Xác định chất cấm Sibutramine trong thực phẩm chức năng giảm béo bằng phương pháp HPLC

1.2 Thực trạng sử dụng thực phẩm chức năng giảm béo chứa sibutramine Theo Cơ quan Quản lý Dược phẩm và Thực phẩm Hoa Kỳ FDA, các sản phẩm thực phẩm chức năng giúp giảm béo có chứa một số

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-* -

NGUYỄN TIẾN LUYỆN

XÁC ĐỊNH CHẤT CẤM SIBUTRAMINE TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG GIẢM BÉO

BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

HÀ NỘI – 2014

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-* -

NGUYỄN TIẾN LUYỆN

XÁC ĐỊNH CHẤT CẤM SIBUTRAMINE TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG GIẢM BÉO

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên cho em gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Lê Thị Hồng Hảo, Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia – Bộ Y tế, đã giao đề tài, hướng dẫn, đóng góp những ý kiến và tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô giáo giảng dạy tại khoa Hoá học, đặc biệt là các thầy cô trong bộ môn Hoá phân tích, đã cho em những kiến thức quý giá, tạo điều kiện cho em được học tập và nghiên cứu trong thời gian vừa qua

Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới ban lãnh đạo Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi được học tập và hoàn thành đề tài này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các anh, chị và các bạn đồng nghiệp tại labo Hóa – Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình làm thực nghiệm

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn động viên, chia sẻ mọi khó khăn cùng tôi

Hà Nội, năm 2014

Học viên

Nguyễn Tiến Luyện

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU – TỪ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Giới thiệu về thực phẩm chức năng giảm béo 2

1.2 Thực trạng sử dụng thực phẩm chức năng giảm béo chứa sibutramine 3

1.3 Tổng quan về Sibutramine 4

1.3.1 Tính chất lý hóa của Sibutramine 4

1.3.2 Tính chất dược lý của Sibutramine 5

1.3.3 Một số phương pháp xác định sibutramine 7

1.3.3.1 Phương pháp sắc ký khí khối phổ GC-MS 7

1.3.3.2 Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC-MS/MS 8

1.3.3.3 Phương pháp điện di mao quản CE 10

1.3.3.4 Phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao HPTLC 11

1.3.3.5 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC 12

1.4 Tổng quan về HPLC 14

Chương 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu 17

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 17

2.1.2 Mục tiêu nghiên cứu 17

2.2 Nội dung nghiên cứu 17

2.3 Phương pháp nghiên cứu 17

2.3.1 Phương pháp lấy mẫu 17

2.3.2 Phương pháp xử lý mẫu 18

2.3.3 Thẩm định phương pháp phân tích 19

2.4 Phương pháp xử lý số liệu 23

2.5 Hóa chất, thiết bị 23

2.5.1 Hóa chất 23

2.5.2 Thiết bị, dụng cụ 24

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25

3.1 Tối ưu điều kiện tách và xác định Sibutramine bằng HPLC 26

3.1.1 Lựa chọn bước song hấp thụ ánh sáng 26

3.1.2 Lựa chọn một số điều kiện sắc ký 27

3.1.3 Khảo sát pha động 27

3.2 Khảo sát quy trình xử lý mẫu 33

3.2.1 Khảo sát dung môi chiết với viên nang cứng 34

3.2.2 Khảo sát dung môi chiết với viên nang mềm 35

3.2.3 Khảo sát thời gian chiết mẫu 36

3.2.4 Khảo sát quy trình loại béo trong mẫu thực phẩm chức năng 39

3.3 Thẩm định phương pháp phân tích 41

3.3.1 Độ đặc hiệu, độ chọn lọc 41

3.3.2 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng 43

3.3.3 Khoảng tuyến tính 44

3.3.4 Độ lặp lại của hệ thống 46

3.3.5 Độ đúng của phương pháp 47

3.3.6 Độ lặp lại của phương pháp 49

3.4 Kết quả xác định sibutramine trong một số sản phẩm thực phẩm chức năng giảm béo 51

Chương 4 KẾT LUẬN 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO… 57 PHỤ LỤC 61

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU- TỪ VIẾT TẮT

Ký hiệu Tiếng anh Tiếng việt

AOAC Association of Official

Analytical Community

Hiệp hội cộng đồng phân tích chính thức

CE Capillary Electrophoresis Điện di mao quản

ESI Electrospray Ionization Ion hóa phun điện tử

FDA Food and Drug Adminstration Cục quản lý thực phẩm và

dược phẩm Hoa Kỳ

GC-MS Gas Chromatography Mass

Spectrometry Sắc ký khí khối phổ

HPLC High Performance Liquid

Chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao

HPTLC High Performance Thin Layer

Chromatography

Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao

LOD Limit of Detection Giới hạn phát hiện

LOQ Limit of Quantification Giới hạn định lượng

R(%) Recovery Hiệu suất thu hồi

SD Standard Deviation Độ lệch chuẩn

Bảng 3.9 Độ lệch của từng điểm chuẩn dùng xây dựng đường

Bảng 3.10 Kết quả khảo sát độ lặp lại của hệ thống 47 Bảng 3.11 Độ thu hồi của phương pháp với viên nang mềm 47 Bảng 3.12 Độ thu hồi của phương pháp với viên nang cứng 48 Bảng 3.13 Độ lặp lại của phương pháp với viên nang cứng 50 Bảng 3.14 Độ lặp lại của phương pháp với viên nang mềm 50 Bảng 3.15 Kết quả phân tích sibutramine trong một số mẫu thực

phẩm chức năng giảm béo 51

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của sibutramine 4 Hình 1.2 Sơ đồ khối của một máy sắc ký lỏng hiệu năng cao 14 Hình 2.1 Quy trình phân tích mẫu dự kiến 19 Hình 2.2 Thiết bị HPLC Shimadzu (LC 20AD) 25 Hình 3.1 Sắc ký đồ PDA của sibutramine 26 Hình 3.2 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn sibutramine với pha động 1 28 Hình 3.3 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp với pha động 1 29 Hình 3.4 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn sibutramine với pha động 2 29 Hình 3.5 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp với pha động 2 30 Hình 3.6 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn sibutramine với pha động 3 31 Hình 3.7 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp với pha động 3 31 Hình 3.8 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn sibutramine với pha động 4 32 Hình 3.9 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp với pha động 4 32

Hình 3.10 Biểu đồ biểu diễn diệu quả chiết sibutramine trong mẫu viên

Hình 3.13 Sắc ký đồ phân tích mẫu trắng TPCN them chuẩn siêu âm

Hình 3.19 Sắc ký đồ phân tích mẫu TPCN nang mềm thêm chuẩn

200µg/ml loại béo bằng n-Hexan (H+) 41 Hình 3.20 Sắc ký đồ dung dịch đánh giá độ phân giải 42 Hình 3.21 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn sibutramine 200µg/ml 42 Hình 3.22 Sắc ký đồ của dung dịch mẫu trắng TPCN giảm béo 43

