Nghiên cứu xác định một số chất tạo ngọt trong mẫu thực phẩm bằng phương pháp điện di mao quản sử dụng Detector đo độ dẫn không tiếp xúc

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --- NGUYỄN ĐỨC THẮNG NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH MỘT SỐ CHẤT TẠO NGỌT TRONG MẪU THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN SỬ DỤNG DETEC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

NGUYỄN ĐỨC THẮNG

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH MỘT SỐ CHẤT TẠO NGỌT TRONG MẪU THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN SỬ DỤNG DETECTOR ĐO ĐỘ DẪN KHÔNG TIẾP XÚC

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2014

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

NGUYỄN ĐỨC THẮNG

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH MỘT SỐ CHẤT TẠO NGỌT TRONG MẪU THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN SỬ DỤNG DETECTOR ĐO ĐỘ DẪN KHÔNG TIẾP XÚC

Chuyên ngành: Hóa phân tích

Mã số: 60440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

TS NGUYỄN THỊ ÁNH HƯỜNG

Hà Nội – 2014

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Thị Ánh Hường đã giao đề tài, nhiệt tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn GS Peter C Hauser, TS Mai Thanh Đức và ThS Bùi Duy Anh đã thiết kế lắp đặt và hỗ trợ các trang thiết bị cũng như tư vấn

kỹ thuật trong quá trình thực hiện nghiên cứu này

Tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy cô trong Bộ môn Hóa Phân tích nói riêng và trong khoa Hóa học nói chung đã dạy dỗ, chỉ bảo và động viên tôi trong thời gian học tập tại trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội

Tôi xin chân thành cảm ơn Nguyễn Thị Liên – sinh viên K56A khoa Hóa học đã đã phối hợp thực hiện nghiên cứu cùng với tôi

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn gia đình, các bạn học viên và sinh viên bộ môn Hóa phân tích đã giúp đỡ tôi trong thời gian học tập và nghiên cứu này

Hà Nội, tháng 12 năm 2014

Học viên

Nguyễn Đức Thắng

MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Chất phụ gia thực phẩm 3

1.1.1 Giới thiệu chung về phụ gia thực phẩm 3

1.1.2 Phân loại phụ gia thực phẩm 3

1.1.2.1 Phân loại theo chức năng 3

1.1.2.2 Phân loại dựa trên sức khỏe người tiêu dùng 4

1.1.3 Những nguy hại của phụ gia thực phẩm 5

1.2 Tổng quan về chất tạo ngọt 5

1.2.1 Phân loại chất tạo ngọt 6

1.2.2 Giới thiệu chung về các chất phân tích: Acesulfam kali, Aspartam, Cyclamat, Saccharin 7

1.2.2.1 Thông tin chung 7

1.2.2.2 Tính chất, ứng dụng và tác hại của Aspartam, Acesulfam kali, Cyclamat, Saccharin 8

1.2.3 Quy định về các chất tạo ngọt 10

1.2.4 Vấn đề sử dụng chất tạo ngọt trong thực phẩm hiện nay 11

1.3 Tổng quan các phương pháp phân tích 12

1.3.1 Phương pháp phổ hấp thụ phân tử UV-VIS 12

1.3.2 Phương pháp phổ hồng ngoại chuyển hóa fourier (FT-IR) 12

1.3.3 Phương pháp sắc ký lỏng (HPLC) 13

1.3.4 Phương pháp điện di mao quản (CE) 15

1.4 Phương pháp điện di mao quản 17

1.4.1 Cấu tạo của một hệ CE cơ bản 17

1.4.2 Các kỹ thuật bơm mẫu trong CE 19

1.4.3 Các đại lượng trong phương pháp điện di mao quản: độ điện di, tốc độ điện di

và thời gian diện di 20

1.4.4 Phương pháp điện di mao quản với detector đo độ dẫn không tiếp xúc (CE-C4D) 21

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 23

2.1 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu 23

2.1.1 Mục tiêu nghiên cứu 23

2.1.2 Nội dung nghiên cứu 23

2.2 Phương pháp nghiên cứu 23

2.2.1 Phương pháp xử lý mẫu sơ bộ 23

2.2.2 Phương pháp xử lý số liệu 24

2.3 Trang thiết bị và hóa chất 24

2.3.1 Các dụng cụ và thiết bị được sử dụng 24

2.3.2 Hóa chất 26

2.3.2.1 Chất chuẩn 26

2.3.2.2 Hóa chất dung môi 26

2.3.2.3 Chuẩn bị các dung dịch hóa chất 26

2.4 Phương pháp phân tích 27

2.5 Các thông số đánh giá độ tin cậy của phương pháp phân tích 27

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

3.1 Khảo sát điều kiện tối ưu phân tích đồng thời Acesulfam kali, Aspartam, Cyclamat, Saccharin bằng phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc kết nối kiểu tụ điện (CE-C4D) 29

3.1.1 Khảo sát thành phần và pH của dung dịch đệm điện di 29

3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của thế đặt vào hai đầu mao quản 34

3.1.3 Khảo sát lựa chọn thời gian bơm mẫu 36

3.2 Đánh giá phương pháp phân tích 38

3.2.1 Xây dựng đường chuẩn 38 3.2.2 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp 41

3.2.3 Đánh giá độ chụm (độ lặp lại) và độ đúng (độ thu hồi) 42

3.3 Phân tích mẫu thực thực tế 43

3.3.1 Mẫu nước giải khát 44

3.3.2 Mẫu nước chè đỗ đen 45

3.3.3 Mẫu nước mắm 46

3.3.4 Mẫu thạch 48

3.3.5 Kết quả phân tích đối chứng phương pháp CE-C4D với phương pháp HPLC49 KẾT LUẬN 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO 52

PHỤ LỤC 56

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Phân loại phụ gia thực phẩm theo chức năng 3

Bảng 1.2 Phân loại chất tạo ngọt 6

Bảng 1.2 Thông tin chung về bốn chất tạo ngọt được lựa chọn trong nghiên cứu 7

Bảng 3.1 Tỉ lệ thành phần đệm Tris/Ches và pH 30

Bảng 3.2 Tỉ lệ thành phần đệm Tis/ His và pH 31

Bảng 3.3 Tỉ lệ thành phần đệm Arg/Mes và pH 32

Bảng 3.4 Tỉ lệ thành phần đệm Arg/CAPS và pH 33

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát ảnh hưởng thế tách (E) đến thời gian di chuyển của các chất phân tích 35

Bảng 3.6 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian bơm mẫu đến diện tích pic (Spic) và thời gian di chuyển (tdc) của Acesulfam kali, Aspartam, Cyclamat, Saccharin 37

Bảng 3.7 Điều kiện tối ưu cho phân tích hỗn hợp Ace-K, Asp, Cyc, Sac bằng phương pháp điện di mao quản CE-C4D 38

Bảng 3.8 Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ Acesulfam kali, Aspartam, Cyclamat, Saccharin 39

Bảng 3.9 Phương trình đường chuẩn của Ace-K, Asp, Cyc, Sac 41

Bảng 3.10 Giới hạn phát hiện Ace-K, Asp, Cyc, Sac bằng phương pháp điện di mao quản CE-C4D 41

Bảng 3.11 Độ lặp lại và độ thu hồi trong mẫu thạch của Aspatam, Cyclamat, Saccharin, Acesulfam kali 43

Bảng 3.12 Thông tin về mẫu phân tích 44

Bảng 3.13 Kết quả xác định hàm lượng Acesulfam kali trong mẫu nước mắm

Ông Tây 47

Bảng 3.14 Kết quả xác định hàm lượng Aspartam và Acesulfam kali trong mẫu thạch 49

Bảng 3.15 Kết quả phân tích đối chứng với phương pháp HPLC 50

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Sơ đồ cấu tạo của một hệ thiết bị phân tích điện di mao quản 17

Hình 1.2 Mặt cắt ngang bề mặt mao quản 18

Hình 1.3 Lớp điện tích kép trên bề mặt mao quản 18

Hình 1.4 Các kĩ thuật bơm mẫu trong phương pháp điện di mao quản 20

Hình 1.5 Nguyên lý hoạt động của cảm biến đo độ dẫn không tiếp xúc 21

Hình 1.6 Sơ đồ biểu diễn cấu trúc (A) và mạch điện tương đương (B) của cảm biến đo độ dẫn không tiếp xúc 22

