Nghiên cứu xác định tác nhân gây bệnh gan thận mủ trên cá tra Việt Nam Pangasius hypophthalmus bằng kỹ thuật lamp (Loop-mediated isothermal amplification)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NÔI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ---o0o--- TRẦN THỊ THANH HUYỀN NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN GÂY BỆNH GAN THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA VIỆT NAM Pangasius hypophthalmus

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NÔI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-o0o -

TRẦN THỊ THANH HUYỀN

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN GÂY BỆNH GAN THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA VIỆT NAM

Pangasius hypophthalmus BẰNG KỸ THUẬT LAMP

(Loop - mediated isothermal amplification)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI – 2013

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NÔI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-o0o -

TRẦN THỊ THANH HUYỀN

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN GÂY BỆNH GAN THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA VIỆT NAM

Pangasius hypophthalmus BẰNG KỸ THUẬT LAMP

(Loop - mediated isothermal amplification)

CHUYÊN NGÀNH: VI SINH VẬT HỌC

MÃ SỐ: 62.42.40.01

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

1 GS TS TRƯƠNG NAM HẢI

2 PGS TS KIỀU HỮU ẢNH

HÀ NỘI - 2013

LỜI CẢM ƠN Trước tiên tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám hiệu, phòng Đào tạo Sau Đại học, Ban Chủ nhiệm Khoa Sinh học, Bộ môn Vi sinh vật học và các thầy cô

trong Khoa Sinh học nơi đã đào tạo, dạy dỗ và tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi có thể hoàn thành tốt quá trình học tập của mình

Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS TS Trương Nam Hải - Viện Trưởng

Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam là người hướng dẫn chính của tôi trong nghiên cứu này GS định hướng nghiên cứu, tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi có

cơ hội tiếp cận với các khía cảnh mới của công nghệ sinh học và hoàn thành tốt luận án của mình, đồng thời luôn luôn động viên, khích lệ tôi trong công việc Tôi xin được bày tỏ lòng

biết ơn sâu sắc đến PGS TS Kiều Hữu Ảnh là người đồng hướng dẫn của tôi PGS đã là

người chỉ đường, định hướng cho tôi không chỉ trong công việc chuyên môn mà truyền tải cho tôi nhiều kinh nghiệm quý báu trong cuộc sống của mình

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến TS Nguyễn Thị Trung – Phòng Kỹ

thuật di truyền, Viện Công nghệ sinh học người đã cận kề cùng tôi trong công việc và dành nhiều thời gian thảo luận các phương pháp nghiên cứu để tôi có thể hoàn thành được luận án của mình Đồng thời, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn đến các cán bộ Phòng Kỹ thuật di truyền, Viện Công nghệ sinh học đã nhiệt tình dạy dỗ, chỉ bảo, hướng dẫn cho tôi từ những ngày đầu làm việc nơi đây cho đến khi tôi hoàn thành toàn bộ kết quả luận án Tôi xin bày tỏ

lòng biết ơn đến TS Bùi Thị Việt Hà – Chủ nhiệm bộ môn Vi sinh vật học – Khoa Sinh học,

Trường Đại học Khoa học tự nhiên đã tạo điều kiện về mặt thời gian cho tôi trong thời gian làm luận án

Cuối cùng, tôi xin được bày tỏ lòng tri ân sâu sắc tới Bố-Mẹ tôi, người đã nuôi dưỡng

và dạy dỗ tôi, Chồng và con là chỗ dựa tinh thần và nguồn động viên để tôi có đủ nghị lực để hoàn thành nhiệm vụ của mình

Hà nội, ngày 15 tháng 9 năm 2013

TRẦN THỊ THANH HUYỀN

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của một tập thể mà tôi là thành viên chính thức thực hiện các nghiên cứu Các số liệu và kết quả thí nghiệm được trình bày trong luận án là trung thực

và không trùng lặp với bất kỳ công trình nào khác

NGHIÊN CỨU SINH

Trần Thị Thanh Huyền

1.2.1 Đặc điểm sinh học 18

1.2.3 Độc tố gây bệnh và gen mã hóa độc tố gây bệnh 24

1.5 KỸ THUẬT LAMP (Loop- mediated isothermal amplifications) 30

1.5.2 Nguyên lý thiết kế mồi cho phản ứng LAMP 33

1.5.4 Các phương thức phát hiện sự khuếch đại của phản ứng

LAMP

38

1.5.4.2 Phát hiện dựa vào chất phát huỳnh quang 39

1.5.4.3 Phát hiện dựa vào sản phẩm phụ của phản ứng 40

1.5.6 Các hướng nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật LAMP tại Việt

Nam

43

Chương 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 46

2.1 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ MÁY MÓC 46

2.2.2.2 Tách chiết DNA plasmid từ tế bào E coli 51

2.2.2.6 Phản ứng cắt DNA plasmid bằng enzym hạn chế 56

2.2.2.9 Chọn lọc các thể biến nạp mang plasmid tái tổ hợp 59

2.2.2.10 Tinh sạch sản phẩm DNA plasmid bằng QIAGEN kit 59

2.2.3.1 Xác định độ biến thiên Mg 2+ trong phản ứng 60

2.2.3.6 Xác định nhiệt độ phản ứng tối ưu 61

2.2.3.7 Xác định thời gian phản ứng tối ưu 61

2.2.3.8 Xác định độ đặc hiệu của phản ứng LAMP 61

2.2.3.9 Xác định giới hạn phát hiện của phản ứng LAMP 62

2.2.4 Phương pháp cảm nhiễm vi khuẩn gây bệnh vào vật chủ 62

2.2.5 Xử lí số liệu bằng phần mềm vi tính 64

3.1.3 Khả năng di động, sinh indol và sinh H 2 S 69

3.1.4 Xác định hoạt tính catalase 72

PHÂN TỬ

76

3.2.2 Phân loại bằng so sánh trình tự rDNA 16S 77

3.3 PHÂN LẬP, TÁCH DÒNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN eip18

CỦA VI KHUẨN E ictaluri

79

3.3.2 Tách dòng gen eip18 bằng vector pJet 2.1/blunt 81

3.3.3 Kiểm tra sự có mặt của gen eip18 trong vector tái tổ hợp 81

3.4.1 Thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn E ictaluri E5 86

3.4.2 Thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn E ictaluri E7 87

3.4.3 Thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn E ictaluri E40 88

3.4.4 Dấu hiệu bệnh lý của cá sau khi cảm nhiễm 91

3.4.5 Kết quả tái phân lập và định danh vi khuẩn 93

3.5 PHÁT HIỆN GEN eip18 CỦA VI KHUẨN E ictaluri BẰNG KỸ

THUẬT LAMP

95

3.5.1 Khuếch đại gen eip18 bằng kỹ thuật LAMP 95

3.5.2 Tối ưu các điều kiện của phản ứng LAMP 97

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CÓ LIÊN QUAN

ĐẾN NỘI DUNG LUẬN ÁN

113

PHỤ LỤC

NHỮNG TỪ VIẾT TẮT

BHIA Brain Heart Infusion Agar Môi trường thạch BHI

CFU Conoly forming unit Đơn vị hình thành khuẩn lạc

ĐBSCL Đồng bằng sông Cửu long

EIM Edwardsiella ictaluri medium Môi trường đặc hiệu E ictaluri

EtBr Ethidium Bromide

ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay Kỹ thuật miễn dịch hấp phụ gắn

enzym FDA Food and Drug Administration Cục quản lý thực phẩm và dược

phẩm Hòa Kỳ FDR Flourescent dectection reagent Thuốc thử phát hiện bằng huỳnh

quang

RNA Ribonucleic acid

rRNA Ribosomal Ribonucleic acid

TAE Tris-acetate-EDTA

UV Ultraviolet

DANH MỤC CÁC BẢNG

1 Bảng 1.1 Diện tích và sản lượng nuôi cá tra ở các địa phương năm 2011 8

2 Bảng 1.2 Các loài cá vật chủ mà vi khuẩn E tarda và E ictaluri gây

5 Bảng 2.3 Bố trí công thức thí nghiệm cảm nhiễm cá tra 63

6 Bảng 3.1 Kí hiệu và nguồn gốc các chủng vi khuẩn phân lập từ cá tra

Việt Nam

66

7 Bảng 3.2 Hoạt tính phân giải chondroitin của các chủng nghiên cứu 75

8 Bảng 3.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các chủng vi khuẩn phân lập từ

cá tra Việt Nam

76

9 Bảng 3.4 So sánh trình tự gen eip18 của các dòng E5/4, E40/3 và Ei/10

với trình tự gen eip18 của vi khuẩn E ictaluri và gen evpC của

vi khuẩn E tadar bằng chương trình ClustalW

3 Hình 1.3 Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri soi dưới kính hiển vi điện tử

(A) và nhuộm Gram (B)