Hình 3.23 Sắc ký đồ của dung dịch mẫu trắng TPCN thêm chuẩn

ĐẶT VẤN ĐỀ

Béo phì hiện không còn là vấn đề của riêng các nước phát triển mà nay còn là vấn nạn của cả các nước đang phát triển Báo cáo mới nhất của WHO đã chỉ ra rằng khoảng 1,5 tỉ người trưởng thành có độ tuổi trên 20 được xếp vào nhóm thừa cân Trong số đó hơn 200 triệu nam giới và gần 300 triệu

nữ giới ở trạng thái đã béo phì Theo ước tính đến năm 2015 sẽ có khoảng 2,3

tỉ người thừa cân và trên 700 triệu người béo phì Một số liệu khác cho thấy gần 43 triệu trẻ em dưới 5 tuổi đã bị thừa cân tính đến năm 2010 [25] Chính

vì thế nhu cầu giảm béo cũng theo đó mà tăng lên Phương pháp điều trị giảm béo thường được áp dụng là ăn kiêng, kết hợp hoạt động thể lực Nhưng phương pháp này thường khó thực hiện và kém hiệu quả Vì vậy, mọi người thường tìm đến các loại thuốc giảm béo để tăng cường tác dụng giảm cân Nắm bắt được nhu cầu cấp thiết này, nhiều công ty sản xuất thực phẩm chức năng đã chớp thời cơ đưa ra các sản phẩm phục vụ cho nhu cầu này Để tăng tác dụng của sản phẩm, các công ty đã không ngần ngại đưa vào sản phẩm các chất có tác dụng nhanh và mạnh, nhằm tiêu thụ sản phẩm một cách nhanh chóng Trong nhóm các chất thường được cho thêm để tăng hiệu quả giảm béo một cách bất hợp pháp có hoạt chất Sibutramine Nó có tác động đến hệ thần kinh trung ương, làm tăng lượng serotonin và noradrenalin trong não, từ

đó tạo cảm giác no và không thèm ăn Chất này đã bị cấm sử dụng ở nhiều nước trên thế giới, trong đó có Việt Nam [4], [12], [16] Do đó việc phát hiện được sibutramine có mặt trái phép trong thực phẩm chức năng giúp giảm béo

là một yêu cầu thực tiễn trong kiểm soát tính an toàn của loại sản phẩm này Xuất phát từ yêu cầu thực tiễn kể trên, chúng tôi đã nghiên cứu chọn đề tài

“Xác định hàm lượng chất cấm sibutramine trong thực phẩm chức năng giảm béo bằng phương pháp HPLC” Đây là phương pháp phân tích hiện đại, có độ chính xác cao và có khả năng ứng dụng rộng rãi tại Việt Nam

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu về thực phẩm chức năng giảm béo

Thực phẩm chức năng giảm béo là những sản phẩm của quá trình chế biến thực phẩm hay thảo dược đã được các nhà sản xuất nghiên cứu để bổ sung và thay đổi một số thành phần dinh dưỡng có tác dụng tốt cho sức khoẻ Các loại thực phẩm chức năng giảm béo đa số được sản xuất dưới dạng viên nén, viên nang, dạng bột, dạng cao hay dạng trà nhưng không được coi như một loại thuốc chữa bệnh, đây có thể coi là một dạng thực phẩm giảm cân nhanh Hiện nay trên thị trường có rất nhiều loại thực phẩm chức năng giảm béo giúp người béo phì lấy lại vóc dáng cân đối

Để tăng tác dụng của sản phẩm, các công ty sản xuất đã đưa vào sản phẩm các chất có tác dụng nhanh và mạnh, nhằm tiêu thụ sản phẩm một cách nhanh chóng Những chất giảm béo sử dụng đầu tiên gồm có nhóm các chất cường adrenalin (phentermin, benzphetamin, phendimetrazin, mazindol, diethylpropion, phenylpropanolamin) và nhóm chất cường serotonin (fenfluramin, dexfenfluramin) Tuy nhiên, phenylpropanolamin - một tác nhân thuộc nhóm cường adrenalin đã bị cấm lưu hành tại thị trường Mỹ vào tháng 10 năm 2000 do các nghiên cứu cho thấy nó làm tăng nguy cơ tai biến mạch máu não như xuất huyết đột quỵ khi nó được sử dụng như một chất giảm cân ở phụ nữ [14] Cũng như vậy, các chất cường serotonin mặc dù cũng

có hiệu quả trong việc hỗ trợ giảm cân nhưng chúng cũng đã bị cấm lưu hành trên thị trường Mỹ từ tháng 9 năm 1997 do các nghiên cứu cho thấy nó làm thay đổi van tim và tăng huyết áp động mạch phổi [15] Sibutramine (thuộc nhóm chất ức chế tái thu hồi serotonin-noradrenalin) chính thức được lưu hành tại Mỹ từ tháng 2 năm 1998, sau đó nó đã được sử dụng cho điều trị béo phì trong khoảng 40 quốc gia trên thế giới

Sibutramine đã được chứng minh là có hiệu quả trong việc điều trị béo phì Một số nghiên cứu lâm sàn ngắn hạn cho thấy sibutramine có tác dụng giảm cân có thể do sự kết hợp của giảm sự thèm ăn, gây cảm giác no và có thể cảm ứng của sinh nhiệt Hiệu quả ban đầu của nó làm giảm cân vì vậy nó được coi như là một phương thức tiếp cận để giảm cân hiệu quả [21] Tuy nhiên sibutramine lại có những tác dụng phụ trầm trọng liên quan đến hệ thần

kinh trung ương, làm tăng nhịp tim, tăng huyết áp, thậm chí là nhồi máu cơ tim [24], do đó nó đã bị cấm lưu hành trên nhiều thị trường như thị trường châu Âu [12], Mỹ [16] và cả thị trường Việt Nam [4]

1.2 Thực trạng sử dụng thực phẩm chức năng giảm béo chứa

sibutramine

Theo Cơ quan Quản lý Dược phẩm và Thực phẩm Hoa Kỳ (FDA), các sản phẩm thực phẩm chức năng giúp giảm béo có chứa một số thành phần hóa chất khác không được nhà sản xuất công bố rõ ràng và sử dụng cao hơn mức quy định Các chất này gây độc cho hệ tim mạch, thận và gan của người nếu

sử dụng dài ngày, đồng thời rất nguy hiểm với người cao huyết áp, người mắc bệnh động mạch vành, xung huyết, loạn nhịp tim, tăng nhãn áp, tai biến hoặc đột quỵ

Sibutramine được biết đến dưới dạng biệt dược Sibutral Đây là loại thuốc chỉ bán theo chỉ định của bác sĩ, làm giảm cảm giác thèm ăn, tác dụng vào trung tâm nhận thức về đói và no ở não, thường được sử dụng như thuốc chống trầm cảm, chán sống Một thời gian sau khi uống, nó làm giảm trung bình 5% trọng lượng cơ thể Sibutramine được Cơ quan Quản lý Dược phẩm

và Thực phẩm Hoa Kỳ cấp phép từ tháng 11-1997 Được bán tại Pháp từ năm

2001 nhưng ngay lập tức, y học đã nhận ra những tác dụng phụ qua 2 trường hợp tử vong tại Italia Năm 2002, Italia cấm bán loại thuốc có chứa Sibutramine Đến năm 2007, Pháp cũng cấm bán Năm 2009, các nhà khoa học Mỹ nhận ra người uống Sibutramin còn có nguy cơ tự tử - là hiện tượng thường xảy ra với những loại thuốc điều trị chứng chán đời

Tại Singapore, Cơ quan Khoa học Y tế (HAS) cũng đã cấm lưu hành Oxy Elite Pro Tiến hành thí nghiệm, HAS nhận thấy Oxy Elite Pro có chứa Sibutramine chứ không phải được chiết xuất từ thảo dược như lời quảng cáo Năm 2011, Cơ quan dược phẩm Thụy Sỹ đã phân tích các mẫu sản phẩm thảo dược giảm cân, kết quả cho thấy có tới 8/13 mẫu, trong đó có thuốc giảm cân 2Day Diet, 3X Slimming Power bị phát hiện chứa hoạt chất Sibutramine với hàm lượng 21,5 mg, vượt quá 43% liều lượng cho phép sử dụng hằng ngày

