấm là 70% Độ ẩm không khí trong giao đoạn nuôi sợi khoảng 80% ở giai đoạn tạo quả thể, nấm tăng trưởng nhanh và cần nhiều nước, do đó độ ẩm không khí lúc này khoảng 85-90%

65-Nhiệt độ: Sợi nấm hương có thể sinh trưởng và phát triển trong khoảng nhiệt độ 5 – 320C, nhưng tốt nhất là 24 – 250C Quả thể hình thành ở phạm vi nhiệt độ - 210C, tốt nhất là ở nhiệt độ 10 – 120C Quả thể phát triển thích hợp

ở 200

C (trừ các nấm hương chịu nhiệt)

Độ pH: pH thích hợp cho tơ nấm là 5 – 6, sau khi nuôi cấy vài ngày, pH môi trường sẽ giảm đi rất nhanh do nấm hương sản sinh ra một số axit hữu cơ (axit acetic, axit sucxinic, axit oxalic) Khi hình thành quả thể thì pH thích hợp là 3,5 – 4,5 Các axit hữu cơ được sinh ra trong hệ nấm hương sẽ điều chỉnh pH môi trường mà người trồng không cần phải axit hóa môi trường Ánh sáng: Ánh sáng chủ yếu cần cho giai đoạn hình thành quả thể Cường độ ánh sáng tối ưu cho nấm hương quả thể khoảng 10 lux, đồng thời

số lượng tai nấm tăng lên theo thời gian tiếp xúc với ánh sáng Nếu điều kiện tối hoặc ánh sáng thấp hơn 5 lux thì mũ nấm màu xám, tai nhỏ, cuống trở nên

ốm và dài hơn [2]

2.1.4 Tổng quan về polysaccharides

2.1.4.1 Khái niệm Polysaccharides

Polysaccharides là một loại hợp chất hữu cơ có chứa trong thực vật: quả, củ hoặc thân cây Trong thực vật, polysaccharides tồn tại dưới hai dạng: dạng không tan và dạng hòa tan Polysaccharides có trong thành phần một số thực vật điển hình như: nhân sâm, nấm lim xanh, nấm hương,… hợp chất cao phân tử có chứa

hàng trăm thậm chí hàng nghìn mắt xích monosaccharide trong mỗi phân tử Polysaccharide β-glucan là thành phần chính của nấm có thể biểu hiện các hoạt tính sinh học khác nhau chẳng hạn như đái tháo đường, ung thư

Polysaccharide là những polime được tạo ra từ thiên nhiên hoặc nó có thể là sản phẩm của phản ứng trùng ngưng các andozo hoặc xentozo Polysaccharide tồn tại ở các loại mạch như mạch hở, mạch không nhánh hoặc

có nhánh, mạch vòng hay uốn khúc

Polysacchrides thường được phân loại thành hai loại là homopolysacchride và heteropolysacchride Homopolysacchride được tạo thành từ một loại monosacchride như tinh bột, xenllulose, glycogen,… Heteropolysacchride được tạo thành từ hai loại monosacchride trở lên như pectit, aga, hemixenllulose,…

2.1.4.2 Hoạt tính dược học của polysaccharide

Hoạt tính chống ung thư

Những nấm chứa polysaccharides hoạt tính sinh học chủ yếu thuộc nhóm β- glucan Các chất này nằm trong nhóm hợp chất có hoạt tính dinh học có nguồn gốc từ tự nhiên, là loại chất có khả năng điều chỉnh đáp ứng sinh học

Là tác nhân điều hòa hệ thống bảo vệ miễn dịch tự nhiên quan trọng nhất Glucan từ nấm không giống với các loại sản phẩm từ tự nhiên khác mà β-Glucan từ nấm được tinh khiết duy trì tác dụng sinh học cho phép chúng có hiệu quả cả ở mức độ phân tử và tế bào [6]