19

4 Hình 1.4 Bộ kit API-20E với các giếng phản ứng sinh hóa 29

5 Hình 1.5 Nguyên tắc thiết kế mồi cho phản ứng LAMP 34

6 Hình 1.6 Nguyên lý khuếch đại ADN của phản ứng LAMP 38

7 Hình 1.7 Quy trình phát hiện tác nhân gây bệnh bằng phương pháp

LAMP

39

8 Hình 1.8 Nguyên tắc của sự phát quang bởi Calcein 41

9 Hình 1.9 Phát hiện phản ứng LAMP bằng đo độ đục, bằng huỳnh

quang hoặc soi dưới đèn UV

42

10 Hình 2.1 Bản đồ vector tách dòng pJet 1.2/blunt 46

11 Hình 3.1 A- Giải phẫu nội tạng cá tra khỏe mạnh A và

B - cá tra biểu hiện bệnh gan thận mủ

67

12 Hình 3.2 Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn E7 và E ictaluri ATCC 33202

trên môi trường EIM

68

13 Hình 3.3 Hình dạng khuẩn lạc vi khuẩn E tarda và vi khuẩn phân lập

từ mẫu gan, thận, tỳ tạng cá bệnh trên môi trường BHIA

68

14 Hình 3.4 Hình ảnh nhuộm Gram của mẫu vi khuẩn phân lập được kí

hiệu E40 bắt màu Gram âm và đối chứng là vi khuẩn Bacillus subtilis bắt màu Gram dương

69

15 Hình 3.5 Khả năng di động, sinh indol và H2S của các các mẫu phân

lập tại Việt Nam E5, E7, E10, E40

70

16 Hình 3.6 Phản ứng phân giải tryptophan thành gốc indol 72

17 Hình 3.7 Khả năng sinh catalaza của các mẫu vi khuẩn nghiên cứu và

E.i- E ictaluri ATCC 33202

72

18 Hình 3.8 Hoạt tính chondroitinase của các mẫu vi khuẩn nghiên cứu 74

19 Hình 3.9 Hoạt tính tan huyết của các mẫu vi khuẩn nghiên cứu 75

20 Hình 3.10 Điện di kiểm tra sản phẩm tách genom trên gel agarose 77

21 Hình 3.11 Cây phát sinh chủng loại của các mẫu vi khuẩn E5, E7 và

E40 phân lập tại Việt Nam so với các loài gần gũi dựa trên trình tự rADN 16S

78

22 Hình 3.12 Sơ đồ thiết kế tách dòng gen eip18 của vi khuẩn E ictaluri 79

23 Hình 3.13 Phân lập gen eip18 từ vi khuẩn E ictaluri 80

24 Hình 3.14 A Kết quả điện di sản phẩm DNA plasmid tách từ tế bào

E coli DH 10B B Kết quả PCR đoạn gen eip18 trên plasmid

bằng cặp mồi Eip18

82

25 Hình 3.15 A - Kết quả điện di đồ sản phẩm cắt plasmid bằng enzym

hạn chế BglII B - Kiểm tra điện di đồ sản phẩm cắt plasmid bằng enzym KpnI

83

26 Hình 3.16 Điện di đồ sản phẩm plasmid đã tinh sạch của các dòng tế

bào E5/4, Ei/10 và E40/3

83

27 Hình 3.17 So sánh trình tự gen eip18 của các mẫu vi khuẩn nghiên cứu 85

với trình tự gen eip18 đã được công bố trên Ngân hàng Gene

28 Hình 3.18 Biểu đồ tỷ lệ % cá tra giống bị chết theo ngày cảm nhiễm

bởi vi khuẩn E ictaluri E5

86

29 Hình 3.19 Biểu đồ tỷ lệ % cá tra giống bị chết theo ngày cảm nhiễm

bởi vi khuẩn E ictaluri E7

87

30 Hình 3.20 Biểu đồ tỷ lệ % cá tra giống bị chết theo ngày cảm nhiễm

bởi vi khuẩn E ictaluri E40

88

31 Hình 3.21 Đốm trắng trên nội quan cá tra A- Cá thu ở ao nuôi thâm

canh; B- Cá được gây cảm nhiễm bởi vi khuẩn E ictaluri

trong phòng thí nghiệm; C- Cá khỏe mạnh

91

32 Hình 3.22 Đặc điểm mô bệnh học của cá tra gây cảm nhiễm bởi vi

khuẩn E ictaluri

92

33 Hình 3.23 Kết quả tái phân lập vi khuẩn trên cá tra sau khi cảm nhiễm

bằng các mẫu vi khuẩn nghiên cứu

94

35 Hình 3.25 Cắt sản phẩm LAMP bằng enzyme Mnl I 97

37 Hình 3.27 Ảnh hưởng của thời gian tới phản ứng LAMP khuếch đại

gen eip18 của mẫu vi khuẩn E ictaluri E7

99

38 Hình 3.28 Ảnh hưởng của nồng độ dNTPs đến phản ứng LAMP 100

39 Hình 3.29 Ảnh hưởng của tỷ lệ mồi (A) và nồng độ Betain (B) đến

phản ứng LAMP

101

40 Hình 3.30 Ảnh hưởng của nồng độ MgSO4 đến phản ứng LAMP 102

41 Hình 3.31 Ảnh hưởng của nồng độ MgSO4đến sự phát quang của

Calcein

102

42 Hình 3.32 Giá trị OD400 tương ứng với các nồng độ MgSO4 khác nhau 103

43 Hình 3.33 Phát hiện sản phẩm phản ứng LAMP bằng chỉ thị Calcein

dưới tia UVtrong điều kiện phòng có chiếu sáng (A) và trong buồng tối (B)

104

44 Hình 3.34 Phát hiện sản phẩm phản ứng LAMP bằng chỉ thị SYBR

Green I

105

45 Hình 3.35 Giới hạn phát hiện gen eip18 của phản ứng LAMP 106

46 Hình 3.36 Độ đặc hiệu của cặp mồi khuếch đại gen eip18 bằng phản

ứng LAMP

108

MỞ ĐẦU

Nuôi trồng thủy sản trong đó có nuôi cá tra thương phẩm hiện đóng một vai trò quan trọng trong ngành xuất khẩu nói chung và xuất khẩu thủy sản nói riêng Hoạt động này đã và đang được nhiều chính phủ khuyến khích nhằm tạo ra lượng hàng hóa

có giá trị kinh tế cao, giải quyết vấn đề việc làm cho người lao động, tăng thu nhập và góp phần đẩy lùi nghèo đói ở các nước đang phát triển Ở Việt Nam, trong 10 năm trở lại đây nghề nuôi cá tra đang phát triển rất nhanh với quy mô lớn tại một số tỉnh đồng bằng Sông Cửu Long như An Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ, Bến Tre, Tiền Giang… với

diện tích nuôi trồng đạt 6.300 ha mặt nước tính đến năm 2011 [15] Cá tra Pangasius hypophthalmus là loài đặc hữu của lưu vực sông Mê Kông và được xem là một trong

những đối tượng xuất khẩu tiềm năng Ước tính trung bình kim ngạch xuất khẩu cá tra hàng năm đóng góp khoảng 10% tổng kim ngạch xuất khẩu Theo thống kê của Hiệp hội nuôi trồng và xuất khẩu thủy sản, năm 2008 xuất khẩu cá tra ra thị trường thế giới đạt 1,2 tỷ USD, năm 2009 đạt 1,34 tỷ USD, năm 2010 đạt 1,4 tỷ USD, năm 2011 đạt 1,8 tỷ USD, dự kiến kim ngạch xuất khẩu cá tra ra thị trường thế giới bao gồm Châu