Tại Việt Nam, mặc dù Cục quản lý Dược – Bộ Y Tế đã ban hành Quyết định số: 120/QĐ-QLD ngày 14/4/2011 về việc rút số đăng ký của thuốc do phản ứng có hại, theo đó tất cả các thuốc có chứa hoạt chất Sibutramine ra

khỏi danh mục các loại thuốc được cấp số đăng ký thông hành trên thị trường Việt Nam tuy nhiên, qua đợt kiểm tra mới đây của các cơ quan chức năng đã phát hiện trên địa bàn thành phố Hà Nội vẫn đang hiện diện một số loại thuốc

và thực phẩm chức năng có chưa hoạt chất nguy hiểm này

Theo thông tin từ Cục an toàn thực phẩm Bộ Y tế, rất nhiều trường hợp sau khi sử dụng thực phẩm chức năng có chứa thành phần hoạt chất Sibutramine đã phải nhập viện trong tình trạng sức khỏe và tính mạng bị đe dọa Hoạt chất Sibutramine có tác dụng giúp những người béo phì giảm cân, nhưng lại đặc biệt nguy hiểm với người tiêu dùng, nhất là những người có tiền

sử bệnh huyết áp và tim mạch Các sản phẩm này gây nhiều chứng rối loạn nguy hiểm cho cơ thể chúng đe dọa sức khỏe và tính mạng người sử dụng

Theo TS Nguyễn Hùng Long, Phó cục trưởng Cục An toàn thực phẩm

Bộ Y tế phân tích: “Đối với người có tiền sử bệnh tim mạch, loại sản phẩm này gây rối loạn và làm tăng nhịp tim Như vậy, nó làm cho người mắc bệnh

về tim mạch sẽ thêm nặng Thậm chí nếu sử dụng liều cao, nó còn có thể gây rối loạn nặng nề hơn ở hệ thống tim mạch” Cơ quan chức năng cảnh báo rằng, thuốc giảm cân hay thực phẩm chức năng có chứa Sibutramine trên thị trường hiện nay có hoạt chất rất độc hại và thực tế đã có nhiều người sử dụng phải nhập viện trong tình trạng sức khỏe nguy kịch

1.3 Tổng quan về sibutramine

1.3.1 Tính chất lý hóa của sibutramine

- Công thức phân tử: C17H26ClN (Khối lượng phân tử: 297,5 đvC)

- Công thức cấu tạo:

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của sibutramine

- Danh pháp quốc tế:

độ dài mạch C từ methanol đến octhanol [5]

- Nhiệt độ nóng chảy: Sibutramine kiềm có nhiệt độ nóng chảy là 55,15oC và enthalpy là 60,75 J/mol; Sibutramine hydroclorid monohydrat có nhiệt độ nóng chảy ở 1190C [5]

- Sibutramine base hấp thụ ánh sáng trong vùng UV-VIS Cực đại hấp thụ tại bước sóng 225 nm [23]

1.3.2 Tính chất dược lý của Sibutramine

Sibutramine hấp thu tốt qua đường tiêu hóa (77%) Thời gian để thuốc đạt nồng độ đỉnh trong huyết tương là 1 giờ và thời gian bán thải là 1,1 giờ Sibutramine phân bố nhanh chóng và rộng rãi đến các mô Khi dùng đường uống sibutramine bị chuyển hóa đáng kể khi qua gan lần đầu Sibutramine được chuyển hóa bởi cytochrom P450 CYP3A4 thành hai amin (gọi là chất chuyển hóa có hoạt tính 1 và 2) với chu kỳ bán rã tương ứng là 14 giờ và 16 giờ Nồng độ đỉnh trong huyết tương của chất chuyển hóa có hoạt tính 1 và 2 đạt được sau 3-4 giờ Các chất chuyển hóa thải trừ chủ yếu qua nước tiểu [13]

Sibutramine đã được đánh giá như một thuốc chống trầm cảm tiềm tàng

do các cơ chế đã được chứng minh là tác động đó cũng tương tự như các thuốc chống trầm cảm ba vòng, chẳng hạn như amitriptylin Tuy nhiên,

sibutramine không có tác dụng phụ của thuốc chống trầm cảm ba vòng bao gồm buồn ngủ, tác dụng kháng acetylcholin thế đứng [21]

Sibutramine là một hoạt chất có tác động đến hệ thần kinh trung ương, làm gia tăng lượng serotonin và noradrenalin trong não, từ đó tạo cảm giác no

và không thèm ăn [21]

Trong cơ thể, sibutramine chuyển hóa nhanh chóng thành các chất chuyển hóa desmethyl: M1 (mono-desmethyl sibutramin) và M2 (di-desmethyl sibutramin) và sibutramine tác động dược lý chủ yếu thông qua 2 chất chuyển hóa này để gây ra tác dụng giảm cân [11], [8]

Thử nghiệm lâm sàng đã chứng minh sibutramine có hiệu quả như một chất giảm cân với liều lượng khác nhau, từ 10 đến 20 mg/ngày [21]

Bảng 1.1: Thử nghiệm lâm sàng dài hạn với sibutramine

Thời gian

thử nghiệm

Liều ( mg/ngày) Chế độ ăn

Cân nặng được giảm

1 năm 10 và 15

Chế độ ăn theo lời khuyên

S (10)= 4 S(15)= 6 pl=1,6

Tác dụng không mong muốn: Sibutramine đồng thời cũng kích thích quá mức hệ thần kinh trung ương và ảnh hưởng một vài khía cạnh như bồn chồn, khô miệng, đau đầu, tê liệt và những dị cảm (Cảm giác khác thường như bị châm chích, kiến bò) có thể xảy ra Hơn thế nữa, nó còn liên quan đến tăng nguy cơ tim mạch như tăng áp lực máu, nhịp tim và thường tăng nguy cơ đau tim cũng như đột quỵ [20] Do những nguy cơ này, sibutramine đã bị cấm lưu hành trên thị trường châu Âu từ ngày 21/1/2010 [12] Từ tháng 8 năm

2010, Mỹ đã chống chỉ định mới cho các bệnh nhân trên 65 tuổi do các tác dụng phụ thực tế qua các nghiên cứu lâm sàng của sibutramine [17] Tại Việt Nam, các chế phẩm chứa sibutramine đã bị rút số đăng ký lưu hành theo Quyết định số 120/QĐ-QLD ngày 14/4/2011 của Cục quản lý Dược – Bộ Y tế [4] Tuy nhiên, do nhu cầu giảm béo của những người thừa cân nên hiện nay, nhiều loại thuốc giảm béo dưới mác thực phẩm chức năng có chứa sibutramine vẫn được bán tràn lan trên thị trường

1.3.3 Một số phương pháp xác định Sibutramine

Trên thế giới, đã có rất nhiều nghiên cứu đưa ra các phương pháp xác định sibutramine với nhiều kỹ thuật phân tích khác nhau như: Sắc ký khí khối phổ GC-MS [22], Sắc ký lỏng khối phổ LC-MS/MS [10]; Điện di mao quản

CE [28]; Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao HPTLC [7]; Sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC [23], [7], [6], [26];

1.3.3.1 Phương pháp sắc ký khí khối phổ GC-MS

Trong phương pháp sắc ký khí khối phổ, sau khi qua cột tách, các hợp chất hữu cơ trung hoà bị ion hoá thành các ion phân tử hay ion mảnh của phân

tử mang điện dương hoặc âm, các gốc tự do trong điều kiện áp suất thấp Sau

đó, các ion đựơc đưa sang bộ phận tách theo khối lượng Từ các tín hiệu thu được, dựa vào khối lượng ion phân tử, dựa vào đồng vị, dựa vào các mảnh ion phân tử, dựa vào cơ chế tách và dựa vào ngân hàng dữ liệu các ion và mảnh ion, người ta định tính và định lượng được chất phân tích một cách chính xác

