Nội dung 1: Nuôi cấy sinh khối nấm hương trong môi trường lỏng.
Nội dung 2: Tách chiết Polysaccharides từ sinh khối nấm hương, định lượng polysaccharides sau khi chiết và đánh giá điều kiện chiết tới hiệu suất thu hồi Polysaccharides.
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Bố trí thí nghiệm.
Thí nghiệm 1: Nuôi cấy sinh khối nấm hương trong môi trường lỏng PD
Môi trường dinh dưỡng rất quan trọng trong việc nuôi và để cho sinh khối nấm hương phát triển. Chuẩn bị 10 bình tam giác 250 ml có 50ml môi
trường lỏng PD. Môi trường trước khi nuôi cấy đã được hấp khử trùng. Tiến hành cấy chuyển từ các sợi nấm trên đĩa thạch PDA sang môi trường lỏng PD. Nuôi cấy với tốc độ lắc là 150 vòng/phút, tại 250
C, 2 ngày xác định khối lượng một lần, theo dõi trong 12 ngày. Thí nghiệm lặp lại 2 lần.
Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi trích ly/nguyên liệu tới hiệu suất trích ly polysacharides từ sinh khối nấm hương.
Để trích ly được tối ưu hiệu quả chiết xuất polysaccharides ra khỏi bã thì tỉ lệ giữa dung môi chiết/nguyên liệu rất quan trọng và cần thiết trong tính toán tính hiệu quả kinh tế trong quá trình trích ly polysaccharides. Do đó, chúng tôi đã tiến hành trích ly ở các công thức giữa nguyên liệu/dung môi như sau: 1/20; 1/30; 1/40. Đồng thời chúng tôi cố định các yếu tố khác trong quá trình trích ly như: Khối lượng nguyên liệu: 1g, dung môi sử dụng là nước cất, nhiệt độ dung môi trích ly là 1000C trong 60 phút, tỉ lệ dịch chiết/cồn 960 là 1/4.
Chúng tôi lấy 1g sinh khối nấm hương khô trích ly với dung môi là nước cất theo các tỉ lệ 1/20, 1/30, 1/40, tại 1000
C trong vòng 60 phút. Sau khi trích ly xong dịch chiết thô được lọc qua vải gạc sạch hai lần để loại bỏ các bã lớn và các tạp chất bị lẫn, sau đó đem ly tâm ở 4000 rpm/phút trong 30 phút. Sau khi ly tâm xong thu lấy phần nổi và đem kết tủa với cồn 960 theo tỉ lệ 1/4 trong 30 phút. Sau đó dùng giấy lọc đã sấy khô đến khối lượng không đổi để lọc dịch. Khi lọc xong đem sấy giấy lọc ở 500
C đến khối lượng không đổi. Với mỗi tỉ lệ dung môi/nguyên liệu thí nghiệm lặp lại 3 lần.
Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của nhiệt độ dung môi trích ly tới hiệu suất trích ly polysaccharides từ sinh khối nấm hương.
Nhiệt độ dung môi trích ly là một yếu tố ảnh hưởng lớn đến khả năng trích xuất polysaccharides ra khỏi thành phần cấu tạo của sợi nấm hương, do đó chúng tôi tiến hành tách chiết polysaccharides từ sinh khối nấm hương với dung môi là nước cất ở các nhiệt độ như sau: 800
lượng và đánh giá điều kiện nhiệt độ dung môi nào thu được lượng polysacchrides cao nhất.
Trong thí nghiệm chúng tôi cố định các yếu tố khác như: Khối lượng mẫu (sinh khối nấm hương khô) 1g, dung môi trích ly sử dụng là nước cất, tỉ lệ nguyên liệu/dung môi là 1/20, trong 60 phút, tỉ lệ dịch chiết/cồn 960
là 1/4. Thí nghiệm được tiến hành như sau: lấy 1g sinh khối nấm hương khô trích ly với dung môi là nước cất theo tỉ lệ là 1/20 trong 60 phút ở các mốc nhiệt độ là 800
C, 900C, 1000C, sau khi trích ly xong dịch chiết thô được lọc qua vải gạc sạch 2 lần rồi đem ly tâm ở 4000 rpm/phút trong 30 phút ở 180
C. ly tâm xong thu lấy phần nổi rồi đem kết tủa với cồn 960 theo tỉ lệ 1/4 trong thời gian 30 phút. Cuối cùng dùng giấy lọc đã sấy khô ở khối lượng không đổi lọc dịch chiết kết tủa trên và đem giấy lọc đi sấy ở 500
C đến khối lượng không đổi. Với mỗi mốc nhiệt độ thí nghiệm lặp lại 3 lần.
Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của thời gian trích ly tới hiệu quả trích ly polysacarides từ sinh khối nấm hương.
Thời gian trích ly là một yếu tố ảnh hưởng tới chất lượng polysaccharides thu được và ảnh hưởng tới hiệu suất trích ly, chính vì vậy chúng tôi tiến hành tách chiết polysacchrides từ sinh khối nấm hương ở các mốc thời gian như sau: 60 phút, 90 phút, 120 phút.
Trong thí nghiệm chúng tôi cố định một số yếu tố sau: Khối lượng nguyên liệu: 1g, dung môi trích ly là nước cất, trích ly ở 1000C với tỉ lệ nguyên liệu/dung môi: 1/20. Tỉ lệ dịch chiết/cồn 960
là 1/4.
Thí nghiệm được tiến hành theo các bước như sau: lấy 1g sinh khối nấm hương khô đem trích ly với nước cất theo tỉ lệ 1/20 tại 1000C trong các thời gian trích ly lần lượt là 60 phút, 90 phút và 120 phút. Sau khi trích ly xong đem lọc với vải gạc sạch hai lần rồi đem ly tâm ở 4000 rpm/phút tại 180
C. Ly tâm xong thu lấy phần nổi đem kết tủa với cồn 960 theo tỉ lệ 1/4 trong 30 phút. Sau đó dùng giấy lọc đã sấy khô tới khối lượng không đổi lọc dịch, sau khi
lọc xong tiếp tục đem giấy lọc đi sấy ở 500C đến khối lượng không đổi. Với mỗi khoảng thời gian trích ly thí nghiệm lặp lại 3 lần.