Âu, Mỹ, Mexico… đạt 1,8 đến 2 tỷ USD đến hết năm 2012 [16]

Sự phát triển quá nhanh không theo quy hoạch của ngành nuôi cá tra tại khu vực Đồng bằng sông Cửu long đã dẫn đến sự bùng nổ dịch bệnh trên diện rộng, dịch bệnh diễn ra hàng năm gây thiệt hại không nhỏ cho người dân, ảnh hưởng nghiêm trọng tới môi trường thủy sản và các ngành kinh tế liên quan Một trong những bệnh nguy hiểm trên cá tra là bệnh gan thận mủ hay còn gọi là bệnh đốm trắng nội tạng được phát hiện lần đầu tiên tại Việt Nam vào đầu mùa lũ năm 1998 ở một số vùng nuôi cá thâm canh trọng điểm như An Giang, Đồng Tháp và Cần Thơ Sau đó bệnh lan rộng ra các tỉnh nuôi cá tra lân cận và cả một số tỉnh mới phát triển nuôi cá tra như Trà Vinh, Bến Tre, Sóc Trăng [3] Thời kỳ cao điểm của bệnh dịch thường vào tháng 9 tới tháng 12 Bệnh được đánh giá là vô cùng nguy hiểm do tốc độ lây lan nhanh, khó kiểm soát và khó

điều trị do bệnh không có những triệu chứng điển hình ở giai đoạn sớm Tốc độ lây lan của bệnh tỷ lệ thuận với mức độ thâm canh, mật độ nuôi cá trên một đơn vị diện tích ao nuôi Thêm vào đó, vấn đề quản lý nguồn nước, quản lý thức ăn và khống chế bệnh dịch còn chưa đáp ứng kịp với việc mở rộng diện tích nuôi trồng hàng năm dẫn đến việc khi đã xuất hiện bệnh thì thường gây ra dịch cho cả một vùng nuôi trồng thủy sản

Do đó, việc xác định sớm và nhanh tác nhân gây bệnh sẽ đóng góp không nhỏ vào vấn

đề kiểm soát bệnh dịch, giảm thiểu những tổn thất kinh tế cho người nuôi và các ngành kinh tế liên quan Tại Việt Nam, tuy đã có nhiều công trình nghiên cứu xác định tác nhân gây bệnh gan thận mủ trên cá tra nhưng chưa có sự thống nhất về kết quả Năm

2001, Ferguson và cs đã công bố tác nhân gây bệnh là Bacillus sp [43] Một năm sau

đó tác giả lại đính chính tác nhân gây bệnh là Edwardsiella ictaluri [36] Cũng trong năm đó, ở Indonesia nhóm nghiên cứu của Kei Yuasa và cs lần đầu tiên chứng minh E ictaluri là tác nhân gây bệnh đốm trắng nội tạng ở cá tra [119] Năm 2003 Trần Thị Minh Tâm và cs công bố tác nhân gây bệnh là vi khuẩn Hanfia alvei và Pleisiomonas shigelloides [11] Khác hoàn toàn với các kết quả nghiên cứu trước đây, khi Lý Thị Thanh Loan và cs năm 2007 công bố tác nhân gây bệnh là Clostridium sp - trực khuẩn

Gram dương, kỵ khí bắt buộc trong khi các tác nhân được công bố trước đây đều là trực khuẩn Gram âm [7] Còn tại Mỹ, các nhà khoa học đã khẳng định chính xác tác

nhân gây hoại tử gan, thận và nhiễm trùng huyết trên cá nheo Mỹ Ictalurus punctatus

là vi khuẩn E ictaluri [94] Mặc dù đã có nhiều công trình nghiên cứu khẳng định tác nhân gây bệnh gan thận mủ là E ictaluri nhưng bên cạnh đó vẫn tồn tại những ý kiến

cho rằng đó là do vi khuẩn khác gây ra Như vậy, việc xác định tác nhân chính gây bệnh gan thận mủ trên cá tra Việt Nam là vấn đề cần phải được làm sáng tỏ

Có rất nhiều phương pháp khác nhau để xác định sự có mặt của một tác nhân gây bệnh từ những phương pháp truyền thống như: phân lập trên môi trường chọn lọc, xác định đặc tính sinh lý, hóa sinh, phương pháp huyết thanh học… đến các phương pháp phân tử như PCR, RT-PCR, multiplex PCR… Tuy nhiên, việc phát triển một

phương pháp chẩn đoán nhanh, chính xác tác nhân gây bệnh và có khả năng ứng dụng nhanh bên ngoài phòng thí nghiệm đóng vai trò quan trọng không chỉ góp phần khẳng định tác nhân gây bệnh gan thận mủ trên cá tra Việt Nam mà còn có ý nghĩa quan trọng trong phòng chống, kiểm soát và điều trị bệnh Xuất phát từ thực tế đó, chúng tôi tiến hành đề tài:

“Nghiên cứu xác định tác nhân gây bệnh gan thận mủ trên cá tra Việt Nam Pagasius hypophthalmus bằng kỹ thuật LAMP (Loop-mediated isothermal

amplification”

Mục tiêu của đề tài:

- Xác định tác nhân gây bệnh gan thận mủ trên cá tra Việt Nam Pangasius hypophthalmus

- Chẩn đoán nhanh, chính xác tác nhân gây bệnh trên các mẫu bệnh phẩm bằng

kỹ thuật LAMP

Nội dung nghiên cứu:

- Phân lập vi khuẩn từ các mẫu cá tra bị bệnh gan thận mủ thu được tại khu vực Đồng bằng Sông Cửu Long

- Xác định một số đặc điểm sinh hóa và phân loại dựa vào trình tự gen mã hóa rARN 16S

- Phân lập, tách dòng và xác định trình tự gen đặc trưng của vi khuẩn phân lập được

- Sử dụng kỹ thuật LAMP để phát hiện vi khuẩn dựa trên trình tự của gen đặc trưng của vi khuẩn đó

- Tối ưu hóa các điều kiện phản ứng LAMP khuếch đại gen đặc trưng của vi khuẩn

- Sử dụng chỉ thị kim loại Calcein để làm dấu hiệu phát hiện phản ứng bằng mắt thường

Những đóng góp mới của luận án:

- Lần đầu tiên ứng dụng một phương pháp chẩn đoán phẩn tử mới có tên là LAMP – khuếch đại đẳng nhiệt có tạo thành các vòng để xác định bệnh do vi khuẩn gây ra ở thủy sản

- Đây là phương pháp đơn giản, phát hiện nhanh kết quả bằng mắt thường dựa vào sự thay đổi của chỉ thị kim loại Calcein từ cam sang xanh mà không cần sự

hỗ trợ của các thiết bị nghiên cứu khác

Luận án được thực hiện tại: Viện Công nghệ Sinh học – Viện Khoa học và Công

nghệ Việt Nam

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 CÁ TRA VÀ BỆNH GAN THẬN MỦ

1.1.1 Cá tra Pangasius hypophthalmus

Cá tra và cá basa là hai trong số 11 loài thuộc họ cá tra Pangasiidae đã được xác

định ở sông Cửu Long Theo dẫn liệu từ http://www.itis.gov [124], hệ thống phân loại của loài cá tra được xác định như sau :

Giới: Animalia Linnaeus, 1758

Ngành: Chordata Bateson, 1885

Ngành phụ: Vertebrata Cuvier, 1812

Tổng lớp: Osteichthyes Huxley, 1880 – Bony fishes

Lớp: Actinopterygii Huxley, 1880 – Ray-finned fishes

Lớp phụ: Neopterygii Tổng bộ: Ostaryphysi

Bộ: Siluriformes

Họ cá tra: Pangasiidae - Bleeker, 1858

Giống cá tra dầu: Pangasius Valenciennes in Cuvier and Valenciennes, 1840 Loài cá tra: Pangasius hypophthalmus (Sauvage, 1878)

Các đồng danh của loài cá tra bao gồm:

- Helicophagus hypophthalmus Sauvage, 1878

- Pangasianodon hypophthalmus Sauvage, 1878

- Pangasius hypophthalmus Sauvage, 1878

- Pangasius pangasius non Hamilton,1822

- Pangasius pleurotaenia non Sauvage, 1878

- Pangasius sutchi Fowler, 1937

Cá tra phân bố tự nhiên chủ yếu ở vùng hạ lưu sông Mê kông, có mặt ở cả bốn nước Lào, Việt Nam, Campuchia, Thái Lan Tài liệu phân loại gần đây nhất của tác giả

W Rainboth xếp cá tra thuộc giống cá tra dầu Tên loài Pangasianodon hypophthalmus

Thái là Pla saa wha, pla suey và Việt Nam là cá tra [14]

Ở nước ta những năm trước đây khi chưa có sinh sản cá nhân tạo, cá bột và cá tra giống được vớt trên sông Tiền và sông Hậu Cá trưởng thành chỉ thấy trong ao nuôi, rất ít gặp ở tự nhiên và địa phận Việt Nam do cá có tập tính di cư ngược dòng sông Mê kông để sinh sống và tìm nơi sinh sản tự nhiên Hiện nay, cá tra nước ta được đưa vào nuôi công nghiệp trên quy mô lớn tại các vùng thuộc đồng bằng Sông Cửu Long bao gồm các tỉnh trọng điểm như Cần Thơ, An Giang, Đồng Tháp, Vĩnh Long, Bến Tre và một số tỉnh lân cận với diện tích mặt nước lên đến 6.300 ha bao gồm cả diện tích mặt nước tận dụng trên các sông lớn như sông Tiền và sông Hậu [15]

Cá nheo Mỹ thuộc họ Ictaluridae, bộ Siluriformes [103] với đặc điểm gồm 8 râu

quanh miệng, đuôi xẻ đôi sâu, nhiều đốm 2 bên cơ thể, vây lưng và vây ngực có gai nhọn, cứng [110] Loài cá này đẻ trứng dễ dàng nhưng lại không sinh sản trong ao nuôi Loài này có khả năng chịu oxi thấp, mật độ nuôi cao và có khả năng thích ứng nhanh với sự thay đổi khí hậu, sử dụng được thức ăn công nghiệp nên được xem là đối tượng tiềm năng của các mô hình nuôi trồng và sản xuất thủy sản ở quy mô công nghiệp Khác với cá nheo Mỹ về một số đặc điểm sinh học trong đó đặc điểm dễ nhận

thấy nhất là cá tra Pangasius hypophthalmus chỉ có 2 đôi râu ở miệng, đôi râu mép dài

và đôi râu hàm dưới ngắn [14] Đối tượng này được nuôi ở quy mô công nghiệp ở một

số tỉnh đồng bằng Sông Cửu Long như: An Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ, Bến Tre, Tiền Giang… với tốc độ phát triển rất nhanh và đem lại lợi ích cao cho người nông dân Tuy nhiên, thiệt hại hàng năm do bệnh dịch gây ra cũng rất lớn và mặc dù được phát hiện muộn hơn so với một số các bệnh khác nhưng bệnh gan thận mủ được đánh giá là bệnh gây thiệt hại nghiêm trọng Tỷ lệ cá chết do nhiễm bệnh cao, từ 50 - 60%

và nguy hiểm nhất là giai đoạn cá giống Ở giai đoạn này tỷ lệ cá chết có thể lên tới

Bảng 1.1 Diện tích và sản lượng nuôi cá tra ở các địa phương năm 2011 [15]

Tỉnh Sản lượng (tấn) Diện tích nuôi trồng (ha)

2011, đã có hơn 230 doanh nghiệp xuất khẩu cá tra đến hơn 130 thị trường trên thế giới bao gồm Châu Âu, Mỹ, Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc và Hồng Kông, Australia, Canada, Mehico, Nga… đạt giá trị 1,8 tỷ USD, tăng gần 26,5% với khối lượng xuất khẩu trên 600 nghìn tấn, tăng 3% so với năm 2010 [15]

thủy sản bị nhiễm bệnh và những xác động vật thủy sản bị bệnh chết là nguồn gây bệnh chính Tác nhân gây bệnh sinh sản rất nhanh làm tăng số lượng và đi vào môi trường nước bằng nhiều con đường khác nhau như: theo các vết loét của cá để đi ra nước qua

hệ thống cơ quan bài tiết, cơ quan tiêu hóa, cơ quan sinh dục hoặc qua mang, xoang miệng, xoang mũi Ngoài ra, trong nước có nhiều chất mùn bã hữu cơ, nước thải các nhà máy công nghiệp, nước thải của các trại chăn nuôi gia cầm, gia súc, nước thải sinh hoạt, phân rác… cũng tạo điều kiện cho bệnh truyền nhiễm phát sinh, phát triển Bệnh lại có thể lây truyền theo chiều ngang giữa các cá thể và theo chiều dọc từ thế hệ này sang thế hệ khác và có thể lây truyền trực tiếp hay gián tiếp Do đó, khi đã xuất hiện cá thể bệnh trong ao nuôi mà không phát hiện kịp thời để có hướng điều trị thích hợp thì

sẽ rất dễ bùng phát thành dịch gây tổn thất về kinh tế lớn cho người nuôi

Ở ĐBSCL, bệnh gan thận mủ xuất hiện lần đầu tiên vào mùa lũ năm 1998 ở các tỉnh nuôi cá tra thâm canh phát triển mạnh như An Giang, Đồng Tháp và Cần Thơ Sau

đó, bệnh lan dần đến các vùng có nuôi cá tra lân cận Đặc biệt, những năm gần đây bệnh này cũng xuất hiện ở một số tỉnh mới phát triển nuôi cá tra như Trà Vinh, Bến Tre, Sóc Trăng [3]… và hiện nay, hầu hết các tỉnh có hoạt động nuôi trồng cá tra đều

có các báo cáo về việc phát hiện bệnh tại các ao nuôi và tình hình thiệt hại hàng năm

1.1.2.1 Tác nhân gây bệnh

Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri lần đầu tiên được phân lập năm 1976 từ cá da

trơn bị bệnh và đây là tác nhân chính gây nhiễm trùng huyết nội tạng trên cá da trơn, một bệnh nghiêm trọng ảnh hưởng lớn đến ngành nuôi cá da trơn thương mại Bệnh tiến triển nhanh chóng và tỷ lệ tử vong cao làm thiệt hại đáng kể cho người nuôi cá nheo ở vùng Đông nam nước Mỹ Kể từ lần đầu tiên mô tả bệnh nhiễm khuẩn huyết

đường ruột trên cá da trơn, vi khuẩn E ictaluri đã liên tục được phân lập từ các loài cá

không phải là cá da trơn như cá kiếm xanh, cá hồi …Vi khuẩn có thể được phân lập từ thận, máu, não trên môi trường giàu dinh dưỡng ở nhiệt độ 30°C trong 48 giờ Vi khuẩn phát triển chậm nên việc xác định hình thái khuẩn lạc cũng như các đặc tính sinh hóa điển hình cần nhiều thời gian Đến năm 1981, Hawke và cs đã mô tả đầy đủ các

đặc tính của vi khuẩn và xếp vi khuẩn này vào chi Edwardsiella [49]

Trên đối tượng cá da trơn được nuôi trồng với mục đích xuất khẩu ở Việt Nam như cá tra và cá basa những năm gần đây có dấu hiệu biểu hiện bệnh gan thận mủ hay còn được gọi là bệnh đốm trắng gan, thận gây thiệt hại lớn cho người nuôi Cá thường

bị nhiễm bệnh vào các tháng cuối năm khi nhiệt độ nước hạ thấp, khoảng từ tháng 9 đến tháng 1 năm sau Tuy nhiên, hiện nay bệnh đã trở nên phổ biến trên cá tra và xảy ra quanh năm Nguyên nhân chính là do việc tăng diện tích và mức độ thâm canh cũng như việc sát trùng nguồn nước của những ao nuôi bị nhiễm bệnh trước khi thải ra môi trường chưa được kiểm soát triệt để Thời điểm phát triển bệnh và khả năng lây lan của bệnh khác nhau theo từng năm liên quan tới những biến động về thời tiết và điều kiện nuôi trồng Vi khuẩn luôn tồn tại trong môi trường ao nuôi và trong cơ thể cá khỏe mạnh, khi bị sốc do vận chuyển, thay đổi nhiệt độ, thức ăn cũng có thể dẫn đến bùng phát bệnh Trung bình trong một vụ nuôi, bệnh có thể xuất hiện 3-4 lần, hao hụt giống

từ 10-50% chủ yếu ở giai đoạn cá giống từ 300-500 g tùy thuộc vào chế độ chăm sóc

và quản lý [2]