Hình 2.1 Ảnh chụp hệ thiết bị CE-C4D triển khai tại Việt Nam 24

Hình 2.2 Sơ đồ kết nối hệ thống C4D phiên bản bán tự động tại Việt Nam 25

Hình 3.1 Điện di đồ khảo sát ảnh hưởng của pH đối với sự phân tách Acesulfam kali, Aspartam, Cyclamat, Saccharin với thành phần đệm Tris/Ches 30

Hình 3.2 Điện di đồ khảo sát ảnh hưởng của pH đối với sự phân tách Acesulfam kali, Aspartam, Cyclamat, Saccharin với thành phần đệm Tris/His 31

Hình 3.3 Điện di đồ khảo sát ảnh hưởng của pH đối với sự phân tách Acesulfam kali, Aspartam, Cyclamat, Saccharin với thành phần đệm Agr/Mes 32

Hình 3.4 Điện di đồ khảo sát ảnh hưởng của pH đối với sự phân tách Acesulfam kali, Aspartam, Cyclamat, Saccharin với thành phần đệm Arg/CAPS 33

Kết quả cho thấy đối với thành phần đệm Arg/CAPS thì độ phân giải kém đồng thời đường nền không ổn định và kết quả phân tích tốt nhất là ở pH 9,2 33

Để có thể lựa chọn được hệ đệm tốt nhất, các kết quả phân tích ở pH = 9,2 của tất cả các hệ đệm khác nhau được trình bày trong trong hình 3.5 33

Hình 3.5 Điện di đồ so sánh các thành phần đệm điện di ở pH = 9,2 34

Hình 3.6 Điện di đồ khảo sát ảnh hưởng của điện thế tách đến thời gian di chuyển và sự phân tách các pic 3635

Hình 3.7 Điện di đồ khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian bơm mẫu đến sự phân tách Acesulfam kali, Aspartam, Cyclamat, Saccharin 37

Hình 3.8 Đường chuẩn của Acesulfam kali theo diện tích pic 40

Hình 3.9 Đường chuẩn của Aspartam theo diện tích pic 40

Hình 3.10 Đường chuẩn của Cyclamat theo diện tích pic 40

Hình 3.11 Đường chuẩn của Saccharin theo diện tích pic 40

Hình 3.12 Điện di đồ xác định Acesulfam kali trong mẫu nước giải khát 45

Hình 3.14 Điện di đồ xác định Acesulfam kali trong mẫu nước mắm (NM) bằng cách thêm chuẩn Acesulfam kali ở các nồng độ khác nhau (1: NM + 0 ppm Ace-K; 2: NM + 10,0ppm Ace-K; 3: NM + 20,0 ppm Ace-K; 4: NM + 30,0 ppm Ace-K) 47

Hình 3.15 Điện di đồ xác định Aspartam và Acesulfam kali trong mẫu thạch số 1 bằng phương pháp thêm chuẩn (1: Mẫu thạch số 1 không thêm chuẩn; 2: Mẫu thạch số 1 thêm 20,0ppm Asp và 20,0ppm Ace-K ) 48

Hình 3.16 Điện di đồ xác định Aspartam và Acesulfam kali trong mẫu thạch số 2 bằng phương pháp thêm chuẩn (1: Mẫu thạch số 2 không thêm chuẩn; 2: Mẫu thạch số 2 thêm 20,0ppm Asp và 20,0ppm Ace-K) 49

Formatted: Centered, Indent: Left: 0"

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Ace – K Acesulfam kali

CAPS axit 3-( cyclohexylamino)-1-propansunfonic

C4D Detectơ độ dẫn không tiếp xúc kết nối kiểu tụ điện

CE Phương pháp điện di mao quản

Ches axit 2 – (cyclohexylamino)-ethanesunfonic

EOF Dòng điện di thẩm thấu

HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Leff Chiều dài hiệu dụng của mao quản

Ltot Tổng chiều dài mao quản

MEKC Điện di mao quản điện động học Mixen

Mes Axit 2-morpholino ethanesunfonic

PGTP Phụ gia thực phẩm

%RSD % độ lệch chuẩn tương đối

Tris (hydroxymethyl) aminomethane

UPLC Sắc ký lỏng siêu hiệu năng

MỞ ĐẦU

Cùng với sự phát triển của xã hội, đời sống của con người ngày càng được

nâng cao nhu cầu về vật chất của con người cũng ngày càng cao và đòi hỏi sự

phong phú và đang dạng sản phẩm, trong đó có nhu cầu về các sản phẩm thực

phẩm Đây là các sản phẩm được sử dụng thường xuyên và có ảnh hưởng trực tiếp

đến sức khỏe của con người Tuy nhiên, gần đây đã xảy ra liên tiếp nhiều vụ ngộ

độc thực phẩm ở nhiều nơi của Việt Nam, gây hoang mang cho người tiêu dùng

Trong quá trình sản xuất ra sản phẩm đáp ứng nhu cầu đa dạng của người tiêu dùng

thì các nhà sản xuất đã sử dụng nhiều loại phụ gia thực phẩm khác nhau, mà các

loại phụ gia này có thể ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng nếu không thực

hiện đúng quy định trong sử dụng

Một trong số những loại phụ gia thực phẩm được sử dụng phổ biến hiện nay

là chất tạo ngọt Chất tạo ngọt là một trong những loại phụ gia thực phẩm được sử

dụng khá phổ biến để tạo vị ngọt, tăng tính hấp dẫn cho sản phẩm Một số chất tạo

ngọt được dùng ở Việt Nam như: Acesulfam kali, Aspartam, Cyclamat, Saccharin

Các chất này không cung cấp dinh dưỡng cho cơ thể và nếu được sử dụng ở hàm

lượng vượt quá quy định có thể gây ảnh hưởng xấu đến sức khỏe Đặc biệt, trong đó

Saccharin là chất được khuyến cáo sử dụng đối với phụ nữ có thai vì nó có thể đi

qua hàng rào nhau thai, mặc dù ảnh hưởng của nó đến thai nhi thì chưa được khẳng

định Việc xác định hàm lượng của chúng trong thực phẩm đã được thực hiện bằng

nhiều phương pháp khác nhau như: Sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC), phổ hấp thụ

phân tử UV-VIS Cùng với các phương pháp trên, điện di mao quản cũng là một

phương pháp được ứng dụng khá rộng rãi, đặc biệt, phương pháp điện di mao quản

tích hợp detetor đo độ dẫn không tiếp xúc (CE-C4D) với trang thiết bị nhỏ gọn, có

thể tự động hóa và triển khai tại hiện trường, lượng mẫu và hóa chất sử dụng ít với

chi phí thấp, cho thấy tiềm năng phát triển phù hợp với nhu cầu và điều kiện thực tế

tại Việt Nam Do đó, chúng tôi đã lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu xác định một số

chất tạo ngọt trong mẫu thực phẩm bằng phương pháp điện di mao quản sử

Formatted: Line spacing: Multiple 1.55 li

Formatted: Space After: 0 pt, Line spacing: Multiple 1.55 li

dụng detector đo độ dẫn không tiếp xúc” Hy vọng sẽ đóng góp một phần nhỏ bé

vào việc nghiên cứu, phát triển phương pháp xác định đồng thời các chất tạo ngọt nói riêng và trong lĩnh vực vệ sinh an toàn thực phẩm nói chung

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Chất phụ gia thực phẩm

1.1.1 Giới thiệu chung về phụ gia thực phẩm

Theo Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc (FAO): Phụ gia

là chất không dinh dưỡng được thêm vào các sản phẩm với các ý định khác nhau

Thông thường các chất này có hàm lượng thấp dùng để cải thiện tính chất cảm

quan, cấu trúc, mùi vị cũng như bảo quản sản phẩm

Theo Ủy ban Tiêu chuẩn hóa thực phẩm quốc tế (Codex): Phụ gia thực phẩm

(PGTP) (food additives) là: “một chất, có hay không có giá trị dinh dưỡng, mà bản

thân nó không được tiêu thụ thông thường như một thực phẩm và cũng không được

sử dụng như một thành phần của thực phẩm, việc bổ sung chúng vào thực phẩm

nhằm đáp ứng yêu cầu công nghệ trong sản xuất, chế biến, đóng gói, bảo quản, vận

chuyển thực phẩm nhằm cải thiện kết cấu hoặc đặc tính kĩ thuật của thực phẩm đó

PGTP không bao gồm các chất ô nhiễm hoặc các chất được bổ sung vào thực phẩm

nhằm duy trì hay cải thiện thành phần dinh dưỡng của thực phẩm” Như vậy, PGTP

không phải là thực phẩm mà nó được thêm vào nhằm đáp ứng yêu cầu nhất định của

sản phẩm Việc sử dụng PGTP phải tuân theo quy định hiện hành của các cơ quan

chức năng, ở đây là Bộ Y tế

1.1.2 Phân loại phụ gia thực phẩm

1.1.2.1 Phân loại theo chức năng

Tùy thuộc vào chức năng mà PGTP được chia thành nhiều loại khác nhau

Thông tin của một số loại phụ gia thực phẩm được thể hiện trong bảng 1.1

Bảng 1.1 Phân loại phụ gia thực phẩm theo chức năng

STT Tên nhóm Chức năng công nghệ Tên nhóm phụ

1 Chất điều chỉnh độ chua

(acidity regulator)

