2.3.1. Phương pháp lấy mẫu
- Mẫu thực phẩm chức năng giảm béo được lấy ngẫu nhiên trên thị trường Hà Nội dưới dạng bào chế viên nang cứng và nang mềm.
2.2.2. Phương pháp xử lý mẫu
Dựa vào khả năng hòa tan của sibutramine và tham khảo nhiều bài báo, nghiên cứu [23], [7], [16], [26], chúng tôi khảo sát khả năng chiết sibutramine từ nền mẫu bằng các loại các dung môi sau đây: Methanol, ethanol, nước, acetonitril, aceton.
Quy trình chiết sibutramine trong mẫu thực phẩm chức năng giảm béo dưới dạng viên nang cứng và viên nang mềm dự kiến gồm các bước sau: cho đối tượng phân tích là thực phẩm chức năng giảm béo dạng viên nén, viên nang cứng và nang mềm dự kiến gồm các bước sau:
Đồng nhất mẫu, xác định khối lượng trung bình viên thuốc. Cân chính xác một lượng mẫu sau khi đồng nhất (cân khoảng 0,3 đến 0,5 mg) vào ống ly tâm 50 mL.
Thêm khoảng 20 mL dung môi chiết vào ống ly tâm.
Lắc xoáy ống ly tâm 5 - 10 phút, sau đó lắc siêu âm 15-30 phút ở nhiệt độ phòng.
Ly tâm 5 phút, tốc độ 6000 vòng/phút. Gạn lấy phần dịch, định mức 25 mL bằng cùng dung môi và lọc qua màng lọc 0,45 µm.
Tiêm vào hệ sắc ký HPLC (pha loãng nếu cần).
- Sibutramine được chiết ra khỏi nền mẫu bằng các dung môi khác nhau - Quy trình chiết sibutramine trong mẫu thực phẩm chức năng giảm béo dưới dạng viên nang cứng và viên nang mềm dự kiến gồm các bước sau: cho đối tượng phân tích là thực phẩm chức năng giảm béo dạng viên nén, viên nang cứng và nang mềm dự kiến gồm các bước sau:
Đồng nhất mẫu, xác định khối lượng trung bình viên thuốc. Cân chính xác một lượng mẫu sau khi đồng nhất (cân khoảng 0,3 đến 0,5 mg) vào ống ly tâm 50 mL.
Thêm khoảng 15 ml dung môi chiết vào ống ly tâm.
Lắc xoáy ống ly tâm 5 - 10 phút, sau đó lắc siêu âm 15-30 phút ở nhiệt độ phòng.
Ly tâm 5 phút, tốc độ 6000 vòng/phút. Gạn lấy phần dịch, định mức 25ml bằng cùng dung môi và lọc qua màng lọc 0,45µm.
Tiêm vào hệ sắc ký HPLC (pha loãng nếu cần)
Hình 2.1. Quy trình phân tích mẫu dự kiến
2.3.3 Thẩm định phương pháp phân tích
- Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp xác định sibutramine trong mẫu thực phẩm chức năng giảm béo tại PTN với các thông số:
Mẫu TPCN chứa chất béo Mẫu TPCN không chứa chất béo
Loại béo Chiết lặp HPLC Cặn Gạn dịch chiết vào bình định mức Lắc vortex Ly tâm 6000 vòng/phút /5 phút Lọc
Mẫu đã loại chất béo + Dung môi chiết
Rung siêu âm + Dung
môi
+ Dung môi
a. Tính chọn lọc, đặc hiệu
Tính chọn lọc nói lên khả năng xác định đúng chất phân tích khi có mặt các tạp chất hoặc các chất khác tiến hành như sau.