Tác giả Sabina Strano-Rossi và cộng sự [22] đã phát triển phương pháp sắc ký khí khối phổ sibutramine trong các mẫu viên nén, viên nang, trà túi Mẫu được hòa trong nước, kiềm hóa bằng Natri carbonat đến pH =10 Chiết bằng methyl chloride, làm khô, bốc hơi dung môi rồi phân tích bằng GC-MS

Quá trình tách sắc ký khí được thực hiện trên cột HP-5-MS (30m × 0,25mm), chương trình nhiệt độ bắt đầu ở 110oC, tăng 10oC/phút đến 280oC và duy trì trong 3 phút, sử dụng khí mang He với tốc độ 0,6 ml/phút, phổ khối thu được trong khoảng khối lượng 40-400 a.m.u

Đây là một phương pháp phân tích hiện đại, được sử dụng có hiệu quả cao, độ phân giải và độ nhạy cao, tiết kiệm dung môi Tuy nhiên, chi phí cho thiết bị rất lớn, quy trình chiết mẫu phức tạp chưa phổ biến cho các phòng thí tại Việt Nam nên việc ứng dụng khó khăn

1.3.3.2 Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC-MS/MS

Đây là một phương pháp nhanh, nhạy và được phát triển nhiều hiện nay Sau khi qua cột tách, chất phân tích được hóa hơi, các hợp chất hữu cơ trung hoà bị ion hoá thành các ion phân tử hay ion mảnh của phân tử mang điện dương hoặc âm, các gốc tự do Sau đó, các ion đựơc đưa sang bộ phận tách theo khối lượng Từ các tín hiệu thu được, dựa vào khối lượng ion phân

tử, dựa vào đồng vị, dựa vào các mảnh ion phân tử, dựa vào cơ chế tách và dựa vào ngân hàng dữ liệu các ion và mảnh ion, người ta định tính và định lượng được chất phân tích một cách chính xác

Nhóm tác giả thuộc trường đại học Fudan, Thượng Hải [10] đã phát triển phương pháp sắc ký lỏng khối phổ ion hóa phun điện tử (LC-ESI/MS)

để xác định đồng thời sibutramine và các chất chuyển hóa trong huyết tương Mẫu được chiết từ huyết tương bằng tert-butyl ether, thêm chất chuẩn nội propranolol hydroclorid, bay hơi dung môi và hòa cặn trong pha động, phân tích trên thiết bị LC-ESI/MS Điều kiện sắc ký: cột ODS MS với pha động acetonitril chứa 0,1% trifloacetic acid Khoảng tuyến tính của sibutramine trong khoảng 0,328-32,8 ng/ml trên nền mẫu huyết tương và độ chụm dưới 19,9% Phương pháp có độ nhạy và độ chụm phù hợp để ứng dụng trong các nghiên cứu dược động học

Tác giả Sabina Strano-Rossi và cộng sự đã phát triển phương pháp sắc

ký lỏng khối phổ phân giải cao LC-HRMS để nhận biết và định lượng đồng thời các chất kích thích (ephedrines, cafein), các chất giảm cân (phentermine, phendimetrazine, phenmetrazine, fenfluramine, benfluorex, mephentermine, fencanfamine, sibutramine) và các chất cường dương nhóm PDE5 (sildenafil,

vardenafil, tadalafil) trong thực phẩm chức năng sử dụng phổ khối Orbitrap Detector khối phổ với khả năng phân giải 100.000 (FWHM tại m/z 200) hoạt động ở chế độ full scan và chế độ ion hóa phun điện tử ESI Các chất phân tích được nhận biết dựa vào thời gian lưu, phổ khối, và tỉ lệ tương quan của các đồng vị Giới hạn phát hiện của các chất từ 1-25 ng/g, giới hạn định lượng

là 50ng/g Phương pháp có độ tuyến tính cho tất cả các chất trong khoảng

50-2000 ng/g với hệ số tương quan >0,99 Phương pháp có độ chụm tốt, hệ số biến thiên CV % luôn thấp hơn 15% Các tác giả đã ứng dụng phương pháp

để phân tích 36 mẫu thực phẩm chức năng, phát hiện sự có mặt của ephedrine/pseudoephedrine trong 4 mẫu, cafein trong 8 mẫu, sildenafil trong

4 mẫu

Nhóm tác giả Ying Shi, Chengiun và cộng sự đã phát triển phương pháp sắc ký lỏng khối phổ ion hóa phun điện tử (HPLC-ESI-MS/MS) để xác định đồng thời 8 chất cấm (ephedrine, norpseudoephedrine, fenfluramine, sibutramine, clopamide, emodin, rhein, and chrysophanol) trong thực phẩm chức năng giảm cân Các chất phân tích được chiết ra khỏi nền mẫu bằng phương pháp chiết siêu âm với dung dịch 70% methanol, ly tâm và tiêm vào

hệ thống sắc ký Các chất được tách trên cột sắc ký Hypersil Gold column (2.1 mm × 150 mm, 5 μm) sử dụng chương trình rửa giải gradient, pha động gồm hỗn hợp dung dịch đệm amoni format (pH 3,50) và acid formic 0,02% và methanol, tốc độ dòng 0,25ml, nhiệt độ buồng cột 25oC Nhận biết định tính các chất dựa vào các ion đặc trưng và thời gian lưu sử dụng chế độ SRM Clenbuterol và ibuprofen được sử dụng làm nội chuẩn lần lượt cho chế độ ion dương và ion âm Hiêu suất thu hồi cho 3 khoảng nồng độ khác nhau từ 80,2 – 94,5% Giới hạn phát hiện từ 0,03 – 0,66 mg/kg (ngoại trừ chrysophnol 1,6 mg/kg) Phương pháp đã được ứng dụng để xác định chất cấm trong 4 loại thực phẩm chức năng giảm cân Các kết quả thống kê cho thấy sibutramin và hoặc fenfluramine là thành phần chất cấm chín trong các sản phẩm với hàm lượng lần lượt là 6,1 – 1,3 × 103 mg/kg and 1,9 – 9,7 × 103 mg/kg

Tác giả Ramakrishna và các cộng sự, đã phát triển phương pháp sắc ký lỏng 2 lần khối phổ LC-MS/MS để xác định sibutramine trong mẫu huyết tương người Phương pháp có độ chọn lọc và hiệu suất thu hồi cao Sử dụng chiết lỏng – lỏng và chất phân tích tách bằng chế độ đẳng dòng isocractic trên

cột sắc ký pha đảo Sau đó được phân tích trên thiết bị MS/MS Khoảng tuyến tính của sibutramine trong khoảng 30 – 6000 pg/ml trên nền mẫu huyết tương người Phương pháp có giới hạn phát hiện là 30 pg/ml với độ lệch chuẩn dưới 4% Thời gian phân tích cho mỗi lần là 3,2 phút và có thể phân tích hơn 250 mẫu huyết tương người mỗi ngày Phương pháp đã được thẩm định và được

sử dụng phân tích sibutramine trong các mẫu huyết tương người cho ứng dụng trong việc kết hợp với một chế độ ăn uống để giảm cân