Tác nhân chính gây bệnh gan thận mủ trên cá tra Việt Nam vẫn còn là câu hỏi chưa có câu trả lời chính xác Bệnh gan thận mủ trên cá tra nuôi ở Đồng Bằng Sông Cửu Long được phát hiện đầu tiên vào cuối năm 1998 và gọi là bệnh BNP (Bacillary Necrosis of Pangasius) [43] Khi cá tra bị bệnh, biểu hiện bên ngoài không có gì đặc biệt, một số có hiện tượng xuất huyết ở các vây, có khi xuất huyết toàn thân, khi giải phẫu và quan sát nội tạng thấy có nhiều đốm trắng trên gan, thận và tỳ tạng, trong xoang bụng có chứa dịch hơi đặc Theo Từ Thanh Dung và cs (2005) ở khu vực ĐBSCL bệnh gan, thận mủ ảnh hưởng chủ yếu đến các tỉnh có nghề nuôi cá tra thâm

canh phát triển mạnh như An Giang, Đồng Tháp và Cần Thơ, sau đó bệnh lây lan sang các vùng lân cận và hiện tại bệnh cũng xuất hiện ở một số tỉnh mới phát triển nuôi cá tra như Trà Vinh, Bến Tre và Sóc Trăng Các vi khuẩn phân lập từ cá tra bị bệnh gan

thận mủ được định danh là E ictaluri dựa trên các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh

hoá [36] Còn ở khu vực Châu Á, Yuasa và cs lần đầu tiên phát hiện cá tra nuôi trong

ao ở Sumatra, Indonexia có dấu hiệu bệnh lý tương tự như bệnh gan thận mủ và xác

định tác nhân gây bệnh là E ictaluri vào năm 2003 [119] Tuy nhiên, kết quả nghiên

cứu của Trần Thị Minh Tâm và cs năm 2003 cho rằng tác nhân gây bệnh gan thận mủ

trên cá tra là hai loài vi khuẩn Hafnia alvei và Pleisiomonas shigelloides [11] Lý Thị

Thanh Loan và cs năm 2007 ghi nhận kết quả nghiên cứu bước đầu tác nhân gây bệnh

gan thận mủ ở cá tra là vi khuẩn Clostridium sp [7] Năm 2008, tác giả Đặng Thị

Hoàng Oanh cùng các đồng nghiệp tại khoa Bệnh học thủy sản, Đại học Cần Thơ cũng xác định vi khuẩn phân lập từ cá tra bị bệnh gan thận mủ được thu từ ao nuôi và từ thí nghiệm cảm nhiễm bằng phương pháp sinh hoá truyền thống kết hợp với kit API 20 là

vi khuẩn E ictaluri Sau đó, sử dụng phương pháp PCR phát hiện vùng đặc hiệu nằm giữa đoạn gen rADN 16S và 23S của vi khuẩn E ictaluri để khẳng định kết quả định

danh bằng phương pháp sinh hoá [8] Năm 2010, Crumlish và cs đã cảm nhiễm cá tra

giống với vi khuẩn E ictaluri và A hydrophila bằng cả hai phương pháp ngâm và tiêm

đã một lần nữa khẳng định E ictaluri là tác nhân gây bệnh gan thận mủ trên cá tra Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage) [34]

Như vậy, cho đến thời điểm này việc xác định chính xác đâu là tác nhân chính gây bệnh gan thận mủ trên cá tra vẫn chưa có một câu trả lời thỏa đáng, nhưng có thể

khẳng định vi khuẩn E ictaluri là một trong những đối tượng cần được nghiên cứu kỹ

càng hơn

1.1.2.2 Đường lây truyền

Vi khuẩn E ictaluri có thể nhiễm vào cá bằng hai đường khác nhau: Vi khuẩn

trong nước có thể qua đường mũi của cá xâm nhập vào cơ quan khứu giác và di chuyển

vào dây thần kinh khứu giác, sau đó vào não [68] Bệnh lan rộng từ màng não đến sọ

và da Vi khuẩn E ictaluri cũng có thể xâm nhiễm qua đường tiêu hoá qua niêm mạc

ruột vào máu gây nhiễm trùng máu Qua đường tiêu hóa, vi khuẩn vào mao mạch trong

biểu bì gây hoại tử và mất sắc tố của da Cá da trơn còn nhiễm E ictaluri qua đường

miệng gây nhiễm khuẩn ruột Bệnh tiến triển gây viêm ruột, viêm gan và viêm cầu thận trong vòng 2 tuần sau khi nhiễm khuẩn [94]

1.1.2.3 Triệu chứng bệnh

Cá tra Việt Nam mắc bệnh gan thận mủ có những biểu hiện như sau [3]:

- Ở mức độ nhẹ cá ăn ít, gầy yếu, bụng chướng to, mắt hơi lồi, bên ngoài thân cá bình thường không biểu hiện xuất huyết nhưng khi mổ kiểm tra gan, thận, tỳ tạng xuất hiện nhiều đốm trắng như đốm mủ, kích thước từ 1-3 mm Đó là biểu hiện bệnh lý đặc trưng nhất của bệnh gan thận mủ

Hình 1.1 Cá tra bị bệnh gan thận mủ với bụng sưng to và nhiều đốm trắng ở nội tạng

- Mức độ nặng: Cá bệnh bỏ ăn, bơi lờ đờ trên mặt nước, nhào lộn và xoay tròn Khi bệnh nặng cá không phản ứng với tiếng động Một số cá xuất huyết tất cả các vây hoặc xuất huyết toàn thân Đó là những biểu hiện đặc trưng nhất của bệnh gan thận

mủ Trường hợp nặng cá xuất huyết trầm trọng, khi nhấc lên khỏi mặt nước máu sẽ chảy ra từ da và mang Một số cá bệnh còn biểu hiện màu sắc nhợt nhạt, có nhiều mảng nhợt lớn, nhỏ trên da Số lượng cá chết hàng ngày khá cao và tăng dần [12]

1.1.2.4 Bệnh tích

 Bệnh tích đại thể [43]

Gan, thận cá bệnh sưng rất to, thận có hiện tượng nhũn, tỳ tạng sưng ít hơn Trên gan, thận, tỳ tạng xuất hiện nhiều đốm trắng tròn, đường kính khoảng 1- 3 mm khắp bề mặt và cả bên trong Những đốm trắng này có chứa dịch hơi đặc Khi cấy dịch trong các đốm trắng này lên môi trường thạch sau 24 giờ thấy xuất hiện các khuẩn lạc thuần nhất

Các đốm trắng này dễ nhầm lẫn với các đốm trắng do nhóm kí sinh trùng gây ra Tuy nhiên, đốm trắng do ký sinh trùng gây ra thường xuất hiện không nhiều, đa số chỉ xuất hiện trên tỳ tạng và không nổi rõ Khi quan sát dưới kính hiển vi, nếu bên trong các đốm trắng có chứa dịch màu trắng như sữa đặc thì đó kí sinh trùng Còn khi cá bị bệnh đốm trắng do vi khuẩn thì các đốm trắng nổi rất nhiều, lộ rõ trên bề mặt và xuất hiện trên cả ba cơ quan là gan, thận và tỳ tạng

trình sung huyết kéo dài dẫn đến vỡ mạch máu và giải thoát nhiều enzym (protease, lipase) làm các tế bào ở vùng viêm bị hủy hoại dẫn đến hoại tử Quan sát thấy những tế bào đã tách rời nhau, nhân tế bào co lại và vỡ vụn, cuối cùng những tế bào này bị tiêu hủy [3]