Để xác định tính đặc hiệu/chọn lọc đối với sắc ký chúng tôi đã tiến hành phân tích các mẫu trắng phải không cho tín hiệu phân tích, mẫu trắng có thêm chất chuẩn.
b. Khoảng tuyến tính
Khoảng tuyến tính của một phương pháp phân tích là khoảng nồng độ ở đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được và nồng độ chất phân tích. Khoảng làm việc của một phương pháp phân tích là khoảng nồng độ giữa giới hạn trên và giới hạn dưới của chất phân tích, tương ứng với nồng độ chất phân tích có mặt trong nền mẫu.
Sau khi xác định khoảng tuyến tính cần xây dựng đường chuẩn và xác định hệ số tương quan (R2). Trong phân tích thực tế, có thể xây dựng các đường chuẩn ngắn, trùm lên vùng nồng độ trong mẫu, không nhất thiết phải lập đường chuẩn toàn bộ khoảng tuyến tính. Nồng độ trong mẫu không được vượt ra ngoài giới hạn cao nhất và thấp nhất của đường chuẩn và tốt nhất phải nằm ở vùng giữa đường chuẩn.
Có nhiều loại đường chuẩn khác nhau tùy thuộc vào các phương pháp và kỹ thuật khác nhau. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành xây dựng đường chuẩn với chuẩn tinh khiết.
- Cách xây dựng đường chuẩn trên chuẩn tinh khiết như sau:
Chuẩn bị dãy nồng độ chuẩn, xác định các giá trị tín hiệu y đo được tương ứng với nồng độ x. Nếu sự phụ thuộc là tuyến tính, ta có khảo sát đường biểu diễn là một phương trình đường thẳng: y = ax + b.
Trong đó: a là giá trị độ dốc slope b là giá trị hệ số chặn intercept
c. Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)
chất phân tích có thể xác định được nhưng không nhất thiết phải định lượng được trong điều kiện thí nghiệm cụ thể. Trong sắc ký LOD có thể được xác định là nồng độ của chất phân tích mà tại đó tỉ lệ giữa tín hiệu của chất phân tích và tín hiệu nền bằng 3 (S/N =3).
Hoặc có thể tính LOD dựa vào độ lệch chuẩn như sau:
Tính giá trị nồng độ trung bình xtb, độ lệch chuẩn SD (S) LOD = 3.S 1 1 2 N x x S N i i
Để đánh giá LOD đã tính được ta kiểm tra qua giá trị R = LODxtb
Nếu 4 < R < 10 thì nồng độ dung dịch đem thử là phù hợp và giá trị LOD tính được là đáng tin cậy.
Giới hạn định lượng LOQ (Limit of quantification) là nồng độ thấp nhất của chất phân tích có trong mẫu thử có thể phát hiện được về mặt định lượng với độ đúng và độ chụm nhận được. Trong sắc ký LOQ có thể được xác định là nồng độ của chất phân tích mà tại đó tỉ lệ giữa tín hiệu của chất phân tích và tín hiệu nền bằng 10 (S/N =10). Có thể tính LOQ theo LOD theo công thức: LOQ = 10/3 * LOD.
d. Độ lặp lại
Độ lặp lại thể hiện sự gần nhau của các kết quả đo, là mức độ thống nhất của các kết quả thử riêng biệt khi quy trình phân tích được áp dụng lặp lại trên cùng một mẫu. Độ lặp lại được thể hiện bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD. Tiến hành thí nghiệm lặp lại 6 lần. Tính độ lệch chuẩn tương đối RSD% của hàm lượng chất phân tích. Các công thức tính toán như sau:
Tiến hành thí nghiệm n lần lặp lại. + Giá trị trung bình :
n 1 i i x n 1 x
Trong đó x là giá trị trung bình số học của tập hợp các giá trị xi còn xi
là giá trị kết quả của mỗi lần thí nghiệm. + Độ lệch chuẩn : 1 n ) x x ( SD 2 n 1 i i
+ Độ lệch chuẩn tương đối: 100 X SD RSD
e. Độ đúng
Độ đúng đánh giá sự phù hợp của kết quả thực nghiệm so với giá trị thực (true value) hoặc được chấp nhận thực (accepted value).