Làm thay đổi hoặc kiểm soát độ acid hoặc kiềm của thực phẩm

Acid, kiềm, chất đệm, chất điều chỉnh độ pH

Formatted Table

2 Acid Làm tăng độ axit và tạo

vị chua với thực phẩm

Chất điều hòa độ chua

3 Chất tạo màu (colour) Bổ sung hoặc khôi phục

màu của một thực phẩm Chất tạo màu

Chất cố định màu, chất ổn định màu

6 Chất tăng hương vị

(flavour anhancer)

Làm tăng hoặc khơi dậy hương vị có trong thực phẩm

Chất giữ nước/ẩm, chất làm ẩm

8 Chất bảo quản

(preservative)

Kéo dài thời gian sử dụng của thực phẩm bằng cách chống lại sự

hư hỏng do vi sinh vật gây ra

Chất chống khuẩn, chống nấm, chất kiểm soát vi sinh vật, chất khử trùng

9 Chất ổn định (stabilizer)

Tạo khả năng duy trì sự phân tán đồng nhất của hai hoặc nhiều chất không trộn lẫn được trong thực phẩm

Chất kết dính, chất làm cứng, chất giữ nước/ ẩm, chất ổn định

1.1.2.2 Phân loại dựa trên sức khỏe người tiêu dùng

 Loại “liều lượng sử dụng hàng ngày không hạn chế” được qui định đối với

các chất mà tính độc hại đã được điều tra nghiên cứu một cách thích đáng, hoặc các tính chất sinh hóa và các giai đoạn chuyển hóa đã được biết một cách tường tận

 Loại “liều lượng sử dụng hàng ngày có điều kiện” được qui định cho một số hóa chất cần thiết để chế biến một số thực phẩm đặc biệt

 Loại “liều lượng dụng hàng ngày tạm thời” được qui định đối với các chất

mà tính chất độc hại chưa được chứng minh chắc chắn, với điều kiện các kết quả nghiên cứu phải được công bố trong một thời gian nhất định Nếu đến thời hạn mà các kết quả nghiên cứu không được trình bày rõ ràng, thì sẽ đình chỉ việc sử dụng các hóa chất này

1.1.3 Những nguy hại của phụ gia thực phẩm

Bên cạnh tác dụng cụ thể đối với sản phẩm thực phẩm, PGTP có những ảnh hưởng không tốt đối với người và súc vật ở một liều nhất định và với liều lượng cao hơn, ngay cả đối với những hóa chất được coi là không độc, chúng cũng gây ra những hậu quả đáng ngại với những triệu chứng không đặc hiệu như cản trở cơ học đường tiêu hóa dạ dày, ruột, thay đổi áp lực thẩm thấu và mất cân bằng dinh dưỡng [7]

Nếu sử dụng phụ gia thực phẩm không đúng liều lượng, chủng loại nhất là những phụ gia không cho phép dùng trong thực phẩm sẽ gây những tác hại cho sức khỏe, cụ thể:

- Gây ngộ độc cấp tính: nếu dùng quá liều cho phép

- Gây ngộ độc mãn tính: dù dùng liều lượng nhỏ, thường xuyên, liên tục, một

số chất phụ gia thực phẩm tích lũy trong cơ thể, gây tổn thương lâu dài

Một số PGTP thường dùng: màu thực phẩm, chất tạo ngọt, chất bảo quản, điều

vị, chất độn, chất tạo xốp, hương liệu…Vì vậy cần kiểm soát chặt chẽ hàm lượng và cách sử dụng của các PGTP trong sản phẩm thực phẩm

1.2 Tổng quan về chất tạo ngọt

Chất tạo ngọt là PGTP, được sử dụng khá phổ biến trong công nghệ chế biến

và thực phẩm Chất tạo ngọt có nhiều loại ứng với các cấu trúc và tính chất hóa học khác nhau

Đến nay, các nhà khoa học đã tìm thấy hàng trăm chất hóa học có khả năng

tạo vị ngọt Chúng được chiết tách từ thực vật hoặc được sản xuất bằng phương pháp tổng hợp Tuy nhiên, chỉ có một số được phép sử dụng trong công nghệ thực phẩm Tùy vào quy định của mỗi quốc gia, mà danh mục chất tạo ngọt cho phép sử dụng có thể khác nhau

1.2.1 Phân loại chất tạo ngọt

Có thể phân loại các chất tạo ngọt thành hai nhóm chính : Nhóm có giá trị dinh dưỡng và không có giá trị dinh dưỡng

Bảng 1.2 Phân loại chất tạo ngọt

Thông thường, chất lượng chất tạo ngọt được đánh giá trên cơ sở các tiêu chí sau:

 Vị ngọt: được đánh giá trên cơ sở sử dụng vị ngọt của Saccharose làm

chuẩn

 Ngưỡng phát hiện: là nồng độ thấp nhất của dung dịch chất tạo ngọt để

người sử dụng có thể cảm nhận và phát hiện được vị ngọt

 Độ ngọt tương đối : là độ ngọt được so sánh với độ ngọt của chất chuẩn

saccharose Việc xác định độ ngọt tương đối được thực hiện bằng cách so sánh tỉ lệ

-Glucose

-Fructose

-Glactose

-Saccharose -Mantose -Lactose

-Đường nghịch đảo Syrup thủy phân từ tinh bột -Mật ong

-Xylitol -Sorbitol -Mannitol -Maltitol -Lactiol

Hỗn hợp

-Glucose -Syrup được halogen hóa -Isomalt

-Glycyrrhy – zin -Stevioside -Thaumatin -Monelin -Miracullin

-Saccharin -Aspartam -Acesulfam Kali -Cyclamat -Sucralose -Dulcine

dưỡng Chất tạo ngọt

nồng độ của chất tạo ngọ cần tính với chất chuẩn sao cho vị ngọt của hai dung dịch

là tương đương Khi xác định độ ngọt tương đối người ta thường sử dụng dung dịch chuẩn saccharose 2,5% hoặc 10%

1.2.2 Giới thiệu chung về các chất phân tích: Acesulfam kali, Aspartam, Cyclamat, Saccharin

1.2.2.1 Thông tin chung

Bốn chất tạo ngọt được lựa chọn là bốn chất tạo ngọt tổng hợp không sinh năng lượng Các chất tạo ngọt này thường được sử dụng để tạo vị ngọt trong thực phẩm hoặc thay thế đường trong các sản phẩm ăn kiêng Các thông tin chung về bốn chất tạo ngọt được lựa chọn trong nghiên cứu này trình bày trong bảng 1.2 [1,

dioxo-olate

Aspartyl)-L-phenylalanine, 1-methyl este

(L-α-yclohexylsulfamate (dạng muối natri)