β-Năm 1980, tại Nhật Bản, β-Glucan đã chứng minh được khả năng kích thích tạo máu tương tự như yếu tố kích thích các bạch cầu hạt đơn nhân Các thí nghiệm đều cho thấy rằng, hiệu quả tác dụng vào tế bào ung thư rất tốt, có thể làm giảm 70 – 95% trọng lượng khối u so với đối chứng Tuy vậy, kết quả cho khả năng kháng, tác động tích cực tới khối u khi sử dụng kết hợp với chất kháng chống ung thư, còn nếu sử dụng riêng lẻ thì không thẻ làm khối u biến mất (Vaclav Vetvicka, 2011) Qua đó, β-Glucan có thể làm giảm sự phát triển

của khối u, ngăn chặn khối u di căn Trái ngược với vi sinh vật, tế bào khối u cũng như các tế bào vật chủ khác, β-Glucan là một thành phần không thể thiếu là một thành phần bề mặt để kích hoạt thụ thể bổ sung bắt đầu gây độc

tế bào và giết chết tế bào khối u Điều này chỉ xảy ra khi có mặt β-Glucan (Dalia Akramiene, 2007) [6,16]

Theo nghiên cứu của Mỹ, các nhà khoa học đã tìm thấy hợp chất tương quan Hexoza (AHCC) có trong nấm hương, chất này có khả năng ngăn ngừa các bệnh ung thư liên quan đến HPV Khi thử nghiệm trên chuột bạch AHCC cho kết quả diệt virus HPV trong vòng 90 ngày và giảm tốc độ tăng trưởng khối u cổ tử cung Các nhà khoa học cũng cho biết có thể sử dụng AHCC để điều chế thành thực phẩm chức năng, thực phẩm bổ sung, sử dụng thay thế cho vắc xin ngừa HPV Bởi AHCC hoạt động như một liệu pháp miễn dịch, chúng sử dụng chính hệ thống miễn dịch của con người để chống lại bệnh [3,17]

Hoạt tính chống virus

Polysaccharides có tác dụng kháng virus và điều hòa miễn dịch là do có các lignin, các chất kháng sinh; Lentinan là một Polysaccharides có tác dụng phục hồi tế bào Lympho T, tăng sản xuất interferol [3]

Gần đây các nhà nghiên cứu tại trường Đại học Y ở Yamaguchi Nhật Bản đã thông báo rằng một loại polysaccharides có tên là Lentinan có hiệu ứng “bảo vệ” Đó là ức chế sự phá hủy tế bào bình thường do ảnh hưởng của virus HIV Trên lâm sàng cho thấy khi sử dụng với hợp chất AZT có thể ngăn chặn virus HIV cao hơn khi chỉ sử dụng AZT một cách độc lập, đồng thời làm giảm độc tính AZT, đặc biệt sulfat lentinan ức chế rất mạnh hoạt tính của enzyme sao chép ngược của virus HIV [14]

Hoạt tính tăng khả năng miễn dịch

Polysaccharides trong nấm hương có khả năng hoạt hóa miễn dịch tế bào thúc đẩy quá trình sinh trưởng và phát triển tế bào Lympho T, Lympho B từ

đó góp phần tăng cường hệ miễn dịch ở bệnh nhân bị bệnh gan, giúp bệnh gan nhiễm mỡ mau chóng hồi phục các tế bào bị tổn thương nhanh hơn [6]

Polysaccharides JSL-18 có trong nấm hương làm tăng hoạt tính đại thực bào, tăng tiết IL-6 (Interleakin-6) Bên cạnh đó, trong nấm hương còn chứa các chất như Lentinacin, dezoxy lentinacin, 5’-GMP, 5’-AMP có tác dụng chống đông máu Ngoài ra, còn có chất eritadenine có hiệu quả làm giảm hàm lượng cholesterol trong máu [2]

2.1.5 Nuôi cấy sinh khối nấm hương trong môi trường lỏng

2.1.5.1 Nuôi cấy hệ sợi nấm hương trong môi trường lỏng

Phương pháp lên men chìm đối với vi sinh vật

Khái niệm: Là quá trình nhân nuôi vi sinh vật trong môi trường lỏng có

sục khí để bổ sung thêm oxy hoặc nuôi tĩnh Giống vi sinh vật sau khi cấy vào môi trường lên men thì bắt đầu phát triển ở giai đoạn tiềm phát (pha lag) rồi chuyển sang phát triển qua pha lũy thừa (pha log) Trong pha lũy thừa, vi sinh vật phát triển nhanh chóng và đạt cực đại, lượng vi sinh vật ngày càng tăng lên nhưng dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy nếu không được bổ sung thêm vào dó đó ở giai đoạn này thành phần môi trường dinh dưỡng giảm nhanh, như cầu oxy tăng, nhiệt độ tạo ra cao đồng thời bề mặt môi trường có thể trào ra khỏi bình men, làm mất bớt dịch và tăng khả năng nhiễm vi sinh vật lạ không mong muốn