- Phân tích mẫu chuẩn (vật liệu chuẩn): Mẫu đã biết trước nồng độ của
chất phân tích. Kết quả tính ra độ chệch: Độ chệch = x x 100
x : kết quả phân tích được
: giá trị đúng của chất phân tích
Trong trường hợp tham gia phân tích các mẫu thử nghiệm liên phòng thí nghiệm, có thể đánh giá kết quả thông qua giá trị Zscore. Zscore được tính như sau: Zscore = x
Nếu |Zscore| ≤ 2: Kết quả được chấp nhận 2 < |Zscore| ≤ 3: Kết quả có nghi ngờ |Zscore| > 3: Kết quả có sai lệch.
f. Khảo sát độ thu hồi: Độ thu hồi được xác định dựa trên kĩ thuật thêm
chuẩn. Lượng chất chuẩn thêm vào mẫu phân tích phải đảm bảo sao cho nồng độ của chất cần nghiên cứu sau khi thêm chuẩn nằm trong khoảng đã khảo sát. Độ thu hồi (R%) được tính như sau:
100 C C C % R c m c m
Trong đó: Cm+c: Nồng độ trong mẫu thêm chuẩn Cm: Nồng độ trong mẫu
Cc: Nồng độ chuẩn thêm 2.4. Phương pháp xử lý số liệu
Các kết quả thu được trong quá trình tiến hành nghiên cứu đều được xử lí bằng các phần mềm có sẵn trong thiết bị HPLC
Sử dụng các phương pháp xử lý thống kê trong phân tích nhờ các hàm toán học, thống kê có sẵn trong phần mềm tin học Microsoft Office Excel để tính toán: kết quả trung bình, độ lệch, độ lệch chuẩn, phương sai, độ lệch chuẩn tương đối, hệ số biến thiên, độ thu hồi khi xử lý các kết quả thực nghiệm và đánh giá thẩm định phương pháp.
2.5. Hóa chất, thiết bị 2.5.1. Hóa chất
- Chất đối chiếu sibutramine hydroclorid monohydrat (Sigma - Adrich) (Số kiểm soát: MFCD04039806; hàm lượng: ≥98% (HPLC)).
- Chất đối chiếu furosemid (Số kiểm soát: MFCD00010549; hàm lượng: 99%).
- Chất đối chiếu phenolphthalein (Số kiểm soát: MFCD00070132; hàm lượng: ≥85% (TLC) ).
- Dung môi loại tinh khiết cho HPLC: Methanol, acetonitril, tetrahydrofuran (Merck).
- Dung môi loại tinh khiết phân tích: Ethanol, aceton (Merck)
- Hóa chất tinh khiết phân tích: Kali dihydrophosphat (Merck), amoni acetat (Merck).
- Nước cất 2 lần
- Dung dịch chuẩn sibutramine gốc 500 µg/ml: Cân chính xác một lượng chất đối chiếu sibutramine hydroclorid monohydrat tương đương khoảng 50,0 mg sibutramine vào cốc có mỏ 50 ml, hòa tan bằng 20 ml methanol và chuyển vào bình định mức 100 ml, dùng methanol tráng cốc, chuyển dịch tráng cốc vào cùng bình định mức, thêm methanol vừa đủ đến vạch, lắc kỹ. Bảo quản trong tủ lạnh.
- Dung dịch chuẩn làm việc: Hút chính xác 40,0 ml dung dịch chuẩn gốc vào bình định mức 100 ml, thêm methanol vừa đủ (dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ sibutramine 200 µg/ml).
- Các dung dịch chuẩn sibutramine có nồng độ nhỏ hơn được pha từ dung dịch chuẩn làm việc.
- Dung dịch đánh giá độ phân giải: Chuẩn bị dung dịch hỗn hợp sibutramine, furosemid và phenolphthalein trong methanol có nồng độ mỗi chất là sibutramine 200 µg/mL, furosemid 100 µg/mL, phenolphthalein 100 µg/mL.