N-Sodium 3H-1,2-benzothiazol-2-ide 1,1-dioxide

1.2.2.2 Tính chất, ứng dụng và tác hại của Aspartam, Acesulfam kali, Cyclamat,

Saccharin

 Tính chất

Aspartam ngọt hơn saccharose khoảng 200 lần [9], vị ngọt của nó kéo dài

hơn và cảm nhận chậm hơn so với đường, không để lại dư vị khó chịu Aspartam là

một dipeptide, giống như các dipeptide khác, Aspartam có chứa năng lượng khoảng

4kcal/g (17kJ/g) Tuy nhiên, chỉ cần một lượng rất nhỏ Aspartam đã tạo ra độ ngọt

cần thiết Aspartam được trộn với Saccharin hoặc Acesulfam kali cho hỗn hợp ngọt

hơn và ổn định hơn khi 2 chất đứng riêng

Cyclamat (dạng muối natri) có độ ngọt lớn hơn gấp 35 lần độ ngọt của

saccharose [9] Là chất bột tinh thể màu trắng, không mùi, hầu như không hòa tan

trong rượu, ete nhưng tan rất tốt trong nước Ở 25oC có thể thu được dung dịch

Natri cyclamat 21%, dung dịch này hầu như trung tính Bền nhiệt, nó có thể chịu

nhiệt độ cao lên đến 500 mà vẫn không bị biến tính, bền với axit và kiềm Các tính

chất của Cyclamat rất ổn định trong khoảng pH rộng (2,0-8,0)

Saccharin có vị ngọt gấp 450 lần Saccharose [9] và có vị chát, khi bị thủy

phân bởi nhiệt độ và axit, giải phóng phenol làm thức ăn có mùi khó chịu Không

phản ứng hóa học với các chất khác có trong thành phần thực phẩm Ổn định trong

môi trường axit nhưng không bền khi bị đun nóng

Acesulfam kali dễ tan trong nước đặc biệt trong nước nóng, ở 100oC có thể

hòa tan1300 g/1 lít nước Vị ngọt gấp 200 lần đường saccharose [9] và có dư vị hơi

đắng đặc biệt là ở nồng độ cao Ổn định ở nhiệt độ cao và môi trường axit, hầu như

không bị biến đổi tính chất vật lí và hóa học trong thời gian dài [7]

 Ứng dụng

Aspartam được sử dụng thay thế đường trong thực phẩm ăn kiêng Nó được

sử dụng rộng rãi trên thế giới với sự hiện diện trong hơn 6000 sản phẩm như: bánh,

nước giải khát, kẹo và cả trong dược phẩm Aspartam được cho phép tại hơn 90

quốc gia để sử dụng trong nhiều loại thực phẩm [9]

Formatted: Line spacing: Multiple 1.55 li

Cylamat Có thể sử dụng phối hợp với gelatin, tinh bột, anginit natri hoặc

phối hợp với các chất ngọt khác như đường Saccharin, Sacchrose để tạo vị ngọt,

che đi các vị khó chịu cho thực phẩm Cyclamat dễ quyện mùi với các hoa quả và

nhiều khi còn làm tăng vị tự nhiên của hoa quả Có thể được dùng cho người bị

đái đường và là một chất ngọt tốt để sản xuất các sản phẩm thực phẩm có độ calo

thấp Có khoảng 55 nước trên thế giới sử dụng chất này trong thực phẩm

Cyclamat được phép sử dụng ở một số quốc gia nhưng ở Mỹ nó bị cấm do nghi ngờ

bị nhiễm độc [9]

Saccharin được sử dụng để tạo vị ngọt trong thức ăn, đồ uống, kem đánh

răng, nước súc miệng Nó thường được sử dụng ở nồng độ 0,02-0,5% (về khối

lượng) Saccharin thường được dùng chung với Aspartam trong nước giải khát

dành cho những người ăn kiêng Saccharin thường được dùng ở dạng muối Natri

và muối Canxi cũng được sử dụng đặc biệt là dành cho những người hạn chế hấp

thụ Natri Saccharin được cho phép sử dụng trong thục phẩm và đồ uống ở ít nhất

90 quốc gia [9]

Acesulfam kali có tính bền nhiệt nên acesulfam kali được sử dụng trong các

sản phẩn nướng hoặc các sản phẩm có thời hạn sử dụng lâu Có thể được sử dụng

riêng rẽ hoặc trộn với các đường hóa học khác Thích hợp với các sản phẩm cần gia

công ở nhiệt độ cao Acesulfam kali được chấp thuận sử dụng trong thực phẩm và

đồ uống ở khoảng 90 quốc gia [9]

 Tính độc hại

Aspartam chuyển hóa thành axit aspartic (40%) trong cơ thể, phenylalanine

(50%) và methanol (10%) Chất methanol sau đó tiếp tục chuyển thành

formaldehyde Các thử nghiệm trước đây của Viện Ramazzini cho thấy cả methanol

và formaldehyde đều dễ gây bệnh bạch cầu và u lymphô Điều này khiến các nhà

khoa học cần nghiên cứu gấp khả năng gây ung thư của cả methanol, axit aspartic

và phenylalanine Tuy nhiên, trong đánh giá khoa học mới nhất tại Parma, Italy, cơ

quan An toàn thực phẩm châu Âu (EFSA) cho biết họ không thấy bằng chứng về

mối lo ngại cho sự an toàn của Aspartam tại châu Âu Vì vậy, EFSA vừa mới đưa

Formatted: Expanded by 0.1 pt

Formatted: Expanded by 0.1 pt

ra kết luận (ngày 10/12/2013) rằng Aspartam không có nguy cơ gây thiệt hại cho các gen và ung thư

Cyclamat là một muối không cho năng lượng Không làm hại đến các men tiêu hóa như diastaza, pepsin, lipaza

Saccharin được xem như một phát hiện quan trọng, đặc biệt đối với những bệnh nhân tiểu đường Saccharin đi trực tiếp qua hệ tiêu hóa mà không bị hấp thụ, nhưng saccharin lại có thể gây ra sự giải phóng insulin ở người và động vật Nó không cung cấp năng lượng cho cơ thể nên được xếp vào nhóm chất tạo ngọt không sinh năng lượng Tuy nhiên cục quản lí thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) khuyến cáo phụ nữ có thai tránh không sử dụng loại đường năng lượng thấp này do

nó có thể qua hàng rào nhau thai và những ảnh hưởng của nó trên thai nhi thì chưa được khẳng định

Acesulfam kali không độc, không gây các phản ứng xấu và âm tính với cơ thể Là chất tạo ngọt không sinh năng lượng, không chuyển hóa trong cơ thể, không nhận thấy ảnh hưởng xấu đối với người mắc bệnh tiểu đường

Theo quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về chất ngọt tổng hợp, lượng ăn vào hàng ngày chấp nhận được (chỉ số ADI) với Acesulfam kali, Saccharin lần lượt là: 0 - 15 mg/kg thể trọng, 0 - 5 mg/kg thể trọng [2], Aspatam được Ủy ban chuyên gia quốc

tế về phụ gia thực phẩm khuyến cáo ở mức 0 - 40 mg/kg thể trọng, của Cyclamat là

0 - 11 mg/kg thể trọng

1.2.3 Quy định về các chất tạo ngọt

Trên thế giới bốn chất tạo ngọt được lựa chọn trong nghiên cứu này cũng được cho phép sử dụng ở nhiều quốc gia, với hàm lượng trong thực phẩm được quy định chặt chẽ

Ở Việt Nam, Bộ Y tế đã ban hành quy định mức giới hạn tối đa đối với các PGTP trong từng sản phẩm cụ thể, trong đó bao gồm cả bốn chất tạo ngọt[1]: Acesulfam kali, Aspartam, Cyclamat, Saccharin Theo đó, hàm lượng tối đa Acesulfam kali từ trong 69 nhóm thực phẩm 110 – 5000 mg/kg sản phẩm, của Aspartam trong 73 nhóm thực phẩm từ 200 – 6000 mg/kg sản phẩm, của Cyclamat

trong 36 nhóm thực phẩm từ 250-3000 mg/kg sản phẩm, của Saccharin trong 67 nhóm thực phẩm từ 80 – 2500 mg/kg sản phẩm

1.2.4 Vấn đề sử dụng chất tạo ngọt trong thực phẩm hiện nay

PGTP nói chung và chất tạo ngọt nói riêng được sử dụng trong rất nhiều loại thực phẩm nhằm hoàn thiện và tăng tính hấp dẫn của sản phẩm Trong đó, Các chất tạo ngọt nhân tạo phổ biến bao gồm Acesulfam kali, Aspartam, Sodium Cyclamat

và Saccharin đều được phép sử dụng tại nhiều quốc gia trên thế giới Các chất này được quy định như PGTP theo Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa kỳ và cần phải được phê chuẩn về sự an toàn trước khi đưa ra thị trường Acesulfam kali

và Aspartam cũng được phép sử dụng tại Anh Tuy nhiên, các sản phẩm có sử dụng chất này phải thực hiện yêu cầu ghi nhãn đặc biệt