Tác giả Li Ding và cộng sự đã phát triển phương pháp sắc ký lỏng khối phổ phun điện tử (LC-ESI-MS) có độ nhạy và đọ chính xác cao để xác định sibutramine và 2 chất chuyển hóa N-desmethyl của nó trong huyết tương người sử dụng phenoprolamine hydrochloride làm nội chuẩn Sau khi kiềm hóa với natri bicarbonate, các mẫu huyết tương được chiết với cyclohexane và tiêm vào hệ thống HPLC, quá trình tách trên cột pha đảo C18 với pha động đệm acetat 10mM (pH 3,5) và methanol (25/75) Các chất phân tích được xác định sử dụng chế độ ion hóa phun điên tử trong detector khối phổ 1 tứ cực Lc-ESI-MS được thực hiện trong chế độ chọn lọc ion (SIM) sử dụng các ion đặc trưng m/z = 228 cho sibutramine, m/z = 266 cho N-mono-desmethysibutramine (chất chuyển hóa 1), m/z = 252 cho N-di-desmethylsibutramine (chất chuẩn hóa 2) và m/z = 344 cho nội chuẩn Các đường chuẩn tuyến tính trong khoảng 0,05 – 20 µg/L cho sibutramine, 0,02 -

20 µg/L cho chất chuyển hóa 1 và 0,1 – 30 µg/L cho chất chuyển hóa 2 Giá trị độ lặp lại trong ngày nhỏ hơn 7,6% cho sibutramine, 8,9 % cho chất chuyển hóa 1 và 5,5% cho chất chuyển hóa 2 Giá trị độ lặp lại giữa các ngày

là nhỏ hơn 11,8% cho sibutramine, 12,7% cho chất chuyển hóa 1 và 9,4% cho chất chuyển hóa 2 Hiệu suất chiết các mẫu huyết tương lần lượt cho sibutramine, chất chuyển hóa 1 và chất chuyển hóa 2 là 90,2%, 90,9% và 91,0% Phương pháp được ứng dụng thành công để nghiên cứu dược động học của sibutramine và các chất chuyển hóa cho những người tình nguyện nam ở Trung Quốc

Đây là phương pháp phân tích hiện đại, có độ nhạy và độ chính xác cao Tuy nhiên, đây là một phương pháp khó, thiết bị phức tạp, đắt tiền và không phải phòng thí nghiệm nào cũng có điều kiện để thực hiện phương pháp này

1.3.3.3 Phương pháp điện di mao quản (CE)

Đây là phương pháp tách các chất phân tích là các ion hoặc các chất không ion nhưng có mối liên hệ chặt chẽ với các ion trong một ống mao quản hẹp chứa đầy dung dịch đệm, đặt trong điện trường Do độ linh độ điện di của các ion khác nhau, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau

Nhóm tác giả Yang Li và các cộng sự [28] đã phát triển phương pháp điện di mao quản hiệu năng cao để xác định đồng thời 07 hoạt chất trong mẫu thực phẩm chức năng là fenfluramin, pseudoephedrine, norpseudoephedrine, amfepramone, sibutramine, sildenafil và strychnine Sử dụng hỗn hợp đệm của natri tetraborate 20 mM, natri dodecyl sulfat 10 mM và acetonitrile 5% (pH = 9,0) và phân tích được thực hiện tại một bước sóng phát hiện 195 nm dưới một điện áp tách 17 kV ở 25°C Với giới hạn vi tuyến tính là 100 mg/l, với hệ số tương quan R lớn hơn 0,998 Độ lệch chuẩn tương đối dao động từ 4,5% và 7,9% (n = 7) Và độ thu hồi trung bình trong khoảng 79,6% -112,0% Các giới hạn phát hiện (S/N = 3) nằm trong khoảng 0,16 và 0,65 mg/l Phương pháp phân tích tương đối đơn giản, nhanh chóng, chọn lọc và chính xác Phương pháp đã được áp dụng thành công cho việc xác định 7 hoạt chất trong mẫu thực phẩm chức năng

1.3.3.4 Phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao HPTLC

Đây là một kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh trên đó đã đặt hỗn hợp các chất cần tách Pha tĩnh là chất hấp phụ được chọn phù hợp theo từng yêu cầu phân tích, được trải thành lớp mỏng đồng nhất và được cố định trên các phiến kính hoặc phiến kim loại Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được trộn với nhau theo tỷ

lệ phù hợp cho từng chất cần phân tích Trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp mẫu thử nghiệm được di chuyển trên lớp mỏng, theo hướng pha động, với những tốc độ khác nhau Kết quả, thu được một sắc ký đồ trên lớp mỏng Cơ chế của sự tách có thể là cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, sàng lọc kích thước phân tử hay sự phối hợp đồng thời

của nhiều cơ chế tùy thuộc vào tính chất của chất làm pha tĩnh và dung môi

pha động

Tác giả Etil Ariburnu và cộng sự đã phát triển phương pháp HPTLC để xác định sibutramine được bổ sung trái phép trong các sản phẩm giảm cân tự nhiên Sau khi chiết trong hỗn hợp Acetonitril và nước, chất phân tích được tách HPTLC sử dụng bản mỏng thủy tinh phủ silicagel 60 F254, pha động n-hexan-aceton-amoniac (10:1:0,1) Quét phổ ở bước sóng 225 nm Nguồn bức

xạ là đèn deuteri phát ra một quang phổ UV liên tục từ 200 nm và 400 nm, tốc

độ quét 10 mm/giây Đường chuẩn HPTLC tuyến tính trong khoảng 250-2000 ng/spot-1 Phương pháp được thẩm định về độ đúng, độ chụm, khoảng tuyến tính, độ thu hồi và độ ổn định giữa các ngày đạt yêu cầu

Nhóm nghiên cứu tại phòng thí nghiệm của hãng Camag cũng đã nghiên cứu phát triển phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao ghép nối detector khối phổ (HPTLC-MS) để xác định sibutramine cho trái phép vào các sản phẩm giảm cân có nguồn gốc thảo dược Mẫu được chiết với methanol, lắc, rung siêu âm, ly tâm, lọc và chấm sắc ký lớp mỏng sử dụng bản mỏng silicagel 60 GF254 (20x10) Quá trình khai triển sắc ký tự động trong buồng khai triển ADC2 với pha động toluene-methanol (9:1), bão hòa dung môi 20 phút, độ ẩm được kiểm soát bằng dung dịch bão hòa MgCl2, thời gian sấy khô 5 phút Quá trình nhận biết và định lượng sắc ký sử dụng phổ khối Q-trap chế độ ESI Các mảnh phổ đặc trưng: 280,2 -> 125,0 và 280,2 -> 139,0

Đây là phương pháp phân tích hiện đại, có độ chính xác cao Tuy nhiên, phương pháp có sử dụng nhiều dung môi hữu cơ rất độc hại, chi phí lớn Hơn nữa, đây là thiết bị không phổ biến cho các phòng thí nghiệm tại Việt Nam nên khó ứng dụng rộng rãi

1.3.3.5 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

Sibutramine hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại Sau khi qua cột tách, nó được phát hiện bởi detector UV, độ hấp thụ tỉ lệ với nồng độ là cơ sở cho sự định lượng

Tác giả A.P SuThar và cộng sự [23] đã phát triển và thẩm định phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo để phân tích định lượng sibutramine

hydrochloride monohydrate trong các mẫu viên nang Quá trình tách sắc ký được thực hiện trên cột Phenyl Hypersil (C-18, 250 x 4,6 mm, 5μm), pha động Acetonitrile: Amonium dihydrogen phosphat pH = 6,0 với detector UV

225 nm Giới hạn phát hiện của phương pháp là 0,09 µg/mL, giới hạn định lượng là 0,26 µg/mL Hiệu suất thu hồi trong khoảng 99,87-100,45%