Lên men chìm có hai dạng: lên men gián đoạn và lên men liên tục Lên men gián đoạn hay còn được gọi là lên men theo mẻ hoạt động như một hệ thống đóng kín Vi sinh vật trong quá trình lên men phát triển theo 4 pha: pha tiềm phát (pha lag), pha lũy thừa (pha log), pha ổn định, pha suy vong

Pha tiềm phát: Khi cấy các tế bào vi sinh vật từ môi trường này sang môi trường khác, khoảng thời gian đầu số tế bào không thay đổi Trong giai đoạn này vi sinh vật làm quen với môi trường để thích nghi dần với điều kiện môi trường mới

Pha log: Cuối pha tiềm phát các tế bào đã thích nghi với điều kiện sống mới và bắt đầu phát triển mạnh mẽ, quần thể vi sinnh vật chuyển sang pha lũy thừa, pha phát triển số lượng vi sinh vật mạnh nhất

Pha ổn định: Sau khi đồng hóa các chất dinh dưỡng hay sau khi tích lũy các sản phẩm trao đổi chất, sinh trưởng của vi sinh vật giảm xuống hay hoàn toàn ngừng lại Trong pha ổn định này sinh khối có thể còn tăng chậm hoặc không đổi

Pha suy tàn: Đặc trưng của pha này là các chất dinh dưỡng đã bị cạn kiệt Lượng chất dinh dưỡng trong môi trường bị suy giảm, có thể thiếu một số chất dinh dưỡng, trong khi chất thải từ vi sinh vật thải ra ngày càng tăng mà không được bổ sung thêm chất dinh dưỡng vào môi trường nuôi cấy, do đó các tế bào vi sinh vật chết dần

Lên men bổ sung ứng dụng cho các trường hợp sau: Nồng độ cơ chất khá thấp nhưng lại cần ổn định (lên men nấm men), nồng độ cơ chất cần khá cao

và không đổi, cần bổ sung chất dinh dưỡng liên tục

Môi trường nuôi cấy hệ sợi nấm hương trong môi trường lỏng

Môi trường dinh dưỡng cần cho nấm hương và hệ sợi nấm hương phát triển cần một số nguồn dinh dưỡng thiết yếu như sau:

Về nguồn cacbon: Nấm hương có thể đồng hóa rộng rãi nhiều nguồn cacbon khác nhau như đường đơn, đường kép, đường đa [1]

Về nguồn nitơ, nấm hương có thể sử dụng nitơ hữu cơ như protein, peptit, axit amin hay urê hoặc đạm vô cơ như các muối amôn Nấm hương không đồng hóa được nitơ trong nitrat, nitrit [1]

Tỷ lệ C:N trong môi trường ở giai đoạn nuôi sợi nên dùng tỷ lệ 25-40:1 Nhưng tỷ lệ C:N tối ưu cho sự phát triển của hệ sợi nấm là 30:1 Theo nghiên cứu của nhóm tác giả Rossi và CS khi sử dụng môi trường rỉ đường thì tỷ lệ C:N là 107:1, còn khi bổ sung thêm 40% cám gạo thì tỷ lệ C:N là 38:1

Về nhu cầu nguyên tố khoáng, ngoài Mg, S, P, K nấm hương còn cần một số nguyên tố khoáng vi lượng như Fe, Zn, Mn…Mỗi lít dung dịch nuôi cấy nên bổ sung thêm khoảng 2 mg đối với từng loại Fe, Zn, Mn Khi nuôi trồng nấm hương cần lưu ý bổ sung vitamin B1 Các vitamin khác nấm hương đều có thể tự tổng hợp Trong 1 lít môi trường nuôi cấy cần bổ sung 100µl vitamin B1 Một số chất điều hòa sinh trưởng thực vật như gibberellin (GA3), axit indolaxetic (IAA), kinetin (KT)…cũng có tác dụng xúc tiến sự phát triển của hệ sợi nấm Hương [2]

Các môi trường nuôi cấy để nuôi hệ sợi cũng phải có đầy đủ nguồn cacbon, nitơ, chất khoáng… đáp ứng cho nhu cầu phát triển của hệ sợi nấm hương [2]

2.1.5.2 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lỏng tới sự phát triển của hệ sợi nấm hương

