Trong phương phỏp điện di mao quản, pH và thành phần của dung dịch đệm điện di ảnh hưởng rất nhiều đến dũng điện di thẩm thấu (EOF) và quỏ trỡnh di chuyển của cỏc chất trong mao quản, từ đú ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng tỏch cỏc chất trong quỏ trỡnh phõn tớch. Do đú, việc khảo sỏt và lựa chọn điều kiện tối ưu cho cỏc thụng số này là rất quan trọng. Ngoài ra, cũn cần phải khảo sỏt cỏc yếu tố khỏc ảnh hưởng đến khả năng phõn tỏch, cường độ tớn hiệu như thời gian bơm mẫu, thế tỏch.
Việc khảo sỏt thành phần và pH của dung dịch đệm điện di được thực thực
hiện trờn cơ sở bốn hệ đệm điện di thụng dụng với phương phỏp CE-C4D, bao gồm:
Arg/Mes , Arg/CAPS, Tris/His và Tris/Ches. Trong đú, cỏc cỏc giỏ trị pH thay đổi từ 8,5 đến 9,7 bằng cỏch thay đổi tỷ lệ giữa cỏc thành phần đệm. Cỏc điều kiện khỏc được giữ cố định bao gồm:
- Thời gian bơm mẫu 15s, chiều cao bơm mẫu 10 cm, thế điện di + 15kV.
- Hỗn hợp mẫu chuẩn tương ứng với nồng độ Acesulfam kali 50 ppm,
30
*Khảo sỏt đệm Tris/Ches
Hệ đệm này được khảo sỏt trờn cơ sở giữ nguyờn nồng độ thành phần Tris 100 mM và thay đổi nồng độ thành phần Ches sao cho đạt cỏc giỏ trị pH tương ứng. Cỏc kết quả khảo sỏt được thể hiện trong bảng 3.1 và hỡnh 3.1
Bảng 3.1. Tỉ lệ thành phần đệm Tris/Ches và pH. Nồng độ TRIS (mM) Nồng độ CHES (mM) pH 100 40 9,1 100 30 9,2 100 20 9,4 100 10 9,6 500 400 300 200 100 0
Thời gian di chuyển (s) 100 mV pH = 9,6 pH = 9, 4 pH = 9,2 pH = 9,1 EOF
Asp Cyc Sac Ace-K
Hỡnh 3.1. Điện di đồ khảo sỏt ảnh hưởng của pH đối với sự phõn tỏch Acesulfam kali, Aspartam, Cyclamat, Saccharin với thành phần đệm Tris/Ches
Cú thể nhận thấy khi pH tăng thỡ thời gian phõn tớch cỏc chất tạo ngọt được lựa chọn giảm đi đồng thời độ phõn giải của cỏc chất cũng giảm đi. Điều này hoàn toàn phự hợp với lý thuyết vỡ khi pH tăng thỡ độ linh động điện di của dũng EOF tăng lờn lực kộo của dũng EOF với cỏc chất tạo ngọt cũng tăng lờn làm thời gian di chuyển của cỏc chất phõn tớch cũng giảm, đồng thời khi thời gian phõn tớch giảm thỡ cỏc chất phõn tớch cũng di chuyển gần nhau hơn và làm cho khả năng tỏch giảm. Ở
Cỏc cation cơ bản
31
giỏ trị pH = 9,1 và pH = 9,2 đều cho tớn hiệu chất phõn tớch, hiệu quả tỏch tốt, đường nền ổn định, nhưng ở pH = 9,2 cho thời gian phõn tớch ngắn hơn so với ở pH = 9,1. Ở cỏc giỏ trị pH = 9,4 và pH = 9,6 thỡ cho hiệu quả tỏch kộm và đường nền khụng ổn định. Nờn với thành phần đệm Tris/Ches thỡ kết quả phõn tớch tốt nhất ở pH = 9,2.
*Khảo sỏt đệm Tris/His
Hệ đệm này được khảo sỏt trờn cơ sở thay đổi nồng dộ của thành phần Tris và His sao cho đạt cỏc giỏ trị pH tương ứng. Cỏc kết quả khảo sỏt được thể hiện trong bảng 3.2 và hỡnh 3.2. Bảng 3.2. Tỉ lệ thành phần đệm Tis/ His và pH. Nồng độ TRIS (mM) Nồng độ HIS (mM) PH 80 15 9,0 100 10 9,2 100 8 9,4 120 8 9,6
Hỡnh 3.2. Điện di đồ khảo sỏt ảnh hưởng của pH đối với sự phõn tỏch Acesulfam kali, Aspartam, Cyclamat, Saccharin với thành phần đệm Tris/His
Tương tự với đệm Tris/Ches thỡ kết quả khảo sỏt cho thấy cũng cho thấy khi pH tăng thỡ thời gian phõn tớch và khả năng tỏch giảm. Tớn hiệu chất phõn tớch, hiệu
Cyc Ace-K EOF Asp Sac Cỏc cation cơ bản
32
quả tỏch tốt, đường nền ổn định, thời gian phõn tớch ngắn ở cỏc giỏ trị pH 9,2 và 9,4. Ở pH 9,6 thỡ độ phõn giải của Sac và Ace – K kộm, ở pH 9,0 thỡ đường nền khụng ổn định.