Tác giả Etil Ariburnu và cộng sự [7] đã so sánh phương pháp HPLC và HPTLC để xác định sibutramine được bổ sung trái phép trong các sản phẩm giảm cân tự nhiên Quá trình tách HPTLC được thực hiện trên bản mỏng thủy tinh phủ silicagel 60 F254, sử dụng pha động n-hexan-aceton-amoniac (10:1:0,1) Quá trình phân tích trên HPLC sử dụng cột Phenyl (5,0µm, 150mm×4,6mm, i.d), pha động Acetonitrile: Nước: Acid formic (pH 3,0; 0,19M) (45:55:0,78; v:v:v), detector huỳnh quang, Ex = 316nm, Em = 225nm Đường chuẩn HPTLC tuyến tính trong khoảng 250-2000ng/spot-1, đường chuẩn HPLC trong khoảng 5-200µg/ml Cả 2 phương pháp đều được thẩm định về độ đúng, độ chụm, khoảng tuyến tính, độ thu hồi và độ ổn định giữa các ngày Các phương pháp đều hiệu quả cho phân tích hàng ngày trong các sản phẩm bổ sung trái phép sibutramine

Nhóm nghiên cứu thuộc trường đại học Dược, Bucharest, Rumani [6]

đã phát triển phương pháp HPLC để xác định đồng thời sibutramine và phenolphthalein trong các sản phẩm giảm cân có nguồn gốc thảo dược Các điều kiện sắc ký bao gồm: Cột CN Nucleosil (100-5 CN, 125 x 4,6 mm), pha động Acetonitrile: Kali dihydrogen phosphat pH = 4,0 (35:65, v:v), detector DAD ở 225 nm Nhóm tác giả đã tìm thấy hàm lượng trung bình của sibutramine là 24,71 mg/viên, phenolphthalein là 48,20 mg/viên

Tác giả Zhou Yu và cộng sự [26] đã phát triển một phương pháp HPLC-DAD đơn giản để xác định đồng thời 4 chất được bổ sung trái phép trong thực phẩm chức năng: orlistat, cetilistat, sibutramine và rimonabant Các chất phân tích được tách và định lượng bằng HPLC-DAD tại bước sóng

222 nm Quá trình tách được thực hiện trên cột C18 với chương trình rửa giải gradient gồm acetonitril và acid phosphoric 0,02 mol/L Hiệu suất thu hồi trong khoảng 96,1-97,2% Độ lặp lại trong ngày và độ tái lập giữa các ngày

<1% Giới hạn phát hiện là 189 ng/mL và đường chuẩn tuyến tính với hệ số

tương quan R2>0,999 Phương pháp với nhiều ưu điểm: đơn giản, nhanh, dễ dàng áp dụng và có thể sử dụng để phân tích hàng ngày

Tác giả E.Deconinck và cộng sự đã phát triển và thẩm định phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng UHPLC để phát hiện và định lượng các chất cấm trong thực phẩm chức năng giảm cân, bao gồm: sibutramine, modafinil, ephedrine, nor-ephedrine, metformin, theophyllin, caffeine, diethylpropion and orlistat Quá trình tách sắc ký sử dụng cột Vision HT C18-B (2 mm × 100 mm, 1.5 μm), rửa giải gradient với pha động là đệm acetat pH 5,0 và acetonitril Các đường chuẩn tuyến tính cho tất cả các chất trong khoảng nghiên cứu Độ chệch và độ lệch chuẩn tương đối lần lượt nhỏ hơn 3% và 1,5% cho tất cả các chất

Trong các kỹ thuật phân tích đã được ứng dụng để phân tích sibutramine, HPLC là kỹ thuật phổ biến nhất, dễ áp dụng và có độ chính xác cao Ngoài ra thiết bị HPLC được trang bị rộng rãi tại các phòng thí nghiệm ở Việt Nam Vì vậy, chúng tôi đã lựa chọn phương pháp HPLC được lựa để phân tích sibutramine trong thực phẩm chức năng giảm béo

1.4 Tổng quan về HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance Liquid Chromatography – HPLC) là kỹ thuật tách sắc ký trong đó các chất phân tích hòa tan trong pha động là chất lỏng và di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh Tùy thuộc vào

ái lực của chất phân tích với pha động và pha tĩnh mà các chất di chuyển với tốc độ khác nhau, do đó thứ tự rửa giải khác nhau Thành phần pha động đưa chất phân tích ra khỏi cột được thay đổi để rửa giải các chất với thời gian hợp

lý [1]

Hình 1.2 Sơ đồ khối của một máy sắc ký lỏng hiệu năng cao

a Hệ thống cung cấp pha động:

- Nguốn cấp pha động: pha động trong sắc ký lỏng thường là 2 dung môi hòa tan vào nhau để có khả năng tách với độ phân giải phù hợp, được chứa trong bình thủy tinh hoặc thép không rỉ

- Bộ phận loại khí (degasser): trước khi sử dụng cần lọc (màng lọc 0,45 µm)

và đuổi khí hòa tan trong pha động để tránh việc khí hòa tan có thể làm biến dạng pic, giảm hiệu lực cột, làm nhiễu đường nền Có thể loại khí hòa tan bằng cách: chạy siêu âm, sục khí trơ…

- Bộ phận trộn pha động (mixer): trộn các dung môi ở áp suất thấp hoặc áp suất cao

- Bơm: về mặt kết cấu có 3 loại thường gặp: Bơm đẩy một pittong, bơm làm đầy nhanh và bơm kép đẩy kéo

b Bộ phận tiêm mẫu:

- Mẫu lỏng hoặc dung dịch được tiêm thẳng vào pha động cao áp ngay ở đầu cột mà không cần dừng dòng bằng một van tiêm có vòng chứa mẫu Vòng chứa mẫu có dung tích khác nhau: thường dùng loại 0,50÷20 µL Có vòng chứa mẫu lớn hơn

- Ngoài ra, đôi khi người ta tiêm mẫu bằng bơm tiêm qua tấm đệm ở đầu cột Khi tiêm phải dừng dòng và áp suất trong cột không cao Cách tiêm này có độ lặp lại thấp, sai số lớn hơn so với khi dùng van tiêm

- Hiện nay hay dùng van tiêm mẫu vì có ưu điểm là sẽ dễ dàng tự động hóa, cột không bị tắc hay bị làm bẩn bởi các mảnh của vách ngăn, thể tích đưa vào

cột hằng định nên độ lặp lại cao

c Cột sắc ký

- Cột sắc ký lỏng hiệu năng cao thường được chế tạo bằng thép không gỉ, thủy tinh hoặc chất dẻo có chiều dài 10-30 cm, đường kính trong 4-10 mm Cột nhồi thường có hạt cỡ 5-10 µm Ưu điểm của cột có cột nhồi có hạt cỡ nhỏ là chạy tốn ít dung môi và ít thời gian và số đĩa lý thuyết lớn

- Để bảo vệ cột sắc ký, người ta sử dụng cột bảo vệ được đặt trước cột sắc ký

để loại các chất có mặt trong pha động và trong mẫu phân tích làm giảm tuổi thọ cột Cột bảo vệ ngắn hơn cột sắc ký, được nhồi hạt cùng loại nhưng kích thước hạt lớn hơn

- Sắc ký lỏng phân bố là kỹ thuật sử dụng phổ biến nhất hiện nay Loại pha tĩnh phổ biến nhất được chế tạo từ silic dioxid (silica) Nhóm OH trên bề mặt silica phản ứng với dẫn chất clorosilan tạo ra dẫn chất siloxan