Khi cá bị bệnh nặng, những tổn thương lan rộng làm gan không còn chức năng khử độc và lọc máu, làm chất độc tích tụ trong cơ thể kết hợp với những yếu tố khác làm cá chết Ngoài ra, do tổ chức gan bị hư hại làm mất khả năng tiết mật của gan Một

số cá mới chết khi mổ ra thấy túi mật bị vỡ, dịch mật lan tràn khắp nội quan [13] Điều này có thể do khi gan bị hoại tử đồng thời cũng hoại tử ống dẫn mật và túi mật làm túi mật vỡ làm dịch mật thoát ra ngoài

Thận

Cấu trúc vi thể của thận bị hủy hoại trầm trọng, các phản ứng sưng viêm xảy ra

ở toàn bộ tổ chức Thận sưng to đồng thời bị nhũn do sung huyết, một phần có thể do tích tụ nước trong thận mà không đào thải được do hệ thống tiểu cầu thận và ống thận

bị tổn thương Phản ứng viêm kéo dài gây hoại tử và mất chức năng các đơn vị cấu tạo nên thận Mô tạo máu nằm xen kẽ với các tế bào kẽ và các tế bào nội tiết của thận cũng

bị hoại tử làm cho máu trong cơ thể bị giảm sút Khi thận bị hoại tử, chức năng bài tiết chất thải trong quá trình trao đổi chất bị ngưng trệ Trong khi đó quá trình trao đổi chất lại đặc biệt tăng mạnh do cơ thể cá huy động các tổ chức nhằm đào thải các tác nhân gây bệnh Ngoài ra, hai loại hormon tuyến thượng thận là adrenalin và noradrenalin không được sản xuất khi thận bị hoại tử cũng góp phần làm rối loạn chức năng sinh lý của cá [13]

các vật lạ và vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể) Khi tác nhân gây bệnh xâm nhập quá nhiều sẽ gây ra tình trạng quá tải đến một lúc nào đó tế bào sẽ mất chức năng và thoái hoá Quá trình hoại tử ở tỳ tạng bắt đầu từ quá trình thoái hoá và hoại tử các tiểu thể tỳ tạng làm mất chức năng tạo hồng cầu mới và phá hủy hồng cầu già cũng như không thể sản xuất các tế bào lympho và bạch cầu bảo vệ cơ thể, chống các tác nhân gây bệnh Cũng như thận, mô tạo máu bị phá hủy nên tỳ tạng mất chức năng cung cấp máu cho

cơ thể [13] [11]

Mang

Quan sát lát cắt ngang của mang cá dưới kính hiển vi cho thấy có những vùng các sợi mang bị dính lại với nhau Điều này có thể do khi vi khuẩn tấn công, phản ứng miễn dịch tự bảo vệ của cơ thể cá làm cho các sợi mang bị sưng lên và khi hai hoặc nhiều sợi mang ở gần nhau sưng lên cùng lúc sẽ dẫn đến sự tiếp xúc của các sợi mang Sợi mang chỉ được bao bọc bởi một lớp tế bào rất mỏng với nhiều mạch máu nhỏ nên rất dễ bị phình lên dưới tác động của phản ứng viêm hay do vi khuẩn tấn công [12]

Sự kết dính của các sợi mang làm giảm khả năng hô hấp của cá Do đó, cá bệnh

sẽ có biểu hiện thiếu oxy và thường tập trung ở mặt nước Bệnh càng trầm trọng hơn khi cá bị mất máu do hiện tượng xuất huyết và vùng mô tạo máu ở thận và tỳ tạng bị hủy hoại

Tim và cơ

Quan sát tiêu bản tim và cơ cá bệnh dưới kính hiển vi không thấy biến đổi lớn

về mô học Điều này chứng tỏ hai cơ quan này ít bị ảnh hưởng trực tiếp bởi vi khuẩn

Tóm lại, khi cá bị bệnh gan thận mủ các cơ quan bị huỷ hoại nặng nhất là gan, thận, tỳ tạng kế đến là mang, cuối cùng bị ảnh hưởng nhẹ nhất là tim và cơ Nguyên nhân làm chết cá có thể do gan, thận, tỳ tạng, mang bị hư hại dẫn đến mất chức năng của các cơ quan này [4]

1.1.2.5 Khả năng bùng phát bệnh

Tốc độ lây lan của bệnh gan thận mủ rất nhanh Trong điều kiện thí nghiệm khi

có mầm bệnh xâm nhập, khoảng 3- 4 ngày toàn bộ cá nuôi trong bể đều bị nhiễm bệnh nếu không có biện pháp chăm sóc và quản lý hệ thống nuôi Do đó cần áp dụng biện pháp phòng bệnh tích cực một cách đồng bộ Xác cá chết phải chôn và xử lý vôi bột để hạn chế sự lây lan của mầm bệnh Không dùng cơ quan nội tạng, máu, mỡ và các phụ phẩm nhà máy chế biến thuỷ sản làm thức ăn trở lại cho cá vì nếu gặp phải nguồn sản phẩm nhiễm khuẩn, mầm bệnh sẽ tồn tại lâu trong môi trường nước và phát tán vi khuẩn gây bệnh vào ao bè nuôi, lây sang nhiều khu vực nuôi cá khác gây ra đại dịch

1.1.2.6 Điều trị bệnh

Khi cá bị bệnh liệu pháp kháng sinh và chất hóa học là ưu tiên hàng đầu trong

điều trị Tuy nhiên, vi khuẩn E ictaluri có khả năng đề kháng với một số loại thuốc kháng sinh Oxytetracylin, Oxolinic axit, Sulphonamid; vi khuẩn E ictaluri còn kháng

lại: Bactrime (100%), Colistin (97,9%), Amoxicilin (40,4%), Tetracyclin (31,9%), Doxycyclin (27,7%) và thể hiện tính nhạy với các kháng sinh: Doxycyclin (63,8%), Amoxicilin (59,6%), Tetracyclin (48,9%), Florfenicol (27,7%), Colistin (2,1%) [46] Tuy nhiên, việc sử dụng thuốc kháng sinh làm cho các sản phẩm thủy sản sau đó thường không được ưa chuộng do sự tích lũy thuốc, hoá chất trong thịt, tạo chủng kháng thuốc và gây ô nhiễm môi trường nước

Tại Việt Nam, hiện nay các loại thuốc và hóa chất cấm sử dụng trong nuôi trồng thủy sản ngày càng tăng trong khi việc phòng và trị bệnh chủ yếu phụ thuộc vào các loại thuốc kháng sinh và hóa chất đã khiến cho việc xuất khẩu thuỷ sản gặp rất nhiều khó khăn Ví dụ cụ thể như việc cấm sử dụng chloramfenicol, flomequine và xanh malachite đã ảnh hưởng lớn cho nghề xuất khẩu cá tra và cá basa của Việt Nam trong năm 2005 và 2006 Mỹ là một trong những thị trường nhập khẩu cá tra và cá basa lớn của Việt Nam nhưng từ năm 2005 đã tăng thuế nhập khẩu đối với mặt hàng này vì thế Việt Nam cần phải tìm thị trường mới Tuy nhiên, việc tìm đầu ra cho các sản phẩm

của hai đối tượng trên là rất khó khăn do chưa kiểm soát được việc sử dụng các loại thuốc kháng sinh trong danh mục cấm sử dụng và tồn dư chất kháng sinh trong các sản phẩm đã chế biến

Hiện vẫn chưa có một loại vacxin nào được nghiên cứu và sử dụng trong khi thế

giới đang sử dụng chế phẩm Edwardsiella ictaluri bacterin (Escogen J) để điều trị bệnh

hoại tử gan tuỵ cho cá nheo Mỹ Tuy nhiên, hiệu lực của vacxin còn phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố như di truyền, kích thước cá, mùa vụ, nhiệt độ, chất lượng nước, phương pháp sử dụng và yếu tố dinh dưỡng, tình trạng sức khoẻ và tình trạng sử dụng kết hợp với một số loại thuốc khác Nghiên cứu của Wise và Shoemaker cho thấy việc sử dụng vacxin sống cải tiến cho cá ở giai đoạn 7 đến 31 ngày tuổi đã nâng tỉ lệ sống sót của cá lên từ 45,3 đến 79,5% [38] Điều này chỉ ra rằng việc dùng vacxin để phòng bệnh cho

cá cũng chỉ thu được hiệu quả thấp

Đứng trước khó khăn là chưa có vacxin phòng bệnh do vi khuẩn E ictaluri gây

ra cho đối tượng cá tra và cá basa ở Việt Nam một cách hiệu quả, thì việc chẩn đoán sớm đóng vai trò quan trọng để có phác đồ điều trị kháng sinh thích hợp, giảm thiểu

những thiệt hại về kinh tế cho người dân Theo các nghiên cứu gần đây vi khuẩn E ictaluri gây bệnh gan thận mủ ở cá tra rất nhạy cảm với thuốc kháng sinh florfenicol