Nấm hương thuộc nhóm nấm hoại sinh và hiếu khí, vì vậy trong quá trình nuôi hệ sợi nấm hương nên bổ sung ôxy bằng thiết bị lắc, khuấy hay sục khí Bào tử nấm sau khi được cấy vào môi trường lên men thì bắt đầu phát triển ở giai đoạn tiềm phát (pha lag) khoảng 24 giờ, rồi chuyển sang phát triển trong pha lũy thừa (còn gọi là pha log) Cuối pha lag các bào tử nấm đã thích nghi với điều kiện sống mới và bắt đầu phát triển mạnh mẽ Ở giai đoạn này thành phần môi trường dinh dưỡng giảm nhanh, nhu cầu ôxy tăng, nhiệt lượng tạo ra cao đồng thời bề mặt môi trường tạo thành bọt và lớp bọt tăng Nên phải cấp khí ôxy bằng cách lắc ở quy mô phòng thí nghiệm và dùng thiết

bị sục khí như khuấy, sục khí ở quy mô sản xuất để tăng hiệu suất lên men

cao tạo sinh khối sợi nấm hương

Theo nghiên cứu của Hassegawa trong môi trường nuôi cấy lỏng với sự cung cấp oxy thông qua chế độ nuôi có lắc và không lắc (nuôi tĩnh) sử dụng môi trường YEM ở nhiệt độ 25oC Khi nuôi cấy tĩnh chỉ thu được hàm lượng sinh khối sợi khô của nấm hương tối đa là 4 mg/ml Trong khi nuôi cấy có lắc

với tốc độ 150 vòng/phút thì hàm lượng sinh khối sợi khô của nấm hương

phát triển

Theo nghiên cứu của Hassegawa thì ở nhiệt độ 20oC thu được lượng sinh khối sợi nấm là lớn nhất, hay 20oC là nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của hệ sợi nấm hương Tác giả này đã nghiên cứu với nhiều môi trường khác đều cho

kết quả ở nhiệt độ này là tối ưu

Trong nhiều nghiên cứu khác, người ta thường dùng khoảng nhiệt độ 20 đến 25o

cho sự phát triển của hệ sợi Nghiên cứu tại Trường đại học Utah cho biết điều kiện nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của hệ sợi nấm trong môi trường rắn và lỏng đều là 25oC Theo nghiên cứu của nhóm tác giả Ishikawa

và cộng sự thì nhiệt độ phù hợp cho sự phát triển của hệ sợi nấm hương cũng

là 25oC Nhiều nghiên cứu cho thấy ở nhiệt độ 25oC cho sinh khối sợi cao và nhiệt độ này là khoảng nhiệt độ phòng thí nghiệm và thường phù hợp với điều kiện tự nhiên của nhiều vùng nên không đòi hòi khắt khe về thiết bị nuôi,

giảm chi phí cho quá trình lên men

Về độ pH thích hợp cho sự sinh trưởng của hệ sợi của nấm hương trên môi trường nuôi cấy rắn là pH 5,0-6,0 Sau khi nuôi cấy được vài ngày, pH môi trường sẽ giảm đi rất nhanh do nấm hương sản sinh ra một số axit hữu cơ như axit axetic, axit sucxinic, axit oxalic Trong giai đoạn nuôi sợi, pH không ảnh hưởng nhiều đến sinh khối sợi Thường sử dụng pH tự nhiên của môi

trường dinh dưỡng Trong nuôi cấy lỏng, theo nghiên cứu của Hassegawa và

cộng sự thì pH tối ưu cho sợi nấm phát triển trên môi trường dung dịch là 4,5 Tuy nhiên, ở pH 4,5 này thì vi khuẩn cũng phát triển mạnh, nên pH từ 3 – 3,5

là tốt nhất vì ở pH này hệ sợi phát triển tốt và kháng khuẩn

Còn ánh sáng không ảnh hưởng nhiều đến quá trình phát triển hệ sợi, vì trong giai đoạn phát triển hệ sợi không cần quan tâm đến cung cấp ánh sáng Khi nuôi trên môi trường thạch đĩa, thường nuôi ở trong tủ ấm, không có ánh

sáng, hệ sợi nấm Hương vẫn phát triển tốt

Tuy nhiên, đối với nuôi cấy môi trường lỏng (trong thiết bị lên men) thì thường sử dụng nuôi ở ánh sáng phòng hay trong tối