Bề mặt silica Dẫn chất clorosilan Dẫn chất siloxan

Dựa vào độ phân cực tương đối của pha tĩnh và pha động đã hình thành hai loại sắc ký phân bố là sắc ký phân bố pha thuận và sắc ký phân bố pha đảo

d Detector

Trong nghiên cứu này, để quy trình xây dựng được có khả năng ứng dụng rộng, chúng tôi lựa chọn detector PDA, loại detector phổ biến trong cấu hình tiêu chuẩn của thiết bị HPLC hiện tại Về bản chất, đây là một detector UV-Vis cho phép đồng thời ghi nhận tín hiệu hấp thụ đồng thời trên toàn dải phổ UV gần và Vis Dải bức xạ UV-Vis (thường các detector PDA có dải bước sóng trong khoảng 190 – 800 nm) sau khi đi qua tế bào đo được đưa đến một cách tử để phân thành các tia đơn sắc đi đến một mảng diod quang Mỗi diod quang đón nhận một phần dải bức xạ tương ứng với một khoảng bước sóng hẹp Như vậy, mỗi một diod có thể phát hiện một sự hấp thu ở một bước sóng nhất định Toàn bộ dãy diod được quét nhiều lần trong 1 giây bởi bộ

phận vi xử lý Kết quả phổ có thể hiện trên màn hình máy tính hoặc được lưu trữ để in ra dưới dạng bản phổ bằng máy in

Ưu điểm của detector này là tạo được phổ UV của các chất phân tích trong khoảng bước sóng đã chọn, kiểm tra sự tinh khiết của sản phẩm và định danh được sản phẩm bằng cách so sánh phổ tương ứng của đỉnh sắc ký với phổ của một ngân hàng dữ liệu hoặc với phổ của chất chuẩn biết trước

e Hệ thống thu nhận và xử lý dữ liệu

Bộ phận lưu trữ dữ liệu của các thiết bị HPLC hiện nay thường là các máy vi tính hiện đại có khả năng ghi nhận, lưu giữ, biên tập, xử lý các thông tin hết sức hiệu quả

Chương 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

- Các mẫu thực phẩm chức năng giảm béo với dạng bào chế: Viên nang cứng và viên nang mềm

2.1.2 Mục tiêu nghiên cứu

- Nghiên cứu các điều kiện tách, xác định sibutramin bằng HPLC;

- Đánh giá giá trị sử dụng của phương pháp

- Phân tích một số mẫu thực phẩm chức năng giảm béo trên thị trường Hà Nội;

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Khảo sát lựa chọn các điều kiện tiến hành chạy máy HPLC trong phân tích sibutramine

- Khảo sát xây dựng quy trình xử lý mẫu để tách chiết sibutramine trong thực phẩm chức năng

- Đánh giá quy trình phân tích và xử lý mẫu

+ Tính đặc hiệu và chọn lọc của phương pháp (Specifility/Selectivity)

+ Giới hạn phát hiện (Limit of Detection – LOD)

+ Giới hạn định lượng (Limit of Quatification – LOQ)

+ Khoảng tuyến tính và đường chuẩn (Linearity and Calibration)

+ Độ lặp lại (Repeatability)

+ Độ thu hồi (Recovery)

- Áp dụng quy trình đã xây dựng để xác định chất cấm sibutramine trong một số sản phẩm thực phẩm chức năng giảm béo bán trên thị trường Hà Nội

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp lấy mẫu

- Mẫu thực phẩm chức năng giảm béo được lấy ngẫu nhiên trên thị trường

Hà Nội dưới dạng bào chế viên nang cứng và nang mềm

Đồng nhất mẫu, xác định khối lượng trung bình viên thuốc Cân chính xác một lượng mẫu sau khi đồng nhất (cân khoảng 0,3 đến 0,5 mg) vào ống ly tâm 50 mL

Thêm khoảng 20 mL dung môi chiết vào ống ly tâm

Lắc xoáy ống ly tâm 5 - 10 phút, sau đó lắc siêu âm 15-30 phút ở nhiệt

độ phòng

Ly tâm 5 phút, tốc độ 6000 vòng/phút Gạn lấy phần dịch, định mức 25

mL bằng cùng dung môi và lọc qua màng lọc 0,45 µm

Tiêm vào hệ sắc ký HPLC (pha loãng nếu cần)

- Sibutramine được chiết ra khỏi nền mẫu bằng các dung môi khác nhau

- Quy trình chiết sibutramine trong mẫu thực phẩm chức năng giảm béo dưới dạng viên nang cứng và viên nang mềm dự kiến gồm các bước sau: cho đối tượng phân tích là thực phẩm chức năng giảm béo dạng viên nén, viên nang cứng và nang mềm dự kiến gồm các bước sau:

Đồng nhất mẫu, xác định khối lượng trung bình viên thuốc Cân chính xác một lượng mẫu sau khi đồng nhất (cân khoảng 0,3 đến 0,5 mg) vào ống ly tâm 50 mL

Thêm khoảng 15 ml dung môi chiết vào ống ly tâm

Lắc xoáy ống ly tâm 5 - 10 phút, sau đó lắc siêu âm 15-30 phút ở nhiệt

độ phòng

Ly tâm 5 phút, tốc độ 6000 vòng/phút Gạn lấy phần dịch, định mức 25ml bằng cùng dung môi và lọc qua màng lọc 0,45µm

Tiêm vào hệ sắc ký HPLC (pha loãng nếu cần)

Hình 2.1 Quy trình phân tích mẫu dự kiến

Cân mẫu vào ống ly tâm 50 ml

b Khoảng tuyến tính

Khoảng tuyến tính của một phương pháp phân tích là khoảng nồng độ ở

đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được và nồng độ chất phân tích Khoảng làm việc của một phương pháp phân tích là khoảng nồng độ giữa giới hạn trên và giới hạn dưới của chất phân tích, tương ứng với nồng độ chất phân tích có mặt trong nền mẫu

Sau khi xác định khoảng tuyến tính cần xây dựng đường chuẩn và xác định hệ số tương quan (R2) Trong phân tích thực tế, có thể xây dựng các đường chuẩn ngắn, trùm lên vùng nồng độ trong mẫu, không nhất thiết phải lập đường chuẩn toàn bộ khoảng tuyến tính Nồng độ trong mẫu không được vượt ra ngoài giới hạn cao nhất và thấp nhất của đường chuẩn và tốt nhất phải nằm ở vùng giữa đường chuẩn

Có nhiều loại đường chuẩn khác nhau tùy thuộc vào các phương pháp

và kỹ thuật khác nhau Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành xây dựng đường chuẩn với chuẩn tinh khiết

- Cách xây dựng đường chuẩn trên chuẩn tinh khiết như sau:

Chuẩn bị dãy nồng độ chuẩn, xác định các giá trị tín hiệu y đo được tương ứng với nồng độ x Nếu sự phụ thuộc là tuyến tính, ta có khảo sát đường biểu diễn là một phương trình đường thẳng: y = ax + b

Trong đó: a là giá trị độ dốc slope

b là giá trị hệ số chặn intercept

c Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)

Giới hạn phát hiện LOD (Limit of detection) là nồng độ thấp nhất của

chất phân tích có thể xác định được nhưng không nhất thiết phải định lượng được trong điều kiện thí nghiệm cụ thể Trong sắc ký LOD có thể được xác định là nồng độ của chất phân tích mà tại đó tỉ lệ giữa tín hiệu của chất phân tích và tín hiệu nền bằng 3 (S/N =3)

Hoặc có thể tính LOD dựa vào độ lệch chuẩn như sau:

Tính giá trị nồng độ trung bình xtb, độ lệch chuẩn SD (S)

S

N

i

i

Để đánh giá LOD đã tính được ta kiểm tra qua giá trị R = LODxtb

Nếu 4 < R < 10 thì nồng độ dung dịch đem thử là phù hợp và giá trị LOD tính được là đáng tin cậy