Đây là loại thuốc kháng sinh mới được FDA cấp phép sử dụng để điều trị bệnh cá của nhiều quốc gia trên thế giới kể cả Mỹ, thị trường xuất khẩu cá tra lớn nhất của Việt Nam với tên thương mại là Aquaflor [109]

Florfenicol có công thức hóa học là C12H14Cl2FNO4S, là chất kháng sinh thế hệ mới nhất của fenicol và là dẫn xuất của chloramfenicol có tác dụng ức khuẩn nhưng cũng có tác dụng diệt khuẩn trong một số trường hợp bệnh truyền nhiễm với những điều kiện nhất định và nồng độ cao hơn Thuốc có tác dụng ức chế vi khuẩn ở nồng độ thấp, hoạt phổ rất rộng, tác dụng trên nhiều loài vi khuẩn Gram âm và Gram dương,

một số vi khuẩn ký sinh nội bào như Risketsia, Chlamydia, vi khuẩn kỵ khí như Clostridium spp Tác dụng kháng khuẩn của florfenicol là do khả năng liên kết với tiểu

đơn vị 50S của riboxom, ngăn cản sự hình thành liên kết peptit giữa các axit amin dẫn đến ức chế quá trình tổng hợp protein làm cho vi khuẩn này không còn khả năng phát triển [37].

Bệnh gan thận mủ thường gây thiệt hại nghiêm trọng ở giai đoạn cá tra giống và giai đoạn cá nhỡ từ 300 – 500 g, nếu không được phát hiện kịp thời ở giai đoạn mới xuất hiện bệnh thì việc điều trị sẽ không có hiệu quả và gây tổn thất lớn cho người dân Mặt khác do chưa có những hiểu biết đúng đắn nên việc sử dụng thuốc kháng sinh còn tùy tiện, không đúng về liều lượng và liệu trình điều trị, sử dụng thuốc kháng sinh liều thấp để phòng bệnh trước cho cá… Đây là những nguyên nhân chính dẫn đến hiệu quả điều trị của thuốc kháng sinh ngày càng giảm theo thời gian sử dụng Thêm vào đó, việc sử dụng thuốc không đúng liều lượng đã dẫn đến việc hình thành các chủng vi

khuẩn E ictaluri kháng thuốc và là trở ngại chính trong việc điều trị và khống chế tác

hại của bệnh

1.2 VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri

1.2.1 Đặc điểm sinh học

Edwardsiella là một trong những chi mới của họ Enterobacteriaceae được đặt

tên theo tên nhà bác học người Mỹ P.R Edwards (1901–1966) - người đầu tiên đã phân lập và phân loại được vi khuẩn này Chi Edwardsiella gồm 3 loài: Edwardsiella tarda, Edwardsiella ictaluri, Edwardsiella hoshinae trong đó E tarda và E ictaluri được xem là những đối tượng gây bệnh chủ yếu trên cá da trơn [46]

E ictaluri là loài có tên trong hệ thống phân loại muộn nhất Vi khuẩn này lần

đầu tiên được đặt tên bởi Hawke, 1981 khi ông phân lập được vi khuẩn từ cá nheo Mỹ

Ictalurus sp bị bệnh nhiễm trùng huyết [49] Các đặc điểm sinh hóa của loài này có sai khác với E tarda ở một số đặc tính như không sinh H2S, không sinh indol, di động ở

25oC và không di động ở 37oC Khác với E tarda có khả năng gây bệnh cả trên động vật và người thì vi khuẩn E ictaluri chỉ tìm thấy trên các loài động vật máu lạnh đặc

biệt là trong môi trường nước ngọt [46]

Các vi khuẩn thuộc chi Edwardsiella mang đặc điểm điển hình của vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae: Gram âm, hình que thẳng, nhỏ, kích thước 1×2-3 µm,

không hình thành bào tử và di động bằng tiên mao hoặc không di động Kích thước khuẩn lạc trên môi trường cơ sở sau 24 giờ nuôi cấy rất nhỏ (0,5-1 mm) [108]

Hình 1.3 Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri soi dưới kính hiển vi điện tử (A) và nhuộm Gram (B) [125]

Trong phòng thí nghiệm, nhiệt độ tối ưu cho tăng trưởng của E ictaluri khi nuôi

cấy trong ống nghiệm là từ 25 - 30oC và nhiệt độ môi trường thích hợp cho vi khuẩn bùng phát thành bệnh là khoảng 22 - 28oC phản ánh sự thích ứng của chúng trong vật

chủ biến nhiệt Trong khi đó E tarda và E hoshinae sinh trưởng và phát triển ở nhiệt

độ cao hơn, khoảng 37oC Một khác biệt nữa so với hai vi khuẩn còn lại là E ictaluri

sinh trưởng rất chậm trên môi trường thạch, thông thường sau 2-3 ngày nuôi cấy ở

300C mới tạo thành khuẩn lạc kích thước 1 mm Về mặt sinh hóa, E ictaluri cũng ít hoạt tính hơn so với các loài Edwardsiella khác E ictaluri có khả năng di động yếu

khi nuôi cấy tại 25 - 30oC và hoàn toàn không di động khi nuôi cấy ở nhiệt độ cao Khả năng di động này có thể thay đổi phụ thuộc vào các điều kiện sinh trưởng khác nhau [46, 108]

Vi khuẩn E ictaluri mang những đặc điểm điển hình của họ Enterobacteriaceae

như kị khí không bắt buộc, hoạt tính catalase dương tính, hoạt tính oxidase âm tính, lên men đường và nhiều loại carbohydrate khác do đó liên quan đến sản xuất axít và khí

Khác với E tarda, vi khuẩn E ictaluri không sinh H2S và không sinh indol Do hai loài này có hình dạng rất giống nhau và cùng là tác nhân gây bệnh trên cá tra nên sự khác nhau về các hoạt tính sinh hóa là đặc điểm quan trọng để phân biệt và xác định

được chính xác tác nhân gây trên cùng một vật chủ [82] E.ictaluri hầu như không có

khả năng sinh các enzym như lipase, protease, pectinase, collagenase, chitinase, hyaluronidase và hầu hết các enzym ngoại bào khác Tuy nhiên, đặc điểm sinh hóa điển

hình của E ictaluri là khả năng sinh enzym phân giải chondroitin – một thành phần

chính của sụn [108] Khả năng này liên quan trực tiếp tới việc truyền bệnh qua sọ của

cá đặc biệt đối với cá giống có tỷ lệ sụn cao Khả năng gây tan huyết cũng là một trong những hoạt tính quan trọng liên quan tới độc tính của vi khuẩn Do là loài ưa huyết nên

vi khuẩn gây bệnh thường chỉ phân lập được ở những cơ quan nhiều máu như gan, thận, tỳ tạng, rất hiếm khi phân lập được vi khuẩn từ mô não cá bệnh

Trước đây, hầu hết các nghiên cứu về Edwarsiella tập trung vào E tarda, ít có thông tin về các loài khác Theo Aoki và Holland, thành phần màng ngoài của E tarda

gồm một số protein với kích thước 27, 35 và 46 kDa và một số có protein có kích thước từ 52-56 kDa [22] Những nghiên cứu về lipopolysaccharide của ba loài thuộc

chi Edwarsiella chỉ ra rằng mỗi loài có thể được chia ra làm nhiều dạng khác nhau Một vài chủng của E tarda cần nicotinamide và các axit amin như cysteine,

methionine để sinh trưởng, các loài khác của chi có thể có các nhu cầu tương tự Các

loài thuộc chi Edwarsiella phát triển cần ít chất bổ sung vào hơn là các thành viên khác thuộc họ Enterobacteriaceae và hình thái khuẩn lạc đơn cũng nhỏ hơn sau khi được

nuôi cấy trên môi trường thạch trong vòng 24 giờ ở 37oC Ngược lại với hai loài

Edwardsiella còn lại, nhiệt độ tăng trưởng tối ưu của E ictaluri nằm trong khoảng