2.1.6 Một số phương pháp tách chiết polysaccharides

Polysaccharides trong nấm tồn tại như một thành phần cấu trúc của vách

tế bào nấm và việc lựa chọn phương pháp trích ly phụ thuộc về cấu trúc tế bào Một số phương pháp trích ly thu Polysacharides thông thường như: Chiết bằng dung môi, bằng cách sử dụng nước nóng, giải pháp kiềm và polyethylene glycol; và các phương pháp sử dụng sóng siêu âm

2.1.6.1 Phương pháp chiết bằng nước, kết tủa bằng ethanol

Quả thể nấm T microcaspus tươi (1kg) rửa sạch bằng nước Sau đó đun sôi nấm quả thế trong 250ml nước cất trong 12 giờ Hỗn hợp dịch chiết được để qua đem tại 40

C và được lọc qua vải lanh sạch Sau đó, ly tâm ở 8000 rpm trong 45 phút tại 60C để thu nhận dịch chiết sạch tạp chất Thu nhận lấy phần dịch nổi (200 ml) và kết tủa trong ethanol theo tỉ lệ (1:5, v/v) ở nhiệt độ phòng Để kết tủa qua đêm tại 40

C, sau đó ly tâm ở 60C trong 1 giờ Phần kết tủa thu được rửa sạch với nước cất và thẩm tách qua ống thẩm tách trong 6 giờ để loại bỏ các vật liệu có trọng lượng phân tử thấp Phần còn lại đem băng khô

Các Polysaccharides hòa tan trong nước (30 mg) tinh chế bằng sắc ký gel thấm trên cột Sepharose – 6B (65,25 cm) sử dụng như eluant Tổng cộng

có 100 ống nghiệm chứa 2ml eluant đươc thu thập theo những phần nhỏ với

tốc độ là 10s/giọt Chúng được giám sát bằng phương pháp phenol – sulfuric,

sử dụng quang phổ UV – vis tại bước song 490nm Kết quả thu được 9 mg Polysaccharides tinh khiết [10]

2.1.6.2 Polysacharides được chiết từ trùng thảo Sinensis

Nguyên liệu nấm được rủa sạch bằng nước cất, sau đo luộc trong nước cất trong 2 giờ Tiếp theo đem lọc hay ly tâm để loại bỏ các tạp chất, bã nấm, thu lấy dịch chiết Dịch chiết được kết tủa với ethanol theo tỉ lệ 1:4 (v/v) Sau

đó được thẩm tách và đông khô để thu Polysaccharides thô

Các Polysaccharides thô được phân tích sắc ký lỏng như sau: hòa tan trong 10mM Tris – HCL, pH : 8,4 cho hiệu suất cao Số lượng Polysaccharides được xác định bằng thử nghiệm anthrome Các phần Polysaccharides tinh khiết được lấy từ cột DEAE – cellulose

Polysaccharides được phát hiện bởi máy đo chỉ số khúc xạ [14]

2.1.6.3 Polysaccharides thu từ loài nấm ăn, được lai ghép giữa Pleurotus florida và Lentinula edodes

Nấm lai ghép được trồng và thu từ Trang trại Thực nghiệm Falta, Viện Bose Nguyên liệu quả thể nấm (500g) được rửa kỹ lưỡng và sau đó đun sôi trong 8 giờ với nước cất sau đó lọc qua vải lanh sạch để loại bỏ bã, dịch lọc tiếp đó được ly tâm ở 7670 vòng/phút trong 45 phút tại 410C Sau khi ly tâm thu nhận phần nổi trên bề mặt và đem kết tủa trong ethanol theo tỉ lệ 1:5 (v/v) Dung dịch kết tủa được giữ qua đêm ở nhiệt độ là 410C Sau đó tiếp tục đem

ly tâm với vận tốc là 7670 vòng/phút, trong 45 phút tại 410C

Khi ly tâm xong thu lại phần kết tủa, kết tủa được rửa sạch 4 lần với ethanol và sau đó đóng băng khô Vật liệu đông khô được hòa tan với 40 ml nước cất và đem thẩm tách qua màng cellulose chống nước, chưng cất trong

48 giờ để loại bỏ vật liệu có trọng lượng phân tử thấp như cacbonhydrat Các dung dịch sau đó đã được thu thập từ các ống thẩm tách và đóng băng khô Hiệu suất thu được Polysaccharides thô là 315mg