Giới hạn định lượng LOQ (Limit of quantification) là nồng độ thấp nhất của chất phân tích có trong mẫu thử có thể phát hiện được về mặt định lượng với độ đúng và độ chụm nhận được Trong sắc ký LOQ có thể được xác định là nồng độ của chất phân tích mà tại đó tỉ lệ giữa tín hiệu của chất phân tích và tín hiệu nền bằng 10 (S/N =10) Có thể tính LOQ theo LOD theo công thức: LOQ = 10/3 * LOD

d Độ lặp lại

Độ lặp lại thể hiện sự gần nhau của các kết quả đo, là mức độ thống nhất của các kết quả thử riêng biệt khi quy trình phân tích được áp dụng lặp lại trên cùng một mẫu Độ lặp lại được thể hiện bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD Tiến hành thí nghiệm lặp lại 6 lần Tính độ lệch chuẩn tương đối RSD% của hàm lượng chất phân tích Các công thức tính toán như sau:

Tiến hành thí nghiệm n lần lặp lại

+ Giá trị trung bình :

x n

1 x

Trong đó x là giá trị trung bình số học của tập hợp các giá trị xi còn xi

là giá trị kết quả của mỗi lần thí nghiệm

+ Độ lệch chuẩn :

1 n

) x x ( SD

2 n

1 i i

x 100

x : kết quả phân tích được

: giá trị đúng của chất phân tích Trong trường hợp tham gia phân tích các mẫu thử nghiệm liên phòng thí nghiệm, có thể đánh giá kết quả thông qua giá trị Zscore Zscore được tính như sau:





 x

Trong đó: là độ lệch chuẩn tham chiếu

Nếu |Zscore| ≤ 2: Kết quả được chấp nhận

2 < |Zscore| ≤ 3: Kết quả có nghi ngờ

f Khảo sát độ thu hồi: Độ thu hồi được xác định dựa trên kĩ thuật thêm

chuẩn Lượng chất chuẩn thêm vào mẫu phân tích phải đảm bảo sao cho nồng độ của chất cần nghiên cứu sau khi thêm chuẩn nằm trong khoảng đã khảo sát Độ thu hồi (R%) được tính như sau:

100 C

C C

% R

c

m c

Các kết quả thu được trong quá trình tiến hành nghiên cứu đều được xử

lí bằng các phần mềm có sẵn trong thiết bị HPLC

Sử dụng các phương pháp xử lý thống kê trong phân tích nhờ các hàm toán học, thống kê có sẵn trong phần mềm tin học Microsoft Office Excel để tính toán: kết quả trung bình, độ lệch, độ lệch chuẩn, phương sai, độ lệch chuẩn tương đối, hệ số biến thiên, độ thu hồi khi xử lý các kết quả thực nghiệm và đánh giá thẩm định phương pháp

- Chất đối chiếu phenolphthalein (Số kiểm soát: MFCD00070132; hàm lượng: ≥85% (TLC) )

- Dung môi loại tinh khiết cho HPLC: Methanol, acetonitril, tetrahydrofuran (Merck)

- Dung môi loại tinh khiết phân tích: Ethanol, aceton (Merck)

- Hóa chất tinh khiết phân tích: Kali dihydrophosphat (Merck), amoni acetat (Merck)

- Nước cất 2 lần

- Dung dịch chuẩn sibutramine gốc 500 µg/ml: Cân chính xác một lượng chất đối chiếu sibutramine hydroclorid monohydrat tương đương khoảng 50,0 mg sibutramine vào cốc có mỏ 50 ml, hòa tan bằng 20 ml methanol và chuyển vào bình định mức 100 ml, dùng methanol tráng cốc, chuyển dịch tráng cốc vào cùng bình định mức, thêm methanol vừa đủ đến vạch, lắc kỹ Bảo quản trong tủ lạnh

- Dung dịch chuẩn làm việc: Hút chính xác 40,0 ml dung dịch chuẩn gốc vào bình định mức 100 ml, thêm methanol vừa đủ (dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ sibutramine 200 µg/ml)

- Các dung dịch chuẩn sibutramine có nồng độ nhỏ hơn được pha từ dung dịch chuẩn làm việc

- Dung dịch đánh giá độ phân giải: Chuẩn bị dung dịch hỗn hợp sibutramine, furosemid và phenolphthalein trong methanol có nồng độ mỗi chất là sibutramine 200 µg/mL, furosemid 100 µg/mL, phenolphthalein 100 µg/mL

- Dung dịch đệm amoni acetat 0,05 M (pH = 3,5): Cân chính xác khoảng 1,93 g muối amoni acetat hoà tan vào khoảng 400 mL nước, chỉnh đến pH = 3,5, định mức 500 mL, lọc qua màng lọc 0,2 µm

- Dung dịch đệm kali dihydrophosphat 0,05M (pH 4,0): Cân chính xác khoảng 3,4 g muối kali dihydrophosphat, hòa tan vào khoảng 400 mL nước, thêm 5mL tetrahydrofuran, chỉnh đến pH 4,0 bằng dung dịch acid phosphoric 5%, định mức bằng nước cất 2 lần tới 500 mL, lọc qua màng lọc 0,2 µm 2.5.2.Thiết bị, dụng cụ

- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Shimadzu (LC 20AD) trang bị detector PDA

- Cột sắc ký C18 Symmetry Waters (250 mm x 4,6 mm; 5 µm)

- Cân kỹ thuật XT1200c

- Cân phân tích Mettler Toledo có độ chính xác 0,0001 g và 0,00001 g

- Máy đo pH: pH Meter 744

- Máy lắc siêu âm Elma

- Máy ly tâm Hermle Z383K

- Máy lắc Vortex IKA

- Dụng cụ thủy tinh các loại: Bình định mức 20 ml, 50 ml, cốc có mỏ, pipet các loại, autopipet 1000 μl, 200 μl

- Ống ly tâm 50 ml

- Phễu lọc, giấy lọc, màng lọc 0,45 µm, 0,2µm

Hình 2.2 Thiết bị HPLC Shimadzu (LC 20AD)

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Tối ưu các điều kiện tách và xác định Sibutramine bằng HPLC

3.1.1 Lựa chọn bước sóng hấp thụ ánh sáng

Dựa vào tính chất của sibutramine hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại, tiến hành quét phổ bằng detector PDA để chọn bước sóng phù hợp cho nghiên cứu Phổ Sibutramine được quét từ bước sóng 192 nm đến 360 nm thu được sắc đồ như sau:

Hình 3.1 : Sắc ký đồ PDA của sibutramine

Qua kết quả tại hình 3.1 ta thấy sibutramine có cực đại hấp thụ ở 190nm và 225nm với độ tinh khiết pic > 99 % Tuy nhiên, để giảm nhiễu tạp chúng tôi chọn bước sóng 225nm để định lượng, với bước sóng này có thể dùng detector UV để thay thế trong trường hợp không có detector PAD

Việc dùng detector PDA không những dùng để định lượng mà trong quá trình phân tích để khẳng định sự có mặt của chất phân tích chúng ta có thể kết hợp được đồng thời xem dải bước sóng và xem được hình dạng phổ của chất phân tích Đặc biệt, trong nhóm các hoạt chất TPCN giảm béo có chứa rất nhiều các chất thuộc nhóm giảm béo có khả năng hấp thụ tại bước sóng 225 nm, nếu chỉ dựa vào thời gian lưu để khẳng định chất đó là sibutramine có thể dễ bị nhầm lẫn Vì vậy, khi kết hợp giữa thời gian lưu và hình dạng phổ hấp thụ có thể khẳng định chính xác chất cần phân tích Do đó,