*Khảo sỏt đệm Arg/Mes
Hệ đệm này được khảo sỏt trờn cơ sở giữ nguyờn nồng độ thành phần Arg 20 mM và thay đổi nồng độ thành phần Mes sao cho đạt cỏc giỏ trị pH tương ứng. Cỏc kết quả khảo sỏt được thể hiện trong bảng 3.3 và hỡnh 3.3.
Bảng 3.3. Tỉ lệ thành phần đệm Arg/Mes và pH. Nồng độ Arg (mM) Nồng độ Mes (mM) PH 20 15 8,5 20 12 8,8 20 8 9,2 20 5 9,7 1000 800 600 400 200 0
EOF Asp Cyc Sac Ace-K
pH = 8,5 pH = 8,8 pH = 9,2 pH = 9,7
Thời gian di chuyển (s)
50mV (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hỡnh 3.3. Điện di đồ khảo sỏt ảnh hưởng của pH đối với sự phõn tỏch Acesulfam kali, Aspartam, Cyclamat, Saccharin với thành phần đệm Agr/Mes
Nhận thấy với thành phần đệm Arg/Mes thỡ cho tớn hiệu chất phõn tớch khụng tốt và thời gian phõn tớch lại quỏ dài và kết quả phõn tớch tốt nhất ở giỏ trị pH 8,8 và 9,2 cho đường nền ổn định hơn.
Cỏc cation cơ bản
33
*Khảo sỏt đệm Arg/CAPS
Hệ đệm này được khảo sỏt trờn cơ sở giữ nguyờn nồng độ thành phần CAPS 50 mM và thay đổi nồng độ thành phần CAPS sao cho đạt cỏc giỏ trị pH tương ứng. Cỏc kết quả khảo sỏt được thể hiện trong bảng 3.4 và hỡnh 3.4
Bảng 3.4. Tỉ lệ thành phần đệm Arg/CAPS và pH.
Nồng độ Arg (mM) Nồng độ CAPS (mM) PH
5 50 9,0
3 50 9,2
2 50 9,4
Hỡnh 3.4. Điện di đồ khảo sỏt ảnh hưởng của pH đối với sự phõn tỏch Acesulfam kali, Aspartam, Cyclamat, Saccharin với thành phần đệm Arg/CAPS
Kết quả cho thấy đối với thành phần đệm Arg/CAPS thỡ độ phõn giải kộm đồng thời đường nền khụng ổn định và kết quả phõn tớch tốt nhất là ở pH 9,2.
Để cú thể lựa chọn được hệ đệm tốt nhất, cỏc kết quả phõn tớch ở pH = 9,2 của tất cả cỏc hệ đệm khỏc nhau được trỡnh bày trong trong hỡnh 3.5.
EOF Asp Cyc Sac Ace-K Cỏc cation
cơ bản
Formatted: Font: 9 pt
Formatted: Line spacing: 1.5 lines
Formatted: Line spacing: 1.5 lines
Formatted: Line spacing: 1.5 lines
34 1000 800 600 400 200 0 Tris/His Arg/Mes Arg/CAPS Tris/Ches
Thời gian di chuyển (s)
AspCyc
SacAce-K
100 mV
Hỡnh 3.5. Điện di đồ so sỏnh cỏc thành phần đệm điện di ở pH = 9,2
Từ kết quả trờn cho thấy với hệ đệm Arg/CAPS thỡ độ phõn giải Saccharin và Acesulfam kali kộm, cũn với đệm điện di Arg/Mes thỡ tớn hiệu chất phõn tớch rất nhỏ đồng thời thời gian phõn tớch quỏ dài. Với đệm điện di Tris/His và Tris/Ches đều cú độ phõn giải tốt và thời gian phõn tớch ngắn, đường nền ổn định ở pH 9,2. Hệ đệm điện di Tris/Ches cho thời gian phõn tớch ngắn hơn (400 s) so với đệm điện di Tris/His thời gian phõn tớch lõu hơn (gần 500 s) nhưng do phũng thớ nghiệm sẵn cú cỏc thành phần đệm Tris và His cũn thành phần Ches khụng sẵn cú trong phũng thớ nghiệm và khan hiếm trờn thị trường Việt Nam, do đú hệ đệm Tris/His được lựa chọn là hệ đệm tối ưu cho kết quả phõn tớch tốt.
Hệ đệm Tris/His (100 mM/10 mM, pH = 9,2) cho kết quả phõn tớch tốt . Do đú chỳng tụi chọn đệm điện di tối ưu là: Tris/His (100 mM/10 mM), pH = 9,2.