- Dung dịch đệm amoni acetat 0,05 M (pH = 3,5): Cân chính xác khoảng 1,93 g muối amoni acetat hoà tan vào khoảng 400 mL nước, chỉnh đến pH = 3,5, định mức 500 mL, lọc qua màng lọc 0,2 µm.
- Dung dịch đệm kali dihydrophosphat 0,05M (pH 4,0): Cân chính xác khoảng 3,4 g muối kali dihydrophosphat, hòa tan vào khoảng 400 mL nước, thêm 5mL tetrahydrofuran, chỉnh đến pH 4,0 bằng dung dịch acid phosphoric 5%, định mức bằng nước cất 2 lần tới 500 mL, lọc qua màng lọc 0,2 µm. 2.5.2.Thiết bị, dụng cụ
- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Shimadzu (LC 20AD) trang bị detector PDA.
- Cột sắc ký C18 Symmetry Waters (250 mm x 4,6 mm; 5 µm). - Cân kỹ thuật XT1200c.
- Cân phân tích Mettler Toledo có độ chính xác 0,0001 g và 0,00001 g. - Máy đo pH: pH Meter 744.
- Máy lắc siêu âm Elma. - Máy ly tâm Hermle Z383K - Máy lắc Vortex IKA
- Dụng cụ thủy tinh các loại: Bình định mức 20 ml, 50 ml, cốc có mỏ, pipet các loại, autopipet 1000 μl, 200 μl.
- Ống ly tâm 50 ml
- Phễu lọc, giấy lọc, màng lọc 0,45 µm, 0,2µm.
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tối ưu các điều kiện tách và xác định Sibutramine bằng HPLC 3.1.1. Lựa chọn bước sóng hấp thụ ánh sáng
Dựa vào tính chất của sibutramine hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại, tiến hành quét phổ bằng detector PDA để chọn bước sóng phù hợp cho nghiên cứu. Phổ Sibutramine được quét từ bước sóng 192 nm đến 360 nm thu được sắc đồ như sau:
Hình 3.1 : Sắc ký đồ PDA của sibutramine
Qua kết quả tại hình 3.1 ta thấy sibutramine có cực đại hấp thụ ở 190nm và 225nm với độ tinh khiết pic > 99 %. Tuy nhiên, để giảm nhiễu tạp chúng tôi chọn bước sóng 225nm để định lượng, với bước sóng này có thể dùng detector UV để thay thế trong trường hợp không có detector PAD.
Việc dùng detector PDA không những dùng để định lượng mà trong quá trình phân tích để khẳng định sự có mặt của chất phân tích chúng ta có thể kết hợp được đồng thời xem dải bước sóng và xem được hình dạng phổ của chất phân tích. Đặc biệt, trong nhóm các hoạt chất TPCN giảm béo có chứa rất nhiều các chất thuộc nhóm giảm béo có khả năng hấp thụ tại bước sóng 225 nm, nếu chỉ dựa vào thời gian lưu để khẳng định chất đó là sibutramine có thể dễ bị nhầm lẫn. Vì vậy, khi kết hợp giữa thời gian lưu và hình dạng phổ hấp thụ có thể khẳng định chính xác chất cần phân tích. Do đó,
trong nghiên cứu này chúng tôi đã sử dụng detector PDA để xác định chất phân tích.
3.1.2. Lựa chọn một số điều kiện sắc ký
Qua tham khảo một số nghiên cứu của các tác giả trên thế giới và tiến hành thử nghiệm sơ bộ tại phòng thí nghiệm, chúng tôi lựa chọn được một số điều kiện phân tích trên HPLC như sau:
- Cột C18 Symestry: dài 250mm; đường kính cột: 4,6 mm; cỡ hạt: 5µm - Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút
- Thể tích tiêm mẫu: 50 µl
- Detector: PDA quét dải phổ từ bước sóng 200 nm đến 450 nm - Bước sóng phát hiện: 225 nm
- Nhiệt độ cột: 300C
Các thông số này sẽ được giữ cố định khi thực hiện các thí nghiệm khảo sát để lựa chọn điều kiện pha động để tách sibutramine.