Ở Việt Nam, do giá thành lại rẻ và độ ngọt cao nên các chất tạo ngọt Acesulfam kali, Aspartam, Cyclamat và Saccharin được bán nhiều tại các chợ đầu mối và các chợ nhỏ Chúng được sử dụng nhiều trong các sản phẩm đóng chai, đóng hộp có thông tin về các chất tạo ngọt được ghi trên nhãn, ngoài ra chúng còn được sử dụng tại nhiều hàng quán vỉa hè, tiểu thương vẫn dùng loại đường hóa học này để chế biến thức ăn, nấu chè, luộc bắp hay ngâm trái cây để tăng vị ngọt và không được kiểm soát chặt chẽ

Đoàn kiểm tra trung tâm y tế dự phòng quận Ninh Kiều (Cần Thơ – năm 2011) đã phát hiện cơ sở rang cà phê Thái Dương (phường An Bình, Ninh Kiều) dùng đường Cyclamat trong chế biến cà phê Cơ sở này đã bị phạt hành chính 12,5 triệu đồng về hành vi sử dụng phụ gia trái quy định Chủ cơ sở thừa nhận đã sử dụng loại đường này để chế biến cà phê với tỷ lệ 1kg Cyclamat trên 600 kg cà phê Ông Trương Văn Xa, Phó Chi cục trưởng Chi cục Quản lý chất lượng nông lâm sản và thủy sản - Sở Nông nghiệp và Phát triển nông thôn tỉnh Ninh Thuận cho biết: Chi cục đã tiến hành thanh, kiểm tra 139 cơ sở chế biến nước mắm trên địa bàn tỉnh ngày 14/3/2013, qua đó đã phát hiện 8 cơ sở chế biến nước mắm vi phạm do sử dụng Cyclamat để pha chế tạo vị ngọt, vị ngon cho mắm Đoàn kiểm tra đã xử phạt

vi phạm hành chính, đồng thời tịch thu 124 thùng nước mắm (gần 400 lít) của 8 cơ

sở này đưa đi tiêu hủy

Như vậy, các chất tạo ngọt được sử dụng khá rộng rãi tại Việt Nam, tuy nhiên các cơ quan chức năng cần quản lí chặt chẽ hơn trong quá trình sử dụng chúng để đảm bảo an toàn cho sức khỏe người tiêu dùng

1.3 Tổng quan các phương pháp phân tích

Các chất tạo ngọt hiện nay thường được xác định bằng nhiều phương pháp khác nhau như: Sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC), phương pháp phổ hồng ngoại chuyển hóa (FT-IR), điện di mao quản (CE), phổ hấp thụ phân tử UV-VIS, sau đây là một số phương pháp đã được sử dụng để phân tích chất tạo ngọt

1.3.1 Phương pháp phổ hấp thụ phân tử UV-VIS

Phương pháp này dựa trên phép đo độ hấp thụ quang khi chiếu chùm ánh sáng đi qua dung dịch chứa chất phân tích

 Nghiên cứu xác định đồng thời 3 chất ngọt nhân tạo (Aspartam, Acesulfam kali và Saccharin) trong đồ uống đã được các tác giả [15] thực hiện bằng phương pháp PLS-UV đã thu được kết quả: Khoảng tuyến tính được khảo sát của Aspartam từ 7-9 µg/mL, Acesulfam kali từ 1-3 µg/mL, Saccharin từ 2-4 µg/mL Bằng cách sử dụng dung dịch chiết n- butanol và phổ hấp thụ trong khoảng bước sóng từ 190-300 nm Các dung dịch chuẩn của Aspartam, Acesulfam kali và Saccharin ở ba mức nồng độ và đo mẫu với dung dịch H3PO4 0,1 N

 Phương pháp UV-VIS được các tác giả [20] sử dụng để xác định Saccharin và Acesulfam kali trong các chất làm ngọt và bột trái cây Phương pháp

sử dụng đệm gồm KCl 0,2 M và HCl 0,2 M, pH =1,3 Bước sóng được phát hiện của Saccharin và Acesulfam kali lần lượt 206 nm và 226 nm Độ thu hồi đối với cả hai chất phân tích trên nền mẫu thực trong khoảng 93,5÷105,1%, độ lệch chuẩn tương đối (RSD) <5%

1.3.2 Phương pháp phổ hồng ngoại chuyển hóa fourier (FT-IR)

Phương pháp này được các tác giả Armenta S, Garrigues S, de la Guardia [12] sử dụng để xác định Aspartam, Acesulfam kali trong nước ngọt Kết quả thu

được là: giá trị LOD của phương pháp đối với Aspartam là 0,1 % về khối lượng và với Acesulfam kali 0,9% về khối lượng Thời gian phân tích là 7 phút (thời gian phân tích sẽ giảm xuống còn 5 phút khi trong mẫu chỉ có Aspartam)

1.3.3 Phương pháp sắc ký lỏng (HPLC)

Sắc ký lỏng là quá trình xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn và pha động là chất lỏng (sắc ký lỏng - rắn) Mẫu phân tích được chuyển lên cột tách dưới dạng dung dịch Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất phân tích được phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất lý hóa của các chất khác nhau nên khả năng tương tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau Do vậy, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách

ra khỏi nhau [5] Đã có rất nhiều công trình nghiên cứu của các tác giả khác nhau sử dụng phương pháp này, có thể kể đến như:

 Phương pháp HPLC – ELSD đã được các tác giả Andrej Wasik and Manuela Buchgraber [11] sử dụng để xác định đồng thời chín chất tạo ngọt trong nước giải khát: Acesulfam kali, Alitame, Aspartam, Cyclamic axit, Dulcin, Neotame, Neohesperidine dihydrochalcone, Saccharin và Sucralose, có sử dụng cột chiết pha rắn Kết quả là độ thu hồi của các chất tạo ngọt trong khoảng từ 93 – 109%

 Phương pháp HPLC sử dụng detector diode Array (DAD) đã xác định Sự

có mặt của các chất tạo ngọt: Aspartam, Acesulfam kali, Sodium Saccharin, và Sodium Cyclamat trong nước giải khát và các thực phẩm dinh dưỡng [17]

Phương pháp thứ nhất tách Aspartam, Acesulfam kali và Sodium Saccharin trên cột C18 (15cm × 4.6mm, 5µm) với chế độ đẳng dòng, pha động gồm 15% acetonitrile, 75% đệm photphat (0,0125 mol.L-1 KH2PO4 ở pH 3,5) Tổng thời gian chạy là 5 phút với lượng mẫu bơm vào là 10µL

Phương pháp thứ hai được sử dụng để tách Sodium Cyclamat trên cột C18 sử dụng pha động gồm 85% methanol, 15% nước (isocratic) Lượng mẫu bơm là 10µL

và quá trình sắc kí hoàn thành trong 4 phút

Cả hai phương pháp này đều được áp dụng thành công cho mẫu thực là nước

ngọt và các sản phẩm dinh dưỡng đặc biệt Giới hạn định lượng (LOQ) của phương

pháp với Acesulfam kali là 0,3 mg/L, Aspartam là 0,5mg/L, Sodium Cyclamat là

0,5 mg/L, Sodium Saccharin là 0,4 mg/L Phương pháp có độ chính xác khá tốt với

hiệu suất thu hồi từ 96,2÷100,6%, RSD ≤ 0,3%

 Trong một nghiên cứu khác, các tác giả đã sử dụng phương pháp HPLC

với detector quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS để xác định Aspartam, Acesulfam

kali, Saccharin trong nước ngọt Giới hạn định lượng của phương pháp với

Acesulfam kali là 2,0 mg/L, với Aspartam là 8,0 mg/L, với Saccharin là 0,4 mg/L

Hiệu suất thu hồi nằm trong khoảng 90÷110%, RSD < 5,0%

 Trong nghiên cứu xác định đồng thời 4 chất tạo ngọt tổng hợp: Aspartam,

Sodium Cyclamat, Acesulfam kali and Sodium Saccharin trong thức ăn và nước giải

khát được thực hiện bằng phương pháp sắc kí trao đổi ion, sử dụng chất rửa giải là

KOH các tác giả Zhu Y, Guo Y, Ye M, James FS (2005)[25] đã thu được kết quả:

Giới hạn phát hiện (LOD) của Aspartam là 0,87 ppm ; Sodium Cyclamat là 0,032

ppm ; Acesulfam kali 0,019 ppm và Sodium Saccharin là 0,045 ppm

 Trong nghiên cứu sử dụng phương pháp HPLC/ESI-MS cũng được các tác

giả Yang DJ, Chen B [23] sử dụng để xác định đồng thời 8 chất tạo ngọt bao gồm: 7

chất tạo ngọt tổng hợp (Aspartam, Saccharin, Acesulfam kali, Neotame, Sucralose,

Cyclamat, Alitamea) và một chất tạo ngọt có nguồn gốc tự nhiên (Stevioside) Các

chất cần xác định đã được định lượng bằng cách sử dụng một bộ phận ghi nhận phát

hiện các mảnh có ion hóa chọn lọc ở m/z 178; 397; 377; 293; 641; 312; 162 và 182

với Cyclamat, Sucralose, Neotame, Aspartam, Stevioside, Alitame, Acesulfam kali

và Saccharin, chất chuẩn nội là Sodium warfain Giới hạn phát hiện (LODs) thấp

hơn 0,1 µg/mL, giới hạn định lượng thấp hơn 0,3 µg/mL

 Phương pháp HPLC cũng được các tác giả Chigusa KOBAYASHI;

Mitsuo NAKAZATO; Hirofumi USHIYAMA; Yuka KAWAI; Yukinari

TATEISHI; Kazuo YASUDA [13] sử dụng để xác định đồng thời 5 chất tạo ngọt:

Alitame (AL), Acesulfam kali (Ace-K), Saccharin (Sac), Aspartam (Asp) và Dulcin

(DU) trong rất nhiều loại thực phẩm khác nhau Độ thu hồi của các chất tạo ngọt

Formatted: Line spacing: Multiple 1.52 li

trong mẫu thức ăn trong khoảng 77 ÷ 102%, giới hạn phát hiện là 10 ppm Với

Tetra n-butylammonium bromide và đệm photphat pH 5,0 được thêm vào dung dịch

hỗn hợp, sau đó cho chảy qua cột C18 và được rửa bằng nước và hỗn hợp methanol – nước (45:55) Các chất tạo ngọt này được tách trên cột ODS-2 với pha động là

methanol – nước (1:3), bao gồm 0,01 mol/L tetra-n-propylammonium hydroxide

được điều chỉnh đến pH 3,5 với axit photphoric và được phát hiện ở bước sóng 210nm

1.3.4 Phương pháp điện di mao quản (CE)

Điện di mao quản là một kỹ thuật tách chất phân tích là các ion hoặc các chất không ion nhưng có mối liên hệ chặt chẽ với các ion trong một ống mao quản hẹp chứa đầy dung dịch đệm, đặt trong điện trường; do độ linh động điện di của các ion khác nhau, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau [5]

 Phương pháp điện di mao quản điện động học Mixen (MEKC)

+ Sử dụng phương pháp MEKC các tác giả Yu H.Lin, Shin S.Chou, Fuu Sheu and Yuan T.Shyu [24] đã xác định đồng thời 4 chất tạo ngọt (Dulcin, Aspartam, Saccharin, Acesulfam kali) và 9 chất bảo quản (axit sorbic, axit benzoic, Sodium dehydroacetate, methyl-, ethyl, propyl, isopropyl-, butyl-, and isobutyl-p-hydroxybenzoate) trong trái cây Với kết quả là: độ thu hồi cho tất cả các là gần 90%, LOD trong khoảng 10 đến 25µg/g Các chất tạo ngọt xác định được trong 28 mẫu thực là Aspartam (0,17-11,59 g/kg); Saccharin (0,09-5,64 g/kg), và các chất bảo quản: axit benzoic (0,02-1,72 g/kg) axit sorbic (0,27-1,15 g/kg) được tìm thấy trong 29 mẫu Phương pháp được tiến hành bằng cách sử dụng mao quản silica 57cm với hệ đệm bao gồm Sodium deoxycholate 0,05M, borate-phosphate 0,02M (pH 8,6) và 5% acetonitrile; bước sóng để xác định chất là 214nm

+ Cũng với phương pháp này, các tác giả Richard A Frazier , Elizabeth L Inns, Nicolo Dossi, Jennifer M Ames, Harry E Nursten [22] đã xác định các chất phụ gia Aspartam, Acesulfam kali, caffeine, brilliant blue FCF, sunset yellow FCF, axit benzoic, Saccharin, class IV caramel, ponceau 4R trong nước ngọt Với kết quả giới hạn định lượng (LOQ) là 0,01 mg/ml Nghiên cứu được tiến hành với các điều

kiện: dung dịch đệm cacbonat 20mM, pH 9,5 SDS 62 mM, mao quản có đường kính trong 50µm, chiều dài 48,5cm

 Phương pháp sắc kí điện di mao quản đẳng tốc độ (CITPC)

Phương pháp này được các tác giả Herrmannová M, Krivánková L, Bartos M

và Vytras K [16] nghiên cứu và phát triển để xác định đồng thời 8 chất tạo ngọt trong thực phẩm Với các điều kiện: mao quản có đường kính trong 0,8mm và chiều dài hiệu dụng là 90mm (được làm bằng copolime fluorinated ethylene-propylene), chất điện phân dẫn (LE) gồm 10 mM HCl + 14 mM Tris, pH 7,7 và chất điện phân cuối (TE) gồm 5 mM L-histidine + 5 mM Tris, pH 8,3 Khoảng tuyến tính cho tất cả các chất: Acesulfam kali, Saccharin, Aspartam, Cyclamat, Sorbitol, Mannitol, Lactitol và Xylitol là 0,024÷0,081 mM, độ lệch chuẩn tương đối (RSD)

từ 0,8 đến 2,8%, thời gian phân tích khoảng 20 phút

 Điện di mao quản vùng (CZE)

Phương pháp này đã được các tác giả Rainer Schuster and Angelika Gratzfeld-Husgen [21] sử dụng để tách riêng một số chất tạo ngọt phổ biến: Aspartam, cyclmate, Saccharin, Acesulfam kali cùng các chất bảo quản (prop-, ethyl, methyl), axit sorbic, axit benzoic Điều kiện điện di là: dung dịch đệm natri tetraborat 20 mM ở pH 9,4, thế 20kV, thực hiện điện di ở 25oC, độ lệch chuẩn tương đối về nồng độ là RSD < 0,15%, RSD về thời gian điện di từ 1 đến 7% Phương pháp này đã được tác giả Marko Stojkovic, Mai Thanh Đức, Peter C Hauser [18] phát triển cho việc xác định các chất tạo ngọt tổng hợp với detector độ dẫn không tiếp xúc (CE-C4D): Aspartam, Acesulfam kali, Cyclamat, Saccharin Phương pháp này đạt được hiệu quả tách tốt với thời gian là 190s, giới hạn phát hiện là 6,5 µmol.L-1; 5,0 µmol.L-1, 4,0 µmol.L-1, 3,8 µmol.L-1 lần lượt cho Aspartam, Cyclamat, Saccharin and Acesulfam kali; độ lệch chuẩn tương đối (RSD)

từ 2,1 đến 3,1% Với điều kiện điện di: dung dịch đệm Tris/Ches (400 mM/150mM), pH 9,1, mao quản sử dụng có ID là 10 µm, tổng chiều dài 40cm, chiều dài hiệu dụng là 32,5cm, thế 25kV

Cùng phương pháp này các tác giả Ana Beatriz Bergamo, José Alberto

Fracassi da Silva, Dosil Pereira de Jesus [10] đã nghiên cứu sử dụng phương pháp

CE-C4D để xác định đồng thời 4 chất Aspartam, Acesulfam kali, Cyclamat,

Saccharin trong nước ngọt phương pháp cho kết quả tách trong thời gian chưa đầy

6 phút, LOD cho Aspartam, Acesulfam kali, Cyclamat, Saccharin là 4,2 mg.L-1;

1,4mg.L-1; 2,5 mg.L-1; 1,5 mg.L-1; LOQ cho các chất trên tương ứng là 14,1 mg.L-1;

4,7 mg.L-1; 8,2 mg.L-1; 4,9 mg.L-1 Độ thu hồi từ 94 đến 108%, RSD từ 1,5 đến 6,5

% Điều kiện điện di: dung dịch đệm Tris/His (100 mM/10 mM), thế điện di 30kV,

mao quản đường kính trong 75 µm, tổng chiều dài và chiều dài hiệu dụng lần lượt là