25-30oC và phát triển rất chậm khi nuôi trên đĩa thạch, thường từ 2-3 ngày ở 30oC tạo ra khuẩn lạc có đường kính 1 mm [46]

Vi khuẩn E tarda có thể gây ra sự bùng phát bệnh xuất huyết trong ao nuôi cá

chình [50] [107] hay bệnh thối rữa khí thũng ở cá da trơn và nhiễm trùng cơ hội ở

người [46] Nhiều nghiên cứu cho thấy E tarda cũng có thể là tác nhân gây ra bùng

phát ổ dịch trong hàng loạt các ao nuôi ở các nước như Mỹ, Nhật Bản, Châu Âu và một

số nước Châu Á Tuy nhiên, tỷ lệ cá nhiễm bệnh trong ao nuôi hiếm khi cao hơn 5%

nhưng có thể lên đến 50% trong trường hợp cá được nuôi trong bể [66] E tarda

thường được phân lập từ cá hồi và các loài cá khác ở Tây bắc Thái Bình Dương của

Mỹ và cũng được khẳng định là nguyên nhân gây bệnh trên cá hồi, cá bẹ và cá cầu vồng cũng như cá da trơn [110]

Vi khuẩn E hoshinae có thể phân lập được từ bò sát, chim và từ các nguồn nước Mặt dù có một số tài liệu công bố rằng phân lập được E hoshinae từ phân người

nhưng những người này không bị bệnh nên không có bằng chứng để khẳng định vi

khuẩn E hoshinae gây ra bệnh tiêu chảy cho người [48] Trong khi đó E ictaluri được

cho là tác nhân gây bệnh nhiễm trùng huyết cấp tính trên cá da trơn Từ công bố đầu tiên của Hawke và cs (1981), bệnh này đã trở thành một vấn đề rất trầm trọng của ngành nuôi cá da trơn trong vùng Đông nam nước Mỹ Shott và cs (1986) cho rằng

bệnh sinh của E ictaluri có thể được truyền thông qua nhiễm trùng đường tiêu hóa Viêm ruột gây nhiễm trùng máu do E ictaluri gây ra khi nhiệt độ môi trường từ 22-

28oC và tiến triển nhanh chóng, kết quả là tỷ lệ tử vong tăng lên đáng kể [94]

Vi khuẩn thuộc chi Edwardsiella có khả năng đề kháng với colistin và

polimycin B nhưng lại khá nhạy cảm với một số chất kháng sinh thông thường như penicillin G, ampicillin, carbenicillin, streptomycin, kanamycin, gentamicin, tetracycline, chloramfenicol, cephalosporins, sulfadiazine và nalidixic axit [46, 72, 88] Năm 1986 Waltman và cộng sự đã báo cáo về khả năng kháng mạnh các hợp chất của lưu huỳnh, streptomycin và methicillin bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch, tuy nhiên những khác biệt này cũng có thể là do sự khác biệt về nguồn phân lập vi khuẩn, đối tượng vật chủ và khu vực địa lý… [108]

Bảng 1.2 Các loài cá vật chủ mà vi khuẩn E tarda và E ictaluri gây bệnh [4]

Cá ký chủ

Vi khuẩn Tác giả Tên latinh Tên địa phương

Ictalurus punctata Cá trê sông E ictaluri Mayer, Bullock, 1973

Oncorhynchus ishawytscha Cá hồi nt Amandi, 1982

Paralichthys olivaceus Cá bon Nhật Bản nt Nakatsugawa, 1983

Anguila japonica Cá trình Nhật Bản nt Egusa, 1976

Micropterus salmoides Cá trình Nhật Bản nt White, 1973

Chryophrys major Cá vền đỏ biển nt Yasunaga, 1986

Morone saxatilis Cá vền đỏ biển nt Heman, Bullock, 1986

Oreochromis niloticus Cá rô phi vằn nt Miyashito, 1984

Pangasius hypophthalmus Cá tra nuôi nt Bùi Quang Tề, 2003

I nebulosus Trê sông nâu E ictaluri Hawke, 1976

Clarias batrachus Cá trê trắng nt Kasomchandra, 1987

Ictalurus catus Cá trê sông trắng nt Plumb, Sanchez, 1983

Pangasianodon hypophthalmus Cá tra nuôi nt Crumlish, 2001

Bùi Quang Tề, 2003

Silurus asotus Cá nheo nuôi Edwardsiella sp Bùi Quang Tề, 2005

Các nhà khoa học Mỹ đã phân lập được loài E tarda từ người, nhạy cảm với 22

loại thuốc kháng sinh khác nhau [31] Mặc dù cả 3 loài trong chi này đều có khả năng sinh β-lactamase nhưng lại đều nhạy cảm với thuốc kháng sinh nhóm β-lactam, đồng

thời cũng nhạy cảm với 2,4-diamino-6,7-diisopropyl pteridine (tác nhân diệt Vibrio O/129 của hãng Sigma) hơn là các vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceace khác [97]

1.2.2 Đặc điểm hệ gen

Genom của vi khuẩn E ictaluri là một nhiễm sắc thể đơn dạng vòng, có kích thước 3.812.315 bp [114] Nghiên cứu ADN chỉ ra rằng E ictaluri liên quan chặt chẽ nhất đến E tarda - một tác nhân gây bệnh thối rữa khí thũng trong cá da trơn và nhiễm trùng cơ hội trong người Trong genom của E ictaluri thì họ gen eip là họ gen đặc trưng chỉ có ở loài E ictaluri Họ gen này bao gồm 11 gen trong đó chỉ có 8 gen mã hóa cho protein Trong số đó có 3 gen lần lượt là eip18, eip19, eip20 mã hóa cho các

sản phẩm protein với khối lượng phân tử 18, 19 và 20 kDa là các kháng nguyên tạo đáp

ứng kháng thể ở cá nhiễm E ictaluri tự nhiên Do họ gen này mang tính đặc trưng cho

loài nên có thể sử dụng một trong số 3 gen này để phân loại đến loài bằng phương pháp sinh học phân tử [67]

Phân tích phát sinh loài dựa trên sự tương đồng của đoạn trình tự 16S-23S

rADN cho thấy mức độ tương đồng giữa E ictaluri và E tarda lên tới 96% [80] Việc

sử dụng các trình tự 16S rADN để nghiên cứu phát sinh loài và phân loại đã được sử dụng rất phổ biến từ trước đến nay Chúng tồn tại như một họ đa gen hoặc operon, chức năng của gen mã hóa cho 16S rARN không thay đổi theo thời gian cho thấy sự thay đổi thứ tự ngẫu nhiên là một thước đo chính xác trong quá trình tiến hóa Gen 16S rADN có kích thước khoảng 1500 bp là đủ lớn cho các mục đích thông thường dùng trong phân loại ở cấp độ phân tử

Plasmid có ở hầu hết các chủng Edwardsiella, bên cạnh đó còn có R-plasmid kháng kháng sinh Lobb và Rhoades (1987) chứng minh rằng các chủng E ictaluri

phân lập từ cá da trơn luôn luôn chứa 2 plasmid 5,7 và 4,9 kb, kí hiệu là pCL1 và pCL2 [44] Các nhà khoa học giả thiết rằng chức năng của các plasmid này là mã hóa cho các protein tạo ra tính độc hoặc có vai trò quan trọng trong vật chủ hoặc cả hai Chúng có thể lai ghép được với nhau vì vậy có thể sử dụng plasmid của chúng làm đầu dò axit nucleic để nhận biết sự tồn tại của vi khuẩn trong cá bệnh Năm 1993, Lobb và cs đã

phân lập được vi khuẩn E ictaluri từ cá kiếm xanh có khác biệt về mặt huyết thanh học