3.1.3 Khảo sát pha động
Các hoạt chất có nguy cơ bổ sung vào phẩm thực phẩm chức năng giảm béo ngoài sibutramine còn có thể là furosemid và phenolphthalein. Qua tham khảo tài liệu và nghiên cứu sơ bộ cho thấy, sibutramine khi chạy ở chế độ đẳng dòng khó tách được khỏi hỗn hợp có furosemid và phenolphthalein. Vì vậy, việc tiến hành nghiên cứu các điều kiện gradient với các loại dung môi khác nhau để có tách được chất phân tích tốt. Qua tham khảo các tài liệu nghiên cứu trên thế giới chúng tôi lựa chọn 4 hệ dung môi với các thành phần như bảng 3.1 để khảo sát:
Bảng 3.1 Thành phần hệ dung môi pha động
Thành phần pha động
Hệ pha động 1 Kênh A: Amoni acetat (0,05 M, pH = 3,5)
Kênh B: Methanol
Hệ pha động 2 Kênh A: Amoni acetat (0,05 M, pH = 3,5)
Kênh B: Acetonitril
Hệ pha động 3 Kênh A: Kali dihydrophosphat (0,05M, pH = 4,0)
Hệ pha động 4 Kênh A: Kali dihydrophosphat (0,05 M, pH = 4,0)
Kênh B: Acetonitril
Tiến hành khảo sát khả năng tách của riêng sibutramine và tách sibutramine khi có mặt cả furosemid và phenolphthalein bằng cách chuẩn bị dung dịch chuẩn sibutramine 100 µg/ml và hỗn hợp chứa sibutramine, furosemid, phenolphthalein với các nồng độ tương ứng, sử dụng chương trình gradient như bảng 3.2 với các hệ pha động khác nhau thu được các kết quả như sau:
- Hệ pha động 1: Kênh A: Amoni acetat (0,05 M, pH = 3,5)
Kênh B: Methanol với gradient theo bảng .
Bảng 3.2 Chương trình gradient của hệ pha động Amoni acetat - methanol
Thời gian (phút)
Tỷ lệ pha động (%) Kênh A : Amoni acetat
(hoặc đệm phosphat) Kênh B : Acetonitril (hoặc methanol) 0,1 80 20 1 80 20 3 60 40 11 50 50 12 50 50 13 80 20 17 80 20 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 min 0 100 200 mAU 225nm,4nm (1.00) /1 4 .6 6 8 / 6 0 9 4 8 3 2 sibutramin
Hình 3.2: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn sibutramine với hệ pha động 1 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 min 0 250 500 750 1000 mAU 225nm,4nm (1.00) /1 0 .6 5 4 /1 7 0 3 3 6 2 5 /1 2 .1 3 6 /2 0 0 9 2 6 9 9 /1 4 .8 0 0 /7 2 3 3 5 5 4
Hình 3.3: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp với hệ pha động 1
Qua kết quả khảo sát (hình 3.2) và (hình 3.3) cho thấy sibutramine được tách khỏi hỗn hợp chứa furosemid và phenolphthalein nhưng tín hiệu đường nền không được tốt, pic sibutramine bị doãng chân và kéo đuôi
- Hệ pha động 2: Kênh A: Amoni acetat (0,05 M, pH = 3,5)
Kênh B: Acetonitril
Tiến hành khảo sát theo chương trình gradient bảng 3.2.
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 min -100 0 100 200 mAU 225nm,4nm (1.00) / 1 2 . 1 4 2 / 5 1 9 5 5 7 4
Hình 3.4: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn sibutramine với hệ pha động 2
sibutramin
sibutramin phenolphtalein
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 min