70cm và 60cm, chiều cao bơm mẫu là 10cm, thời gian bơm mẫu: 30s

1.4 Phương pháp điện di mao quản

Điện di mao quản (CE) là một kỹ thuật tách các chất dựa trên cơ sở sự di

chuyển khác nhau của các phần tử chất (chủ yếu là các ion mang điện tích) trong

dung dịch chất điện giải (có chất đệm pH), dưới tác dụng của điện trường E nhất

định (do thế V đặt vào hai đầu mao quản sinh ra) và tính chất (đặc trưng) của

dòng điện di thẩm thấu (EOF) [3,4,5] trong sự phụ thuộc vào điện tích và kích

thước của chúng

Cũng như các phương pháp phân tích khác, phương pháp điện di mao quản

đã và đang phát triển ở mức độ cao và được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực của khoa

học, công nghệ, y dược và sinh học

1.4.1 Cấu tạo của một hệ CE cơ bản

Hình 1.1 Sơ đồ cấu tạo của một hệ thiết bị phân tích điện di mao quản

Formatted: Expanded by 0.2 pt

Hình 1.2 Mặt cắt ngang bề mặt mao quản

- Lớp điện kép trên thành mao quản và dòng điện di thẩm thấu:

Trong quá trình điện di, lớp điện kép sát thành mao quản và thế zeta của nó xuất hiện, chúng phụ thuộc vào bề mặt mao quản, thành phần, pH và lực ion của dung dịch pha động [3, 5]

Hình 1.3 Lớp điện tích kép trên bề mặt mao quản

Dòng EOF di chuyển từ cực dương sang cực âm Dưới tác dụng của điện trường, các cation di chuyển cùng chiều với dòng EOF do đó di chuyển nhanh hơn, ngược lại các anion di chuyển ngược chiều với dòng EOF do đó di chuyển chậm hơn còn các phần tử trung hòa không chịu tác động của điện trường nên di chuyển

cùng tốc độ với dòng EOF Như vậy, dòng EOF đóng vai trò quan trọng trong việc xác định thời gian tồn tại chất tan ở trong ống mao quản Do đó, phải lựa chọn các điều kiện điện di phù hợp nhất để có tốc độ dòng điện di phù hợp cho quá trình tách sắc ký hỗn hợp chất

 Dung dịch đệm điện di:

Dùng để tạo môi trường cho quá trình điện di xảy ra khi áp thế cao vào hai đầu mao quản Bản chất, thành phần, độ nhớt và giá trị pH của pha động điện di có ảnh hưởng trực tiếp lên bề mặt mao quản từ đó ảnh hưởng đến kết quả của quá trình điện di Trong quá trình điện di, hai đầu mao quản được được đặt trong hai bình chứa dung dịch đệm điện di

 Nguồn điện thế cao:

Thường dao động từ 5 đến 30 kV, dùng để áp vào hai đầu mao quản nhằm sinh ra điện trường lớn cho quá trình điện di xảy ra Để phân tích các cation thì cực

áp cực dương vào đầu bơm mẫu của mao quản và ngược lại để phân tích các anion thì áp cực âm vào đầu bơm mẫu của mao quản

 Detector: bộ phận phát hiện và ghi nhận tín hiệu của chất phân tích sau quá trình điện di

Tùy thuộc vào tính chất hóa học, hóa lý hay vật lý của các chất phân tích sẽ

có các loại detector tương ứng, bao gồm: hấp thụ phân tử (UV-VIS), huỳnh quang phân tử, phát xạ hoặc hấp thụ nguyên tử, khối phổ, điện thế (đo dòng, đo thế, độ dẫn), độ dẫn nhiệt, chỉ số chiết suất của chất [3]

Trong đề tài này, detector được sử dụng là detector đo độ dẫn không tiếp xúc

 Bộ phận điều khiển:

Thường là máy tính sử dụng phần mềm chuyên dụng phù hợp, để ghi nhận, hiển thị và xử lý kết quả phân tích Hiện nay, bộ phận này còn có thể thực hiện chức năng điều khiển tự động hoá quá trình phân tích từ khâu bơm mẫu đến khâu cho ra kết quả cuối cùng của quá trình phân tích điện di mao quản

1.4.2 Các kỹ thuật bơm mẫu trong CE

Mẫu phân tích được nạp vào mao quản bằng các kỹ thuật: thủy động lực học (dùng áp suất hoặc theo kiểu xiphông) và điện động học [3]

Hình 1.4 Các kĩ thuật bơm mẫu trong phương pháp điện di mao quản

+ Kỹ thuật bơm mẫu thủy động lực học dùng áp suất: Dùng một áp suất thích hợp để nén (đẩy) hoặc hút một lượng vào đầu cột mao quản trong một thời gian nhất định

+ Kỹ thuật bơm mẫu điện động học:

Nguyên tắc của kỹ thuật này là dùng lực của dòng điện với một điện thế cao 10kV) thích hợp để đưa mẫu phân tích vào mao quản trong một thời gian nhất định + Kỹ thuật bơm mẫu thủy động lực học kiểu xiphông: Dựa trên sự chênh lệch về chiều cao của hai đầu ống mao quản, chiều cao chênh lệch từ 10-30 cm trong khoảng thời gian từ vài giây đến vài phút tùy nồng độ chất phân tích

(5-1.4.3 Các đại lượng trong phương pháp điện di mao quản: độ điện di, tốc độ điện

di và thời gian diện di

 Tốc độ điện di: tốc độ di chuyển ( ) của các ion chất phân tích tỉ lệ thuận với

cường độ điện trường ( ):

Trong đó, µ là hệ số, phụ thuộc vào độ linh động điện di của hạt tích điện, gọi là độ điện di

 Độ điện di (µ):

Như vậy, độ linh động điện di ( ) tỉ lệ thuận với điện tích của ion chất

phân tích và tỉ lệ nghịch với độ nhớt (η) của dung dịch pha động điện di và độ lớn

(bán kính hiđrat ) của ion chất phân tích[3, 5]

 Thời gian điện di ( )

Tương tự với khái niệm thời gian lưu trong phương pháp săc kí, thời gian

điện di của chất tan (chất phân tích) là thời gian cần thiết để cho một chất tan di

chuyển từ lúc nó được nạp vào đầu ống mao quản cho đến vị trí phát hiện của

detector, được phát hiện ở vị trí pic cực đại [3] Thời gian di chuyển của các ion

được dùng để định tính các ion trong quá trình phân tích

Vì chất tan di chuyển trong dòng EOF nên thời gian điện di và các thông số thực

nghiệm khác có thể được dùng để tính toán độ điện di phải là giá trị tổng số của

các phần tử chất tan:

1.4.4 Phương pháp điện di mao quản với detector đo độ dẫn không tiếp xúc

(CE-C 4 D)

* Nguyên tắc của detetor đo độ dẫn là đo liên tục điện trở (trở kháng) của

dung dịch bằng một mạch điện sử dụng dòng xoay chiều (AC)

* Cấu tạo và nguyên lý hoạt động C 4 D:

Sơ đồ kết của cảm biến đo độ dẫn không tiếp xúc được mô tả như hình 1.5

Hình 1.5 Nguyên lý hoạt động của cảm biến đo độ dẫn không tiếp xúc

Comment [TA1]:

Hình 1.6 Sơ đồ biểu diễn cấu trúc (A) và mạch điện tương đương (B) của cảm

biến đo độ dẫn không tiếp xúc

Detector C4D gồm 2 điện cực hình ống và ở khoảng giữa 2 điện cực này được đặt một vách ngăn Faraday để tránh sự kết nối điện dung trực tiếp của hai điện cực

Trong detector C4D, hai điện cực hình ống tạo với dung dịch bên trong mao quản 2 tụ điện C như mô tả ở hình 1.6 Khoảng dung dịch nằm giữa 2 điện cực đóng vai trò như điện trở R Khi nguồn điện xoay chiều (V) với tần số (f) được áp vào điện cực thứ nhất, dòng điện sẽ đi qua khối dung dịch giữa hai điện cực và đi đến điện cực thứ 2 Tại điện cực thứ 2, tín hiệu phân tích thu được là do sự thay đổi độ dẫn của khối dung dịch nằm trong mao quản ở khoảng giữa hai điện cực Tín hiệu

đo được ở dạng cường độ dòng điện (I) Sau đó, tín hiệu đầu ra thu được sẽ được chuyển đổi và khuếch đại thành tín hiệu dạng vôn thế (xoay chiều), thông qua việc

sử dụng một điện trở khuếch đại Vôn thế xoay chiều sau đó được chuyển đổi thành vôn thế một chiều, lọc nhiễu và khuếch đại, sau cùng chuyển đổi thành tín hiệu số hóa trước khi được hiển thị và lưu trữ trên máy tính

Như vậy, detector đo độ dẫn không tiếp xúc ngoài ưu điểm là phân tích đa năng còn có ưu điểm là không nhất thiết phải có sự tiếp xúc trực tiếp của các điện cực với dung dịch đo nhờ lợi dụng tính chất kết nối tụ điện với dung dịch bên trong mao quản hoặc ống phản ứng Đây là một cách rất thông minh loại trừ ảnh hưởng của điện thế cao trong quá trình phân tách điện di đến hệ điện tử của detector và không làm nhiễm bẩn dung dịch phân tích [5,9]

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM2.1 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu

2.1.1 Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu của đề tài là nghiên cứu ứng dụng thiết bị điện di mao quản sử

dụng detector độ dẫn không tiếp xúc nhằm mục đích xác định đồng thời hàm

lượng một số chất tạo ngọt (Acesulfam kali, Aspartam, Cyclamat, Saccharin)

trong mẫu thực phẩm

2.1.2 Nội dung nghiên cứu

Các nội dung nghiên cứu nhằm đạt được mục tiêu đề ra gồm:

- Tổng quan tài liệu về các phương pháp xác định đồng thời các chất tạo ngọt

trong thực phẩm, đặc biệt là các phương pháp điện di mao quản

- Nghiên cứu, khảo sát các điều kiện tối ưu để xác định đồng thời hàm lượng

bốn chất tạo ngọt Acesulfam kali, Aspartam, Cyclamat, Saccharin bằng phương

pháp điện di mao quản sử dụng detector đo độ dẫn không tiếp xúc (CE – C4D)

- Đánh giá phương pháp thông qua việc khảo sát khoảng tuyến tính, xây

dựng đường chuẩn, đánh giá phương pháp phân tích, xác định giới hạn phát hiện

(LOD) và giới hạn định lượng (LOQ), độ chụm và độ đúng của phương pháp

- Áp dụng các điều kiện tối ưu nghiên cứu được để phân tích hàm lượng bốn

chất tạo ngọt trong một số mẫu thực tế

- Thực hiện phân tích đối chứng kết quả hàm lượng bốn chất tạo ngọt trong

một số mẫu thực tế bằng phương pháp tiêu chuẩn Sắc kí lỏng hiệu năng cao

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp xử lý mẫu sơ bộ

Trong phương pháp điện di mao quản các mẫu thường được xử khá đơn giản

 Đối với các mẫu lỏng: Lọc qua màng lọc, sau đó pha loãng với tỉ lệ thích

hợp rồi bơm vào mao quản

 Đối với các mẫu rắn: Đồng nhất mẫu, thêm nước cất đề ion, rung siêu âm

trong khoảng thời gian hợp lý sau đó lọc qua màng lọc rồi bơm vào mao quản

Formatted: Font: 6 pt

Formatted: Expanded by 0.2 pt

2.2.2 Phương pháp xử lý số liệu

- Tính toán kết quả bằng phần mềm microsoft excel

- Xây dựng đường chuẩn bằng phần mềm origin

- Tính diện tích pic, thời gian lưu, tín hiệu pic và đường nền bằng phần mềm

kèm theo thiết bị (eDAQ chart, Igor)

2.3 Trang thiết bị và hóa chất

2.3.1 Các dụng cụ và thiết bị được sử dụng

 Thiết bị:

- Máy điện di mao quản là hệ thiết bị tự chế, bán tự động được thiết kế và

chế tạo bởi nhóm nghiên cứu của chúng tôi cùng sự hợp tác với nhóm nghiên cứu

của GS Peter Hauser (khoa Hóa, trường đại học Basel, Thụy Sỹ), là thiết bị có

nguồn thế cao lên đến 25kV, sử dụng cảm biến đo độ dẫn không tiếp xúc (C4D)

Đây là thiết bị điện di mao quản dạng xách tay đầu tiên trên thế giới sử dụng nguồn

thế cao mini của hãng Spellman Detector đo độ dẫn không tiếp xúc kết nối theo

kiểu tụ điện (C4D) được thiết kế ở dạng thu nhỏ, với nguồn kích thích 200V, với hai

điện cực hình ống đồng trục có chiều dài 4mm và đường kính 400 µm đặt cách nhau

1mm Tấm chắn Faraday (nối đất) được sử dụng để ngăn cách hai điện cực Hiện

nay, hệ thiết bị này đang được triển khai ứng dụng, kiểm tra đánh giá và phát triển

hoàn thiện tại khoa Hóa, trường đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội Hình ảnh về

thiết bị được thể hiện như trong hình 2.1

Hình 2.1 Ảnh chụp hệ thiết bị CE-C 4 D triển khai tại Việt Nam

Formatted: Indent: First line: 0"

(1: Hộp thế an toàn, 2: Bộ điều khiển cao thế, 3: Cảm biến đo độ dẫn không tiếp xúc, 4: Ống dẫn dung dịch đệm, 5: Núm điều chỉnh , 6: Bộ

phận điều khiển, 7: Bình khí nén)

- Nguyên lý của hệ thống C4D bán tự động tại Việt Nam được mô tả trong hình 2.2

Hình 2.2 Sơ đồ kết nối hệ thống C 4 D phiên bản bán tự động tại Việt Nam

- Thiết bị lọc nước deion (Mỹ)

- Máy rung siêu âm, có gia nhiệt của hãng BRANSONIC 521

- Máy đo pH của hãng HANNA với điện cực thủy tinh và các dung dịch pH chuẩn để hiệu chỉnh điểm chuẩn của máy đo pH

- Cân phân tích của hãng S¢ientech (Mỹ), độ chính xác 0,1mg

- Tủ lạnh Sanaky VH-2899W dùng bảo quản mẫu

 Dụng cụ:

- Dụng cụ thủy tinh: bình định mức, pipet, cốc, ống nghiệm

- Pipet paster các loại: 20; 100; 200; 1000 µL

- Các lọ Falcon 10; 25 ml để đựng dung dịch chuẩn

- Đầu lọc có đường kính lỗ lọc 0,45 µm và các xylanh để lọc mẫu

- Mao quản sử dụng là mao quản silica, chiều dài 60cm, đường kính trong (ID) là 75µm

- Một số dụng cụ thông thường khác trong phòng thí nghiệm

2.3.2 Hóa chất

Tất cả các hóa chất sử dụng đều thuộc loại tinh khiết phân tích và được pha

chế bằng nước deion

2.3.2.1 Chất chuẩn

- Acesulfam kali (Fluka, hàm lượng >=99%)

- Aspartam (Sulpelco, hàm lượng >= 98%)

- Natri cyclamat (Sigma, hàm lượng >=99,0%)

- Saccharin (Sigma, hàm lượng >=99,0%)

2.3.2.2 Hóa chất dung môi

- L-Histidin (C6H9N3O2), (Fluka, hàm lượng 99,5%)

- Tris (hydroxymethyl) aminomethane) (Fluka, hàm lượng ≥ 99%)

- L- Arginine (C6H14N4O2) (Fluka, hàm lượng > 99,5%)

- MES (axit 2-morpholino ethanesunfonic)(Sigma, hàm lượng >=99,0%)

- CAPS (axit 3-( cyclohexylamino)-1-propansunfonic) (Sigma, hàm lượng

>=98,0%)

- CHES (axit 2 – (cyclohexylamino)-ethanesunfonic) (Sigma, hàm lượng

>=99,0%)

- Nước cất deion

2.3.2.3 Chuẩn bị các dung dịch hóa chất

* Pha các dung dịch chuẩn gốc

Cân chính xác 0,0250g (Aspartam, Acesulfam kali, Cyclamat, Saccharin) mỗi loại chuyển vào bình định mức 25,0ml, hòa tan bằng nước deion sau đó định mức tới vạch, đem rung siêu âm khoảng 10 phút thu được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 1000 ppm Dung dịch được bảo quản trong tủ lạnh với nhiệt độ khoảng